Neste projeto foram estudados a imunogenicidade e eficácia da vacina LBSap em cães após desafio intradérmico com Leishmania (Leishmania) chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalis durante um período de acompanhamento de 435 dias. Após obtenção do conjunto de dados gerados com este trabalho propomos uma apresentação que facilitasse ao leitor a compreensão dos resultados de imunogenicidade e da investigação parasitológica e molecular na medula óssea. Inicialmente serão apresentados os dados referentes à reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, antes e após desafio com L. chagasi. Em seguida foi realizado o estudo de imunogenicidade da resposta imune celular no contexto ex vivo onde foi explorado primeiramente o dos animais Leucograma que nos forneceram um panorama geral da população de leucócitos totais (neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos). Em seguida os estão representados os dados de imunofenotipagem por citometria de fluxo de leucócitos circulantes que completam o detalhamento do estudo de imunogenicidade onde podemos verificar a flutuação da população de linfócitos T (CD5+) e de suas subpopulações (CD4+ e CD8+) além das células apresentadoras de antígenos (linfócitos B CD21+ e monócitos CD14+) ao longo do “follow up”. Ainda no contexto ex vivo foram estudadas algumas moléculas de ativação celular expressas na população de linfócitos totais (MHC-I, MHC-II e CD80). Análises de correlações também foram empregadas para elucidar e auxiliar o entendimento de funções imunológicas que possam estar sendo ativadas, amplificadas ou mesmo bloqueadas. Finalmente o estudo de imunogecidade é coroado pelos ensaios de linfoproliferação no contexto in vitro e do perfil imunofenotípico de linfócitos (CD5+, CD4+, CD8+, CD21+). Além disto, no contexto in vitro foi também estudado o perfil de ativação de linfócitos pela expressão de MHC-II+ e sua correlação com o perfil imunofenotípico de linfócitos T (CD5+, CD4+, CD8+) e linfócitos B (CD21+) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães controle, submetidos aos diferentes protocolos vacinais após desafio com L. chagasi. Encerramos nosso estudo com um panorama preliminar da eficácia vacinal da vacina LBSap por meio da avaliação clínica detalhada, do diagnóstico parasitológico da medula óssea através de isolamento em meio NNN/LIT, análise de esfregaço por aposição e do diagnóstico molecular pela PCR em cães controle, submetidos aos diferentes protocolos vacinais, após desafio com L. chagasi.
6.1 – Resposta Imune Humoral
6.1.1 - Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais, antes e após desafio com L. chagasi
A avaliação inicial da imunogenicidade em cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais e desafiados experimentalmente com L. chagasi e saliva de L. longipalpis contou com a análise comparativa da resposta imune humoral anti- Leishmania entre os grupos C, Sap, LB e LBSap, como representada pela Figura 1. A avaliação da reatividade de IgG total revelou aumento significativo (P<0,05) da média dos valores de densidade óptica do grupo LBSap, em Tad (0,250±0,066), 20Dpd (0,318±0,083), 90 Dpd (0,233±0,065) e 274Dpd (0,204±0,075) em relação aos grupos C em Tad (0,075±0,041), 20Dpd (0,126±0,054), 90Dpd (0,086±0,027) e 274Dpd (0,076±0,008), Sap em Tad (0,062±0,018), 20Dpd (0,150±0,079), 90 Dpd (0,084±0,032) e 274Dpd (0,071±0,020) e LB em Tad (0,095±0,026), 90Dpd (0,151±0,045) e 274Dpd (0,095±0,029). O grupo LB apresentou aumento significativo (P<0,05) da média dos valores de densidade óptica em 20Dpd (0,223±0,052) e 90Dpd (0,151±0,045) em relação aos grupos C em 20Dpd (0,126±0,054) e 90 Dpd (0,086±0,027), bem como em relação ao grupo Sap em 90 Dpd (0,084±0,032). O grupo LBSap apresentou valores médios das densidades ópticas (DO) acima do limiar de positividade em Tad, 20, 90 e 274Dpd, enquanto que o grupo LB este aumento foi observado em 20 e 90Dpd e nos grupos C e Sap apenas em 20Dpd.
