Dois minutos a 50ºC de Ácido acético 5% (bloqueia a reação).

3.4- Sequenciamento (Método Sanger)

O sequenciamento direto dos fragmentos da PCR foi realizado em amostras representativas de DNA de padrões diferentes de migração pela técnica SSCP em gel de poliacrilamida 20% (PhastSystem - GE). Os exons 18 e 19 do gene

EGFR foram sequenciados diretamente, sem a triagem pela técnica PCR-SSCP.

Após a purificação da PCR com o Kit GFX PCR DNA and gel band purification Kit - (GE Healthcare), foi feita a quantificação do produto da PCR purificada em gel de agarose 1,5%, aplicando-se 2μl do Low DNA Mass Ladder (Fermentas, Life Sciences) mais 2μl do azul de bromofenol (MERCK) no primeiro poço. Nos demais poços foram aplicados, 2μl das amostras com 2μl do azul de bromofenol (MERCK). A eletroforese foi realizada em aproximadamente 100ml de tampão TEB a 90 volts por 20 minutos.

Tendo como resultado a quantificação de cada banda em ng/μl, foi calculada a reação de sequenciamento usando-se 30ng da PCR purificada, 1μl do iniciador na concentração de 1,6pmol, 1µl do tampão, 1μl de BigDye (BigDye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 3.0 with AmpliTaq DNA Polymerase, FS- Applied Biosystems) que contém: dNTPs, ddNTPs, AmpliTaq DNA

polimerase, MgCl2, tampão Tris-HCl) e quantidade necessária de água para

completar 10μl. Os primers utilizados foram os mesmos da reação de PCR, diferindo apenas na concentração (1,6pmol).

A reação de sequenciamento consistiu de um ciclo de 96ºC por 10 segundos; 25 ciclos de 96ºC por 20 segundos; 63ºC por 20 segundos; 60ºC por 4 minutos; o último ciclo foi prolongado por 10 minutos no aparelho termociclador de temperatura PTC-100 (MJ - RESEARCH).

Ao final dos ciclos, a reação de sequenciamento foi purificada com etanol 100% e 70%.

O sequenciamento foi realizado em sequenciador automatizado ABI PRISM modelo 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Os fragmentos marcados com fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e à medida que são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda que são detectados por um fotomultiplicador. Em seguida essa informação é transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma.

Cada eletroferograma foi comparado com as sequências depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), admitindo-se concordância de no mínimo 95% para confirmação da especificidade da sequência.

3.5- Clonagem

As amostras que tiveram alterações, ou melhor, mutações do tipo frameshift no sequenciamento, com exceção da mutação pontual, foram clonadas com o Kit p-Gem Easy System II (Promega) para análise confirmatória.

O Kit pGEM-T-easy (Promega) contém um plasmídeo linear que possui uma desoxitimidina (T) em cada uma de suas extremidades 3’ e permite a inserção direta de produtos de PCR adenilados, pela enzima T4 DNA ligase.

O primeiro dia foi denominado de ligação, a mistura de: 1,5 a 3µl da PCR (dependendo da banda) mais 5µl do tampão de ligação para a enzima T4 DNA ligase (2X concentrada) mais 1µl do vetor (plasmídeo) mais 1µl da enzima T4 ligase (6U) e água para completar o volume total de 10µl foi incubada por uma hora a temperatura ambiente ou “overnight” a 4ºC.

O segundo dia, chamado de transformação, as células competentes de

Escherichia coli DH5 (Promega) estocadas a -80°C foram descongeladas e foi

adicionado 5µl do produto de ligação, homogeneizou-se gentilmente e a mistura foi mantida por 30 minutos no gelo.

Em seguida, estas misturas foram incubadas a 42ºC em Banho Maria por 1 minuto e 30 segundos (choque térmico), e foram transferidas novamente para o gelo e incubadas por 2 minutos.

Novamente no fluxo laminar, foi adicionado 800µl do meio SOC (é usado em biologia molecular para o cultivo de cepas recombinantes de E. coli) ou LB (Luria Bertani) no tubo contendo as células transformadas com as reações de ligação. As novas misturas foram mantidas sob agitação a 350rpm (rotações por minuto) no shaker a 37ºC por 1 hora.

