A crescente expansão e urbanização da leishmaniose visceral no Brasil (MS, 2006) e no mundo (Desjeux, 2004) mostram o caráter emergente e re-emergente dessa doença e a complexidade relacionada ao seu controle. Considerando a grande dificuldade na manutenção das medidas de controle da LV seja em relação a identificação e combate vetorial bem como o controle e eliminação de cães soropositivos, tem-se estudado medidas alternativas que possam ser incorporadas ao clássico “tripé” de ações, vigente nos programas de controle da LV (Desjeux, 2004; MS, 2006). Dentre estas, o uso de inseticidas com ação residual de longa duração (coleiras impregnadas com piretróides) e estratégias buscando a imunoprofilaxia em cães, ganham importância pelo impacto que podem causar no ciclo de transmissão do parasito. Além disso, estas alternativas poderiam tornar desnecessária a eutanásia de cães tão questionada pela sociedade. Neste sentido, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC seguramente é a estratégia mais prática e efetiva para se reduzir a incidência tanto da LV canina e consequentemente humana, além de possibilitar num futuro próximo o desenvolvimento de uma vacina similar para uso em humanos que vivem em áreas de alta endemicidade (Abranches et al., 1991; Hommel et al., 1995; Gradoni, 2001; Mauel, 2002).
Vários grupos de pesquisa têm direcionado grandes esforços na busca de imunobiológicos que apresentem imunogenicidade favorável a proteção contra LVC e possam ser utilizados em ensaios pré clínicos e clínicos de fase I e II em testes vacinais. Nesse contexto, estudos em cães utilizando subunidades protéicas com antígenos recombinantes (vacinas de 2ª geração) têm mostrado resultados interessantes. Dessa forma, trabalhos realizados por Fujiwara et al. (2005) utilizando proteínas recombinantes obtidas de L. major (MAPS/TSA, LmSTI1, LeIF) demonstraram, após imunizações em cães, aumento na produção de anticorpos antígeno-específicos, com aumento na população de LT CD8+ circulantes. Outros trabalhos utilizando proteínas
recombinantes obtidas de L. infantum (H1, HASPB1 e MML; Moreno et al., 2007; HSP-70, KMP-11 e PFR-2; Carrillo et al., 2008) apresentaram resultados relevantes de imunogenicidade pós desafio com aumento na produção de anticorpos antígeno- específicos e na proliferação celular anti-Leishmania. Porém quando observado níveis de eficácia empregando-se o desafio experimental intravenoso, ambos os imunobiológicos não apresentaram resultados satisfatórios. Trabalhos mais recentes utilizando de proteína recombinante quimérica “Q” na ausência de adjuvantes (Carcelén
et al., 2009) ou associado a diferentes adjuvantes (MDP, Alum, ISCOMatrix) (Poot et al., 2009) também não demonstraram eficácia satisfatória após desafio com L. infantum.
De forma semelhante, diversos estudos têm buscado alternativas no desenvolvimento de vacinas de DNA (vacinas de 3ª geração) anti-LVC. Com esse propósito, Rafati et al. (2005) imunizaram cães utilizando de protocolo combinado de vacina DNA/proteína recombinante de cisteínas proteinases tipo I e II de L. infantum (CPA e CPB). Os animais foram acompanhados por 365 dias após desafio experimental intravenoso com L. infantum apresentando incremento na produção de anticorpos anti- Leishmania, da proliferação celular antígeno-específica e resultados parasitológicos satisfatórios (3/10 positivos). Recentemente, Rodríguez-Cortés et al. (2007b) utilizaram uma vacina de DNA expressando quatro proteínas de L. infantum (KMP-II, TRYP, LACK e GP63). Após acompanhamento de 390 dias os animais não apresentaram produção de anticorpos anti-Leishmania e a atividade linfoproliferativa foi observada apenas nos dois últimos meses do acompanhamento. Ao fim do trabalho não foi observada proteção nos animais vacinados. Outra vacina de DNA, expressando apenas a proteína LACK de L. infantum, foi avaliada por Ramos et al. (2008) sendo relatado após 290 dias do desafio experimental intravenoso, ausência de sinais clínicos sugestivos de LVC, baixos títulos de anticorpos anti-Leishmania, aumento na ativação de linfócitos T CD4+ e produção de citocinas Th1 (IFN-γ e IL-12). Entretanto, quando avaliada a carga parasitária no fígado, os grupos imunizados e não imunizados apresentaram parasitismo semelhante. Desta forma, estudos mais detalhados a respeito de vacinas de DNA ainda precisam ser conduzidos na busca de se obter um imunobiológico capaz de proteger cães contra a infecção por L. chagasi/L. infantum.
Recentemente, vacinas de 2ª geração compostas por proteínas “nativas” semi purificadas/purificadas e vacinas derivadas de antígenos totais (vacinas de 1ª geração) vem se destacando por apresentarem resultados de imunogenicidade e eficácia elevados. Neste contexto, o grupo francês liderado pelo Dr. Papierok, utilizando um imunobiológico composto por proteínas secretadas/excretadas de L. infantum (LiESAp), obteve proteção duradoura em cães após desafio experimental intravenoso (Lemesre et al., 2005). Posteriormente em área endêmica na França, foi realizado ensaio clínico vacinal de fase III com LiESAp obtendo-se resultados de eficácia de 92%, indicando este imunobiológico como um interessante candidato a vacina contra LVC (Lemesre et al., 2007).
No Brasil, duas vacinas contra LVC, Leishmune® (Fort Dodge Saúde Animal Ltda) e Leish-Tec® (Hertape Calier Saúde Animal S/A) se encontram disponíveis no mercado, ambas autorizadas pelo Ministério da Pecuária e Abastecimento (MAPA) apenas para uso veterinário individual e não autorizadas para uso em campnhas de saúde pública. A vacina Leishmune®, composta por antígeno FML purificado de L. donovani, vem sendo avaliada em ensaios clínicos de fase III desde 1996. Em um primeiro estudo na área endêmica de São Gonçalo do Amaranto-RN a vacina demonstrou 92% de proteção contra a LVC no grupo vacinado, o que correspondeu a 76% de eficácia vacinal (Da Silva et al., 2001). Em um segundo estudo de fase III, foi alcançado 95% de proteção e 80% de eficácia em cães vacinados com Leishmune® quando comparado ao grupo não vacinado (Borja-Cabrera et al., 2002). Mais recentemente, a vacina Leish-Tec® (composta pela proteína recombinante A2) foi submetida a ensaios pré clínicos de fase I e II em cães, em um acompanhamento de 365 dias sendo observado aumento na produção de anticorpos IgG anti-Leishmania e na produção de IFN-γ em CMSP de cães vacinados. Resultados parasitológicos revelaram que mais da metade dos cães vacinados foram identificados como positivos (4/7 cães foram positivos) em análise parasitológica de baixa sensibilidade (isolamento de medula óssea) (Fernandes et al., 2008). Apesar dos importantes resultados obtidos pela avaliação destas vacinas, o Ministério da Saúde ainda não preconiza seu uso como medida de controle e profilaxia para serem adotadas nos programas de controle oficial da LV no Brasil, pois considera que ainda não há evidências científicas sobre sua utilização (MS, 2005).
Nesse contexto, vacinas derivadas de antígenos totais de Leishmania ainda são bastante atrativas para uso como imunoprofiláticos contra LVC, pois apresentam baixo custo na produção, menor necessidade de manipulação e tratamento do produto final (Khamesipour et al., 2006), além de apresentarem resultados promissores para o controle da infecção (Mayrink et al., 1996; Lasri et al., 1999; Panaro et al., 2001; Araújo, 2006; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d; Araújo et al., 2008; Araújo et al., 2009). Dessa forma, após avaliação dos aspectos relacionados à inocuidade e imunogenicidade pós imunizações com a vacina LBSap, foi observado que esse imunobiológico além de não apresentar efeitos colaterais significativos induziu mecanismos imunes favoráveis à proteção contra LVC (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007). Assim, o presente trabalho teve como objetivo estender a avaliação de imunogenicidade através do estudo de mecanismos
relacionados à resposta imune humoral e celular bem como investigar a presença de sinais clínicos e do parasito e/ou de seu DNA na medula óssea, após o desafio experimental intradérmico com L. chagasi associado a extrato de glândula salivar de L. longipalpis, em um acompanhamento longitudinal de 435 dias pós desafio.
Nesse contexto, foi observado no presente estudo que em relação à resposta imune humoral, os animais imunizados com a vacina LBSap apresentaram aumento significativo (P<0,05) nos níveis de IgG total anti-Leishmania e suas respectivas subclasses (IgG1 e IgG2) antes e após desafio experimental. Estes resultados parecem indicar que níveis elevados de anticorpos anti-Leishmania induzidos pelo protocolo de imunização com a vacina LBSap (Giunchetti et al., 2007) se mantêm elevados 85 dias após a administração da terceira dose (Tempo Antes do Desafio - Tad) da vacina LBSap mostrando também uma forte reatividade sérica frente a infecção experimental intradérmica com L. chagasi. Resultados semelhantes foram observados por Molano et al. (2003) utilizando a vacina composta pela proteína multimérica Q associada ao BCG, mostrando que após o desafio experimental, cães vacinados apresentaram forte reatividade sérica com aumento na produção de IgG frente ao antígeno de L. chagasi. Recentemente, Fernandes et al. (2008) demonstraram em ensaio clínico de fase II que após desafio experimental intravenoso há um aumento na produção de IgG total e IgG2 em cães imunizados com a proteína recombinante A2 associada a saponina e aumento na subclasse IgG1 em animais não imunizados, sugerindo que essa subclasse de imunoglobulina estaria associada a um padrão de progressão clínica na LVC. Entretanto, nosso grupo de pesquisa estudando a história natural da LVC, relata que em cães assintomáticos a presença predominante de IgG1 estaria associada a uma menor frequência de intensidade parasitária em diversos tecidos (Reis et al., 2006a,c). Por outro lado, cães sintomáticos apresentariam elevada produção das imunoglobulinas IgG2, IgA, IgM e IgE (Reis et al., 2006a,c). De fato ainda é bastante controverso na literatura qual o provável padrão de produção de imunoglobulinas (IgG1 e IgG2) estaria ligado a um perfil de resistência ou susceptibilidade na LVC (Quinnell, et al., 2003; Day, 2007). No entanto, a elevada reatividade de IgG1 e IgG2, apresentando níveis acima do limiar de positividade em todo o período avaliado, parece indicar um perfil de resposta imune mista. Este padrão de resposta parece ser característico de vacinas de antígenos brutos como relatado em diferentes estudos (Fujiwara et al., 2003; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c, d; Araújo et al. 2009).
Buscando avaliar a resposta imune celular em cães vacinados com a vacina LBSap, foi proposto inicialmente a análise do leucograma. Foi observado que as populações de monócitos e linfócitos apresentaram maiores variações em relação às demais populações celulares. Nesse sentido, cães vacinados com a vacina LBSap apresentaram aumento significativo (P<0,05) nas populações de monócitos e linfócitos na maioria dos tempos analisados. Esses resultados reforçam a hipótese de que a vacina LBSap seja capaz de promover uma interação entre células da resposta imune inata e adaptativa mesmo após a infecção experimental (Giunchetti, 2007). Resultados diferentes foram observados por Moreno et al. (2007) que, avaliando o perfil hematológico em cães imunizados com diferentes proteínas recombinantes (H1, HASPB1+H1; MML), demonstraram redução significativa (P<0,05) na global de leucócitos e na população de linfócitos após desafio experimental intravenoso com L. infantum/L. chagasi. Reis et al. (2006b) observaram em cães naturalmente infectados por L. chagasi categorizados de acordo com a carga parasitária na medula óssea, que os animais apresentando alto parasitismo demonstravam diminuição significativa (P<0,05) nos valores globais de monócitos e linfócitos quando comparados ao grupo de cães com baixo parasitismo. Neste sentido, o aumento destas populações celulares em cães vacinados com a vacina LBSap poderia indicar um bom prognóstico, mesmo após desafio experimental intradérmico com L. chagasi
Considerando a relevância dos resultados do leucograma, a análise da resposta imune celular foi ampliada pelo estudo de leucócitos do sangue periférico empregando- se a técnica de imunofenotipagem por citometria de fluxo. Com essa metodologia foi possível observar quais modificações estariam ocorrendo em diversas populações celulares após o desafio experimental com L. chagasi nos diferentes grupos avaliados. É importante salientar que ainda são escassos na literatura trabalhos utilizando dessa abordagem metodológica, principalmente na avaliação de imunogenicidade vacinal e pós desafio (Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c; Giunchetti et al., 2008d; Borja-Cabrera et al., 2008; Ramos et al., 2008; Araújo et al., 2008; Araújo et al., 2009).