De forma semelhante, o grupo LBSap apresentou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de densidade óptica, tanto para IgG1 como para IgG2 em Tad (IgG1: 0,182±0,019; IgG2: 0,236±0,071), 20Dpd (IgG1: 0,361±0,085; IgG2: 0,395±0,107), 90Dpd (IgG1: 0,191±0,039; IgG2: 0,286±0,072), 274Dpd (IgG1: 0,158±0,049; IgG2: 0,228±0,059) e 435Dpd (IgG1: 0,100±0,068) quando comparado aos grupos C em Tad (IgG1: 0,030±0,021; IgG2: 0,050±0,024), 20Dpd (IgG1: 0,057±0,065; IgG2: 0,175±0,080), 90Dpd (IgG1: 0,040±0,028; IgG2: 0,097±0,041) e 274Dpd (IgG1: 0,029±0,027; IgG2: 0,069±0,011); Sap em Tad (IgG1: 0,012±0,005; IgG2: 0,046±0,022), 20Dpd (IgG1: 0,037±0,019; IgG2: 0,220±0,119), 90Dpd (IgG1: 0,028±0,006; IgG2: 0,111±0,051), 274Dpd (IgG1: 0,033±0,027; IgG2: 0,079±0,030) e 435Dpd (IgG1: 0,023±0,006); LB em Tad (IgG1: 0,040±0,022; IgG2: 0,066±0,020),
20Dpd (IgG1: 0,140±0,032), 90Dpd (IgG1: 0,044±0,007; IgG2: 0,173±0,076) e 274Dpd (IgG1: 0,024±0,006; IgG2: 0,105±0,055). O grupo LB apresentou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de densidade óptica de IgG1 ou IgG2 nas avaliações: Tad (IgG1: 0,040±0,022) em relação ao grupo Sap (Tad-IgG1: 0,012±0,005); 20Dpd (IgG1: 0,140±0,032; IgG2: 0,303±0,070) em relação aos grupos C (20 Dpd- IgG1: 0,057±0,065; IgG2: 0,175±0,080) e Sap (20Dpd- IgG1: 0,037±0,019); e 90Dpd (IgG1: 0,044±0,007) em relação ao grupo Sap (IgG1: 0,028±0,006). Similarmente o grupo LBSap apresentou valores médios das densidades ópticas (DO) acima do limiar de positividade para IgG1 e IgG2 em Tad, 20, 90, 274 e 435Dpd, enquanto que este aumento no grupo LB foi observado em 20Dpd (IgG1 e IgG2), 90, 274 e 435Dpd (IgG2) e no grupo C em 20 e 435Dpd (IgG2) e Sap em 20 e 90Dpd (IgG2).
Figura 1: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais
após desafio intradérmico com L. chagasi: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). O painel superior ilustra a reatividade de IgG total anti-Leishmania. Painéis inferiores ilustram a reatividade de IgG1 (painel esquerdo) e IgG2 (painel direito) anti-Leishmania. O eixo x ilustra os tempos avaliados: Tad = tempo antes do desafio, 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio. O eixo y representa os valores médios de absorbância pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:80 e antígeno solúvel de L. chagasi [cut-off = 0,11 (IgG total); 0,08 (IgG1); 0,10 (IgG2)]. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sap, LB, respectivamente.
6.2 – Resposta Imune Celular
6.2.1 – Leucograma de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais, antes e após desafio com L. chagasi
A avaliação inicial da resposta celular nos diferentes grupos de cães foi realizada a partir da análise do leucograma. Os valores absolutos das populações de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, monócitos bem como da global de leucócitos encontram-se na Tabela 4.
Foi avaliada inicialmente a média global de leucócitos, sendo observada aumento significativo (P<0,05) em 435Dpd no grupo LBSap (10050±1482) em relação ao grupo Sap (7700±1456). A análise subsequente focalizou na contagem diferencial da série branca, obtendo-se os valores absolutos de linfócitos (Tabela 4; Figura 2 painel superior), que revelou aumento significativo (P<0,05) em 274Dpd nos grupos LB (3457±659) e LBSap (3613±602) em relação ao grupo Sap (2438±423). Além disto, quando foi avaliado o número de monócitos, observou-se redução significativa (P<0,05) em Tad nos grupos Sap (249±62) e LBSap (249±105) quando comparado ao grupo LB (413±99). Em 20Dpd, o grupo LBSap (428±64) apresentou aumento significativo (P<0,05) da população de monócitos em relação aos grupos C (237±118) e Sap (209±39). Por outro lado, foi observado em 274Dpd redução significativa (P<0,05) de monócitos nos grupos Sap (307±55) e LBSap (337±116) quando comparados ao grupo C (503±81). Ainda em relação a população de monócitos, em 435Dpd, houve redução significativa (P<0,05) no grupo Sap (192±39) em relação aos grupos C (295±35), e aumento desta população celular nos grupos LB (449±130) e LBSap (414±90) quando comparado ao grupo Sap (192±39).
Leucograma Tad C Sap LB LBSap Global de leucócitos 9000±628 8320±1728 9460±1350 7880±1514 Neutrófilos totais 4968±1177 4882±1032 5532±1541 4840±1088 Eosinófilos 576±280 489±214 678±324 501±387 Linfócitos 3112±699 2631±763 2856±536 2311±590 Monócitos 344±110 249±62 413±99b 249±105c 20Dpd Global de leucócitos 8300±1319 8880±1645 8920±1502 9660±2306 Neutrófilos totais 4492±938 4835±1340 5277±1190 5085±1291 Eosinófilos 649±476 828±169 602±299 443±374 Linfócitos 2887±682 2951±679 2655±670 3748±1104 Monócitos 237±118 209±39 312±132 428±64a,b 90Dpd Global de leucócitos 10920±1720 9480±1946 10780±1047 9360±1801 Neutrófilos totais 6626±1265 5876±1017 6649±869 4995±1400 Eosinófilos 727±472 650±319 864±446 712±452 Linfócitos 3070±696 2601±790 2928±1144 3281±979 Monócitos 416±167 353±186 243±30 372±154 274Dpd Global de leucócitos 12360±2559 11040±1558 11000±1143 12240±1090 Neutrófilos totais 7311±1524 7608±1223 6644±637 7574±1043 Eosinófilos 923±409 687±229 520±165 716±342 Linfócitos 3116±996 2438±423 3457±659b 3613±602b Monócitos 503±81 307±55a 380±100 337±116a 435Dpd Global de leucócitos 8280±832 7700±1456 8975±888, 10050±1482b Neutrófilos totais 5196±1297 5164±615 6168±748 5914±630 Eosinófilos 553±329 359±240 340±219 638±461 Linfócitos 1999±519 1985±842 2019±272 3170±1505 Monócitos 295±35 192±39a 449±130b 414±90b
Valores absolutos (média±desvio padrão) do leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais desafiados com L. chagasi: controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap). Tad = antes do desafio, 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós-desaio. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas
6.2.3 – Análise do número de linfócitos sanguíneos e do perfil fenotípico de células T (CD5+, CD4+ e CD8+) e células B (CD21+) circulantes no sangue periférico de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais, antes e após desafio com L. chagasi
O estudo do perfil celular contou com a avaliação inicial do número absoluto de linfócitos do sangue periférico (Tabela 4). O perfil imunofenotípico destas células foi avaliado buscando-se ampliar o estudo de possíveis flutuações nas populações e subpopulações linfocitárias após o desafio intradérmico com L. chagasi e irá nos informar o potencial imunogênico da vacina LBSap (Figura 2). Neste contexto, foi observado aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto de linfócitos T (LT) CD5+ (Figura 2, painel intermediário) em 274Dpd nos grupos LB (2591±535) e LBSap (2493±550) em relação ao grupo Sap (1689±169). Foi observada dimunição significativa (P<0,05) em Tad do valor médio absoluto da subpopulação de LT CD8+ do grupo LBSap (543±119) em relação ao grupo LB (790±139). De forma interessante, logo após o desafio experimental intradérmico foram observadas alterações nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ apenas no grupo LBSap (Figura 2, painel inferior). Neste sentido, em 20Dpd, foi observado no grupo LBSap aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto das subpopulações de LT CD4+ (1185±148) e LT CD8+ (964±230) quando comparado aos grupos C (LT CD4+: 870±107; LT CD8+: 481±198) e LB (LT CD8+: 627±195). De forma interessante, quando avaliada a subpopulação de LT CD8+, esse aumento (P<0,05) se manteve no
tempo 90 Dpd no grupo LBSap (1042±216) em relação aos grupos C (584±89) e LB (551±81). Ao se avaliar o período de 274Dpd, foi constatado no grupo LBSap aumento significativo (P<0,05) de LT CD4+ (1353±120) em relação ao grupo Sap (1008±206).
De forma semelhante aos resultados descritos para as populações de LT, foi observada diminuição significativa (P<0,05) do valor absoluto médio de linfócitos B (LB) CD21+ (Figura 2, painel intermediário) em Tad no grupo Sap (382±187) em
relação ao grupo C (727±183). Já em 20Dpd e 274Dpd foi observado aumento significativo (P<0,05) dessa população celular no grupo LBSap (20Dpd: 1046±273; 274Dpd: 794±150) em relação aos grupos C (20Dpd: 579±259; 274Dpd: 407±175), Sap (20Dpd: 367±25; 274Dpd: 294±128) e LB (20Dpd: 348±107; 274Dpd: 528±149). Ainda em relação a população de LB CD21+, foi também observado em 90 Dpd
grupos LB (541±54) e LBSap (829±263) em relação ao grupo Sap (337±110). Além disto, neste mesmo tempo, foi observada diminução significa (P<0,05) de LB CD21+ do grupo Sap (337±110) em relação ao grupo C (604±167).
Figura 2: Perfil celular de linfócitos circulantes em cães submetidos a diferentes protocolos vacinais após desafio
com L. chagasi. Painel superior ilustra a média e desvio padrão do número de linfócitos circulantes dos grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). O painel Inferior ilustra o fenótipo de linfócitos circulantes dos grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). O eixo x ilustra os tempos avaliados: Tad = tempo antes do desafio, 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio. O eixo y representa os valores médios e desvio padrão do número de linfócitos (painel superior) e do número médio de linfócitos T (LT) CD5+, CD4+, CD8+ e de linfócitos B (LB) CD21+ (painéis intermediário e inferior). As diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sap e LB, respectivamente.
6.2.4 – Avaliação do número de monócitos CD14+ sanguíneos, do perfil de ativação linfocitária pela expressão de CD80, MHC-I e MHC-II de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais, antes e após desafio com L. chagasi
A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APCs) em ensaios vacinais de fase I e II pretende contribuir com o entendimento dos eventos que estariam relacionados à ativação da imunidade adaptativa. Assim, nesta parte dos resultados serão descritos potenciais APCs, representadas aqui por monócitos CD14+. Além disto, buscando-se ampliar as investigações em marcadores para ativação linfocitária em cães, avaliamos a expressão de linfócitos CD80+, linfócitos MHC-I+ e
linfócitos MHC-II+ por canal médio de fluorescência. Estas abordagens estão descritas na Figura 3.
O estudo de monócitos CD14+ revelou aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto em 20Dpd no grupo LBSap (26±5) quando comparado ao grupo C (14±4) e Sap (10±2). De forma similar, foi observado no grupo LB aumento significativo (P<0,05) do número desta população celular em 435Dpd (38±14) em relação aos grupos C (18±1) e Sap (11±4). Neste mesmo tempo, foi observado ainda diminuição significativa (P<0,05) de monócitos CD14+ no grupo Sap (11±4) em relação aos grupos C (18±1) e LBSap (25±5).