Meia hora antes de retirada da amostra do shaker, foi colocado na placa Petri contendo meio LB sólido suplementado com 10µl do antibiótico ampicilina a 100mg/ml-1, 35µl de X-gal (50mg) e 20µl de IPTG (0,5M) que são meios seletivos. Essa placa ficou em repouso, por no mínimo 30 minutos, antes de plaquear a amostra.

A amostra foi retirada do shaker e centrifugada por 1 minuto a 8.000rpm. No fluxo laminar, 600µl do sobrenadante foi descartado. O pellet foi suspenso no volume restante e 120µl do pellet foi plaqueado na placa de Petri com meio LB sólido tratado com ampicilina e meios seletivos: X-gal e IPTG.

A placa foi colocada na estufa a 37ºC overnight.

Na manhã seguinte a placa foi retirada, embrulhada em filme plástico e levada à geladeira. O processo de seleção das colônias foi realizado no final da tarde.

Antes da seleção das colônias, uma placa cell star (Greiner Bio-One-U- shape, with LID, plate 96 well, sterile), foi separada contendo 120µl do meio LB líquido com ampicilina em cada poço [exemplo: 20ml de LB + 20µl de ampicilina (concentração de 50mg/ml)].

Na placa de Petri, cresceram colônias brancas e azuis, a seleção das colônias foi realizada com a ajuda de um palito de dente, somente as colônias brancas (com possíveis genes recombinantes ou clones positivos) foram selecionadas e colocadas nos devidos poços da placa cell star. Para cada colônia/um poço da placa, até completar os 96 poços.

A placa cell star foi tampada e vedada com filme plástico e levada ao shaker a uma rotação de 130rpm a 37ºC overnight.

No dia seguinte, foi realizada a PCR dos 96 poços com os iniciadores dos plasmídeos M13 ou T7 e SP6, na concentração de 5pmol e 10pmol, respectivamente.

O produto da PCR foi corrido em gel de agarose 2%. Foram escolhidas as amostras que apresentaram uma banda diferente no gel e a Reação de Sequenciamento foi realizada, utilizando-se os iniciadores do plasmídeo a 1,6pmol, com temperatura de anelamento do plasmídeo a 54ºC, por 25 ciclos.

O sequenciamento foi realizado utilizando-se o método de didesoxinucleotídeo marcado com fluoróforo. O sequenciador automático ABI PRISM modelo 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante.

A placa cell star foi guardada para possíveis repetições das PCRs, em freezer -80ºC. Foi adicionado 40µl de glicerol a 70% em cada poço a fim de preservar o plasmídeo.

3.6- Técnica de Imunoistoquímica (IH)

A análise da expressão das proteínas EGFR e K-Ras foram realizadas pela técnica IH, método indireto, em cortes de tecidos tumorais retirados do bloco de parafina, após o diagnóstico informado pela anatomia patológica.

Os tumores emblocados em parafina tiveram seus cortes histológicos feitos em micrótomo a uma espessura de três micrômetros e colocados em banho-maria a 42oC. A seleção dos cortes em suspensão no banho-maria se fez com lâminas histológicas silanizadas.

Essas lâminas silanizadas com o tecido aderido foram levadas para estufa (60ºC) por no mínimo 1 hora (de 1 a 2 horas), antes de começar a desparafinização.

Para a desparafinização e reidratação dos cortes, as lâminas foram imersas em xilol, a 60oC por 30 segundos, posteriormente imergidas novamente em xilol a temperatura ambiente (2 vezes) e em álcool absoluto (3 vezes), por último em álcool 80% e álcool 50%.

Finalmente, fez-se a lavagem em água corrente por 5 minutos. Após a lavagem, o bloqueio da peroxidase endógena foi feita trocando-se a água oxigenada - H2O2 - 10%de 3 em3 minutos.

Novamente, fez-se uma lavagem em água corrente por 5 minutos e procedeu-se da seguinte forma: