Distribuição da frequência dos SNPs DHPS165 e DHPS171

As distribuições de frequências dos SNPs DHPS165 e DHPS171, encontradas na população de isolados de P. jirovecii neste estudo, a partir de amostras recolhidas num período de tempo entre 2001 e 2012, demonstraram uma frequência de 90% para as formas alélicas DHPS165A e DHPS171C e de 10% para as variações mutantes

DHPS165G e DHPS171T. Em termos genotípicos, verificou-se que 89% dos isolados

contraste com os restantes que apresentavam genótipos mutantes ou mistos, sendo, portanto, a frequência de detecção de polimorfismos nas posições nucleotídicas 165 e 171 do gene DHPS de 11%. Esta frequência é relativamente semelhante à frequência de genótipos mutantes em DHPS, encontrada no estudo prévio (13%), realizado em isolados obtidos entre 1995 e 2011; sendo ligeiramente superior à frequência (entre 3% a 9%) detectada em estudos realizados em Portugal em isolados obtidos entre 1997 e 2007 (Costa et al. 2005; Esteves et al. 2008, 2010a, 2010b). No entanto, ainda é consideravelmente inferior à frequência (28%) obtida no primeiro estudo sobre o gene DHPS realizado em Portugal, para um período de tempo anterior, com mais de 10 anos de diferença, entre 1994 e 2001 (Costa et al. 2003). Em Espanha, um estudo de 2010 aponta para a mesma tendência. Alvarez-Martínez et al. (2010), no período de tempo entre os anos de 1989 e 1995, verificaram uma frequência de genótipos mutantes de 33% e, entre 2001 e 2004 constataram uma diminuição bastante acentuada (cerca de 80%), para uma frequência de genótipos mutantes estimada de 6%.

Por comparação com os resultados obtidos na Península Ibérica, verifica-se igualmente um declínio acentuado da prevalência de genótipos mutantes (DHPS165G-DHPS171T) noutros países Europeus. Em França, os primeiros estudos efectuados, verificaram uma frequência de genótipos mutantes entre 36 e 40%, para o período entre 1993 e 1998 (Santos et al. 1999; Nahimana et al. 2003); uma diminuição para 17% foi constatada para o período de tempo seguinte, entre 1998 e 2001 (Latouche

et al. 2003); e um último estudo publicado, referente a um período mais recente, entre

2007 e 2010, indicou uma frequência de genótipos mutantes em DHPS, de aproximadamente 3% (Le Gal et al. 2012). Em Itália, Visconti et al. (2001) indicaram uma frequência para genótipos mutantes em DHPS de 35% (1992-1997); uma frequência de 8-9% foi verificada entre 1994 e 2004 (Ma et al. 2002; Valerio et al. 2007); e um estudo publicado recentemente, não identificou isolados mutantes para DHPS, nas regiões nucleotídicas 165 e 171, entre isolados recolhidos a partir de amostras de secreções pulmonares entre 2006 e 2010 (Dimonte et al. 2012).

O Gráfico 4 ilustra a frequência de genótipos mutantes em DHPS obtidas ao longo dos anos nos quatro países Europeus referidos anteriormente.

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

40% _{Portugal Espanha França Itália}

O declínio da frequência de mutações em DHPS é claramente evidente pela análise do Gráfico 4, e muito provavelmente a diminuição na frequência de mutações estará relacionada com o período de estudo em causa. De facto, foi sugerido por alguns autores que, muito provavelmente, o decréscimo da prevalência de mutações em DHPS em isolados de P. jirovecii estudados em Portugal, e na Europa, esteja relacionado com a implementação da terapia HAART em 1996, e com a diminuição gradual verificada na utilização da profilaxia anti-PPc, com fármacos da família das sulfas (Ma et al. 2002; Costa et al. 2005; Esteves et al. 2008, 2010a, 2010b; Alvarez-Martínez et al. 2010; Matos & Esteves et al. 2010a; Dimonte et al. 2012). Torna-se evidente que, apesar das mutações no gene DHPS serem relativamente frequentes após a implementação da HAART, estas foram mais comuns no período precedido por esta terapia combinada (Alvarez-Martínez et al.2010). Porém, tratando-se de mutações potencialmente associadas com fenómenos de resistência às sulfas, a frequência de 11% detectada em Portugal (e a de 13% detectada no estudo prévio), pode ser um dado preocupante indicando que estes SNPs devem ser alvo de estudo e vigilância em trabalhos futuros.

Se abrangermos esta análise para outros países, verifica-se uma variação na ocorrência de tais genótipos mutantes, com frequências superiores às encontradas na Gráfico 4. Frequência (em %) dos genótipos mutantes de DHPS para as posições nucleotídicas 165 e 171, em população de isolados de P. jirovecii analisadas em Portugal, Espanha, França e Itália e diferentes períodos de tempo. Informação retirada de: a. Costa et al. 2003; b. Esteves et al. 2010a; c.Costa et al. 2005; d. Esteves et al. 2008; e. Esteves et al. 2010b; f. Presente estudo; g. Alvarez-Martínez et al. 2010; h. Nahimana et al. 2003; i. Santos et al. 1999; j. Latouche et al. 2003; k. Le Gal et al. 2012; l. Visconti et

Europa. Nos E.U.A. este facto é bastante evidente, onde a distribuição de frequência para o genótipo mutante em questão, variou num intervalo de 35-81% entre o período de 1976 e 2002 (Kazanjian et al. 1998, 2000, 2004; Ma et al. 1999; Beard et al. 2000; Huang et al. 2000; Crothers et al. 2005; Matos & Esteves et al. 2010a). No período de tempo entre 1976 e 1997 foi constatada uma frequência de 35% (Kazanjian et al. 1998) e no período mais recente, entre 1997 e 2002 uma frequência de 81% foi verificada (Crothers et al. 2005).

Apesar de existir um provável padrão temporal de distribuição para a prevalência de mutações em DHPS, principalmente nas posições nucleotídicas 165 e 171, em Portugal e na maioria dos países Europeus, para outras regiões geográficas, como nos E.U.A., isto não é tão evidente, uma vez que a frequência de genótipos mutantes continua a ser muito elevada. Estes dados sugerem que, também, é muito provável, existir uma variação geográfica para os genótipos mutantes de DHPS, muito possivelmente devido a factores epidemiológicos intrínsecos que influenciam a circulação e transmissão de diferentes genótipos, como o uso diferenciado de fármacos da família das sulfas, que nos E.U.A. é muito mais frequente, o que pode conduzir a uma pressão selectiva maior sobre este gene (Visconti et al. 2001; Hauser et al. 2010; Matos & Esteves et al. 2010a; Dimonte et al. 2012).

4.4. Diversidade genotípica nos isolados de P. jirovecii encontrada através