O estudo da expressão de linfócitos CD80+ evidenciou aumento significativo (P<0,05) em 90Dpd no grupo LBSap (239±12) em relação aos grupos C (220±7) e Sap (216±11). Além disto, em 274Dpd foi observado aumento significativo (P<0,05) da expressão deste marcador no grupo Sap (220±2) em relação ao grupo C (208±5). Por outro lado, foi observado diminuição significativa nos grupos LB (209±6) e LBSap (205±6) em relação ao grupo Sap (220±2) nesse mesmo tempo. Já em 435Dpd o grupo LBSap (248±16) mostrou aumento significativo (P<0,05) na expressão deste marcador celular em relação ao grupo C (227±8).
Quando avaliado a expressão de linfócitos MHC-I+ foi observada diminuição significativa (P<0,05) em Tad no grupo LB (257±21) em relação ao grupo Sap (347±85). No entanto, a análise da expressão de linfócitos MHC-II+ não revelou diferença significativa entre os grupos avaliados.
Considerando que foram observadas alterações no perfil de marcadores de ativação linfocitários, tornou-se importante avaliar a correlação entre estes parâmetros e
as populações e subpopulações de linfócitos bem como as populações de APCs. Com este tipo de análise poderia ser possível identificar padrões de associação entre o número de linfócitos (LT CD4+ ou CD8+) ou de monócitos (CD14+) com marcadores de ativação linfocitária (MHC-I ou MHC-II). De forma interessante, foram observadas correlações apenas no grupo LBSap quando utilizados o marcador de ativação linfocitário MHC-II. Neste sentido, o grupo LBSap apresentou correlação positiva (P=0,0377/r=0,4674) entre o número de LT CD5+ e a expressão de linfócitos MHC-II+ (Figura 3, painel superior direito). De forma semelhante, observamos correlação positiva (P=0,0231/r=0,4933) entre o número de LT CD8+ e a expressão de linfócitos MHC-II+ nesse mesmo grupo (LBSap; Figura 3, painel inferior direito).
Considerando ainda que importantes alterações no número de monócitos CD14+
foram identificadas no grupo LBSap, e que os eventos de apresentação antigênica poderiam estar diretamente relacionados a ativação linfocitária, foi proposta correlação entre estes parâmetros. Desta forma, foi observada correlação positiva (P=0,0082/r=0,5482) entre o número de monócitos CD14+ e a expressão de linfócitos MHC-II+ no grupo LBSap (Figura 3, painel intermediário direito).
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Figura 3: Potenciais células apresentadoras de antígenos [monócitos (MON) CD14+] e perfil de ativação linfocitária em cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, antes e
após desafio com L. chagasi: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). No painel esquerdo estão apresentados os valores médios do número de monócitos CD14+ circulantes e da expressão de moléculas de ativação em linfócitos (CD80, MHC-I e MHC-II) por
canal médio de fluorescência (CMF), nos diferentes tempos avaliados: Tad = tempo antes do desafio; 20Dpd = 20 dias pós desafio; 90Dpd = 90 dias pós desafio; 274Dpd = 274 dias pós desafio; 435Dpd = 435 dias pós desafio. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sap e LB, respectivamente. O painel direito ilustra correlação de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap entre o número de LT CD5+, LT CD8+ e monócitos CD14+ e a expressão de linfócitos MHC-II+,
6.2.5 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de linfócitos (CD5+, CD4+, CD8+, CD21+) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais após desafio com L. chagasi
Buscando-se avaliar a capacidade linfoproliferativa antígeno específica nos diferentes grupos vacinais após o desafio experimental intradérmico, foram analisados dois tempos, 90 Dpd e 435Dpd, empregando-se dois estímulos antigênicos in vitro, entre os quais, antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) (Figuras 4 e 5). Esta abordagem possibilitou a análise da indução de memória imunológica frente ao componente vacinal (VSA), bem como a avaliação da resposta antígeno-específica frente a antígenos relacionados ao agente etiológico da LV (SLcA).