De forma interessante, a análise do perfil imunofenotípico de linfócitos T circulantes revelou no grupo de cães imunizados com a vacina LBSap aumento significativo (P<0,05) tanto na população de linfócitos T CD5+ quanto nas
subpopulações de linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ após o desafio experimental
intradémico com L. chagasi. Resultados contrários foram observados por Ramos et al. (2008) utilizando vacina de DNA para a proteína LACK, onde demonstraram que
mesmo após o desafio intravenoso com L. infantum o grupo de animais vacinados não apresentaram aumento nas populações de linfócitos T circulantes (CD5+, CD4+ e CD8+). Já Borja-Cabrera et al. (2008) utilizando a vacina Leishmune® em estudo de área endêmica, mostraram que após 18 meses da realização do protocolo vacinal os animais apresentaram aumento principalmente da subpopulação de linfócitos T CD8+ e ausência
de sinais clínicos aparentes da LVC. De fato, vários estudos utilizando animais naturalmente infectados mostram uma correlação entre aumento da população de linfócitos T CD5+ e das subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ com resistência frente a infecção por L. chagasi. (Pinelli et al., 1994a; Pinelli et al., 1994b; Pinelli, 1997; Reis, 2001; Reis et al., 2006c; Reis et al., 2009). Dessa forma, cães imunizados com a vacina LBSap apresentam um quadro imunofenotípico de linfócitos T circulantes compatível com um perfil de proteção contra infecção por Leishmania.
Resultados semelhantes aos observados com a população de linfócitos T circulantes foram demonstrados com a análise do perfil imunofenotípico de linfócitos B CD21+. Neste sentido, foi demonstrado aumento significativo (P<0,05) dessa população celular no grupo imunizado com a vacina LBSap após desafio experimental. De forma interessante, esse aumento ocorreu simultaneamente à grande produção de imunoglobulinas anti-Leishmania durante o acompanhamento longitudinal do grupo LBSap. Resultados semelhantes foram observados por Borja-Cabrera et al. (2008), onde cães imunizados com vacina Leishmune apresentaram aumento na população de
linfócitos B CD21+ em ensaio clínico de área endêmica. Na história natural da LVC,
Reis et al., (2006b) descreveram que a diminuição na população de linfócitos B CD21+
estaria relacionada ao aumento da carga parasitária na medula óssea, presença de sinais clínicos da doença e prognóstico de severidade na LVC. Assim, o aumento de linfócitos B CD21+, característico do grupo imunizado com a vacina LBSap, parece ser um biomarcador de resistência na LVC.
Com a finalidade de se estudar potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) além dos linfócitos B, bem como o perfil de ativação celular pós desafio na população de linfócitos totais, foi avaliado o número de monócitos CD14+ circulantes bem como a expressão de CD80, MHC-I e MHC-II em linfócitos. De forma interessante, foi observado aumento significativo (P<0,05) no número de monócitos CD14+ circulantes no grupo LBSap bem como aumento na expressão de CD80+ em linfócitos após o desafio experimental intradérmico com L. chagasi. Guerra et al. (2009) relataram em cães naturalmente infectados por L. chagasi com alta carga parasitária no
baço apresentavam diminuição de monócitos CD14+ circulantes. Neste sentido, é possível especular que o aumento desta população celular em cães do grupo LBSap
poderia indicar um fenótipo de resistência frente a infecção experimental com L. chagasi, aumentando a disponibilidade de células apresentadoras de antígenos no
sangue periférico, que poderiam atuar no controle de um eventual parasitismo tecidual. Além disto, análises adicionais de correlações foram efetuadas a fim de se compreender uma possível relação entre o perfil da expressão de marcadores de ativação em linfócitos com o perfil imunofenotípico de linfócitos T e o número de monócitos CD14+. Neste sentido, foi observada correlação positiva entre o número de linfócitos T (CD5+ e CD8+) circulantes e a expressão de MHC-II em linfócitos. Cobbold & Metcalfe, (1994) foram pioneiros nas investigações sobre a expressão da molécula de MHC-II em cães. Diferente de outras espécies, moléculas de MHC-II são expressas constitutivamente em linfócitos circulantes caninos. Dessa maneira, estes autores propuseram que a expressão aumentada de MHC-II em linfócitos caninos poderiam refletir eventos relacionados a apresentação antigênica e dessa forma desencadear eventos imunológicos associados a ativação celular (Cobbold & Metcalfe, 1994). Neste contexto, é possível especular que a vacina LBSap é capaz de induzir ativação em linfócitos T CD5+ e da subpopulação de linfócitos T CD8+ no período após o desafio experimental com L. chagasi. De forma interessante, cães imunizados com a vacina LBSap também apresentaram correlação positiva entre a população de monócitos CD14+ e a expressão de MHC-II em linfócitos, sugerindo que o aumento de potenciais APC estaria diretamente relacionado com o perfil de ativação linfocitária. Esses resultados reforçam a hipótese que cães imunizados com a vacina LBSap, apresentariam uma consistente e prolongada interação entre resposta imune inata e adaptativa, refletindo em uma maior habilidade na apresentação de antígenos e ativação celular. É importante salientar que ainda são escassos os relatos sobre potenciais APC e perfil de ativação linfocitária em ensaios clínicos vacinais na LVC (Araújo, 2006; Giunchetti, et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c).
A fim de se complementar os estudos relacionados ao perfil imunofenotípico avaliado no contexto ex vivo em células circulantes, foi realizada a análise da atividade linfoproliferativa in vitro nos diferentes grupos vacinais. Resultados interessantes foram obtidos com o grupo de cães imunizados com a vacina LBSap mostrando que, em ambos os tempos avaliados (90 Dpd e 435Dpd), houve aumento significativo (P<0,05) no índice de proliferação celular em CMSP quando utilizado como estímulo in vitro
antígeno solúvel vacinal (VSA). De forma semelhante, quando utilizado como estímulo antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA), os animais imunizados com a vacina LBSap apresentaram aumento significativo (P<0,05) em 435Dpd no índice de proliferação celular em CMSP. Esses resultados sugerem que a vacina LBSap é capaz de manter uma resposta imunológica Leishmania-específica forte e duradoura, reforçando a hipótese desse imunobiológico ser capaz de controlar uma provável infecção por L. chagasi. Estudos conduzidos por Lemesre et al. (2005) mostraram que o aumento do índice de proliferação celular está diretamente relacionado com aumento na produção de NO, IFN-γ e ausência de sinais clínicos da LVC em cães vacinados e desafiados intravenosamente com L. infantum. Resultados semelhantes foram observados por Rafati et al. (2005) demonstrando que após o desafio experimental, cães vacinados apresentam aumento no índice de proliferação celular in vitro associado a intradermorreação (IDR) positiva mesmo após onze meses do desafio experimental. Esses dados corroboram com outros estudos mostrando que cães naturalmente infectados e assintomáticos apresentam 98% de correlação entre IDR positiva e elevação nos índices de proliferação in vitro (Solano-Gallego et al., 2000). Dessa forma, a presença de atividade linfoproliferativa utilizando antígenos de Leishmania tem sido associada a um perfil de resposta imune relacionada à resistência na LVC, sendo característico de animais assintomáticos (Pinelli et al., 1994a, Pinelli et al., 1994b, Reis, 2001).
Além da avaliação da resposta linfoproliferativa, foi realizada a imunofenotipagem de CMSP após estímulo específico com VSA ou SLcA in vitro. Foi observado aumento significativo (P<0,05) da frequência de linfócitos T CD4+-SLcA específicos no grupo LBSap, 90 Dpd, indicando uma possível participação dessa população celular na resposta imune frente a antígenos do agente etiológico da LVC. De forma semelhante, Ramos et al. (2008) observaram que após cultivo in vitro de células do linfonodo apenas cães vacinados e assintomáticos, apresentavam aumento significativo (P<0,05) dessa subpopulação celular (LT CD4+) confirmando a participação fundamental dessas células na ativação e elaboração de uma resposta imune efetiva no controle do parasito. Além disso, estes autores observaram que após estímulo específico com antígenos de L. infantum, CMSP de animais vacinados demonstravam aumento na produção de IFN-γ. Araújo et al. (2009) avaliando vacina constituída de L. amazonensis associada ao BCG, demonstraram que cães imunizados apresentaram aumento na produção de IFN-γ intracitoplasmático em linfócitos T
(CD5+) derivados de CMSP após estímulo específico com antígeno de L. chagasi. Ao avaliarem as subpopulações celulares de LT, foi observado que este aumento na produção intracitoplasmática de IFN-γ estava diretamente associada à subpopulação de LT CD4+. Dessa forma, diferentes imunobiológicos compostos por antígenos brutos de Leishmania, tem demonstrado resposta imune favorável a proteção contra infecção por L. chagasi, apresentando como promissores candidatos à vacina contra LVC.
De forma a ampliar as investigações sobre a identificação do perfil imunofenotípico de células de memória antígeno-específicas, foi avaliado o perfil de ativação de linfócitos pela expressão de MHC-II e sua possível correlação com a frequência do fenótipo de CMSP submetidas à cultura com os diferentes antígenos. Neste sentido, foi observado aumento significativo (P<0,05) na expressão de MHC-II