Em 90 Dpd, foi observado aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação no grupo LBSap utilizando o estímulo de VSA (6,0±1,4) em relação aos grupos C (2,3±0,5) e Sap (1,6±0,2) (Figura 4). De forma semelhante, em 435 Dpd foi observado aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação no grupo LBSap utilizando o estímulo de VSA (5,4±0,6) em relação ao grupo C (3,1±0,6) (Figura 5, painel superior esquerdo). Além disto, quando avaliada a resposta linfoproliferativa em relação ao estímulo antígeno-específico (SLcA) do agente etiológico da LV, foi observado no grupo LBSap (6,2±0,9) aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação em relação aos grupos C (3,6±0,5) e Sap (2,4±0,4) (Figura 5, painel superior direito). É importante ressaltar que a resposta linfoproliferativa não específica obtida pelo estímulo mitogênico com PHA resultou em valores médios entre 14 e 40 de índice de proliferação em 90 Dpd e valores médios entre 7 e 34 de índice de proliferação em 435 Dpd, confirmando a viabilidade da suspensão celular nos diferentes grupos avaliados.
Uma segunda abordagem da análise in vitro buscou avaliar o perfil imunofenotípico de linfócitos pela comparação das culturas controle não estimuladas (CC) em relação às culturas estimuladas (VSA ou SLcA) em 90Dpd (Figura 4, painéis intermediário e inferior) e 435Dpd (Figura 5, painéis intermediário e inferior). A avaliação da frequência de linfócitos T CD4+ revelou aumento significativo (P<0,05) nas culturas
estimuladas com SLcA do grupo LBSap (48,1±0,7) em relação às culturas controle não estimuladas (CC; 45,1±1,0). Em 435Dpd não foram observadas diferenças na avaliação do perfil imunofenotípico de linfócitos.
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Figura 4: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtido pela análise em contagens por
minutos (CPM) em linfócitos de cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, 90 dias pós desafio (90Dpd) intradérmico com L. chagasi. Os resultados são apresentados considerando estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito). Os painéis intermediário e inferior ilustram o perfil imunofenotípico de PBMC, 90 dias pós desafio (90Dpd), nos diferentes grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). Os resultados estão expressos como média e desvio padrão das frequências de linfócitos T (LT) CD5+, CD4+, CD8+ e de linfócitos B (LB) CD21+ em culturas controles não estimuladas (CC) e em
culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA. As linhas conectando os diferentes grupos na proliferação celular (painel superior) ou fenótipo de CC e CE indicam diferenças significativas (P<0,05).
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Figura 5: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtido pela análise em contagens por
minutos (CPM) em linfócitos de cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, 435 dias pós desafio (435Dpd) intradérmico com L. chagasi. Os resultados são apresentados considerando estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) ou estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito). Os painéis intermediário e inferior ilustram o perfil imunofenotípico de PBMC, 435 dias pós desafio (435Dpd), nos diferentes grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). Os resultados estão expressos como média e desvio padrão das frequências de linfócitos T (LT) CD5+, CD4+, CD8+ e de linfócitos B (LB) CD21+ em culturas
controles não estimuladas (CC) e em culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA. As linhas conectando os diferentes grupos na proliferação celular (painel superior) ou fenótipo de CC e CE indicam diferenças significativas (P<0,05).
6.2.6 – Avaliação do perfil de ativação de linfócitos pela expressão de MHC-II+ e sua correlação com o perfil imunofenotípico de linfócitos T (CD5+, CD4+, CD8+) e linfócitos B (CD21+) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães imunizados com a vacina LBSap e seus constituintes vacinais, após desafio com L. chagasi
A avaliação do perfil de ativação de linfócitos pela expressão de MHC-II+ e sua
possível correlação com a frequência do fenótipo de células submetidas à cultura apresenta-se como uma importante estratégia para se ampliar as investigações sobre a identificação do perfil imunofenotípico de células antígeno-específicas de memória, com potencial de imunoproteção frente a infecção com L. chagasi.
Neste sentido, esta análise revelou que o grupo LBSap apresentou em 90 Dpd, aumento significativo (P<0,05) na expressão de linfócitos MHC-II+ nas culturas estimuladas com SLcA (574,0±6,0) em relação às culturas controle não estimuladas (CC; 549,0±2,3) (Figura 6; painel superior direito). Já em 435 Dpd, o grupo LBSap apresentou diminuição significativa (P<0,05) na expressão de linfócitos MHC-II+ nas culturas controles e estimuladas com VSA (567±46,2) em relação ao grupo Sap (678,7±15,8) submetidas ao mesmo estímulo (VSA) (Figura 7; painel superior esquerdo).
Quando analisadas correlações entre o perfil de ativação de linfócitos cultivados in vitro pela expressão de MHC-II+ e a frequência do fenótipo de células submetidas à cultura, apenas o grupo LBSap apresentou correlações significativas (Figuras 6 e 7; painéis intermediários e inferiores). Desta forma, em 90 Dpd foi observada correlação positiva entre o percentual de LT CD4+ com a expressão de linfócitos MHC-II+ quando utilizados os estímulos VSA (P=0,0177/r=0,8410) e SLcA (P=0,0329/r=0,7941) (Figura 6; painel inferior esquerdo e direito). De forma similar, em 435 Dpd o percentual de LT CD4+ apresentou correlação positiva com a expressão de linfócitos MHC-II+ quando empregado estímulo VSA (P=0,0059/r=0,8619). Por outro lado, neste mesmo tempo, foi observada correlação negativa entre o percentual de LT CD8+ e a expressão de linfócitos MHC-II+ quando empregado o estímulo VSA (P=0,0373/r=-0,7361) (Figura 7; painel inferior esquerdo).
Figura 6: Análise da expressão de linfócitos MHC-II+ e da correlação entre perfil de ativação linfocitária (MHC-II) e as
frequências de linfócitos T (LT) CD5+, CD4+, CD8+ e linfócitos B (LB) CD21+ considerando resultados obtidos em 90Dpd (90
dias pós desafio), após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) em cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, antes e após desafio com L. chagasi. No painel superior estão representados os valores médios da expressão de moléculas de ativação celular em linfócitos (MHC-II) pela análise comparativa de culturas controles não estimuladas (CC) e culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA, nos diferentes grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). A linha conectando o grupo LBSap (painel superior direito) representa diferença significativa (P<0,05) da expressão de moléculas de ativação celular em linfócitos (MHC-II) entre CC e CE. Os painéis intermediário e inferior ilustram as correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap entre a expressão de linfócitos MHC-II+ e o fenótipo de linfócitos T
(CD5+, CD4+, CD8+) ou B (CD21+) do grupo de cães submetidos a imunização com vacina de L. braziliensis associada à
Figura 7: Análise da expressão de linfócitos MHC-II+ e da correlação entre perfil de ativação linfocitária (MHC-II) e as
frequências de linfócitos T (LT) CD5+, CD4+, CD8+ e linfócitos B (LB) CD21+ considerando resultados obtidos em 435Dpd (435
dias pós desafio), após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel direito) em cães submetidos aos diferentes protocolos vacinais, antes e após desafio com L. chagasi. No painel superior estão representados os valores médios da expressão de moléculas de ativação celular em linfócitos (MHC-II) pela análise comparativa de culturas controles não estimuladas (CC) e culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA, nos diferentes grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). A letra b indicada no grupo LBSap (painel superior direito) representa diferença significativa (P<0,05) da expressão de moléculas de ativação celular em linfócitos (MHC-II) entre CC e CE em relação ao grupo Sap. Os painéis intermediário e inferior ilustram as correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap entre a expressão de linfócitos MHC-II+ e o fenótipo de
linfócitos T (CD5+, CD4+, CD8+) ou B (CD21+) do grupo de cães submetidos a imunização com vacina de L. braziliensis associada