EXPRESSÃO Quimioterapia p OR IC95% R N(%) NR N(%) EGFR + 7(36,8) 12(63,2) 0,890 0,91 0,26-3,25 - 8(34,8) 15(65,2) 1,00 K-Ras + 10(35,7) 18(64,3) 0,554 1,44 0,43-4,82 - 8(44,4) 10(55,1) 1,00
NR- não respondeu; R- respondeu ; N (%); (§)- probabilidade bilateral do Teste Exato de Fisher; OR- razão de chance não ajustado; IC95%- Intervalo de confiança de 95%
A ilustração 5 mostra a análise da sobrevida dos pacientes que responderam e não responderam à QTX.
A mediana do tempo de sobrevida do grupo que respondeu à QTX foi 16,61 meses [IC95%: 10,33-22,89] e do grupo que não respondeu à QTX foi de 9,40 meses [IC95%: 7,18-11,63] (p=0,050 - Log Rank Test).
Ilustração 5- Análise da sobrevida dos pacientes que responderam e não
A ilustração 6 mostra a análise da sobrevida dos pacientes com mutação no gene EGFR.
A mediana do tempo de sobrevida do grupo que apresentava mutação no gene EGFR19-21 foi 37,76 meses [IC95%: indefinido] e do grupo que não tinha a mutação foi de 10,26 meses [IC95%: 6,81-13,72] (p=0,008 - Log Rank Test).
Ilustração 6- Análise da sobrevida dos pacientes com mutações no gene EGFR19 e
21.
Pela análise multivariada por regressão de COX, estudamos um modelo introduzindo duas variáveis preditoras (resposta à QTX e presença de mutações nos genes EGFR19/21). Permaneceu no modelo somente a variável preditora “presença de mutações no gene EGFR19/21”. Os resultados mostram que o Risco Relativo de
morte antecipada é maior nos pacientes que não apresentam as mutações no gene
EGFR19-21 [Risco Relativo=9,13 (IC95%: 1,25-6,91); p=0,029].
4.3- Perfil dos pacientes com mutações no gene EGFR
O quadro 4 detalha o perfil dos pacientes com mutações no gene EGFR. Nota-se um predomínio no sexo feminino, todos tinham tipo histológico adenocarcinoma, a maioria não fumantes, com estádio avançado e deleção no exon 19 (E746-A750).
Quadro 4- Perfil dos pacientes com mutação no gene EGFR
P a c ie nt e s S e x o Ida de His to logia Taba gis mo E s tadio E x on M ut a ç ões
ABR* Feminino 58 Adenocarcinoma NF IV 21 L858R JMO Feminino 72 Adenocarcinoma Ex IV 19 E746-A750 APTCS Feminino 71 Adenocarcinoma NF IIIb 21 L858R OAG* Feminino 65 Adenocarcinoma NF IV 19 E746-A750 LMO Masculino 46 Adenocarcinoma Ex IV 19 E746-S752InsV JT* Masculino 67 Adenocarcinoma NF IV 19 E746-A750
NF- Não fumante. Ex- Ex-fumante; *pacientes que tomaram cloridrato de erlotinib; L (leucina); R (arginina); E (ácido glutâmico); A (alanina); S (serina); V (valina).
O eletroferograma abaixo mostra a deleção no exon 19 (del E746_A750), nota-se a sobreposição das bases (picos duplos), resultando em um eletroferograma com alteração do quadro de leitura. Para confirmar tal resultado, clonamos para ter a certeza das deleções das bases nos resíduos 746 a 750 (Ilustração 7).
Ilustração 7- Eletroferograma mostrando deleções no exon 19 do gene EGFR.
Sequenciamento pelo método de Sanger.
A ilustração 8, mostra uma mutação de ponto em heterozigose no exon 21, troca da base TG (CTG para CGG, levando à substituição do aminoácido leucina por arginina-L858R).
Ilustração 8- Eletroferograma mostrando mutação de ponto no exon 21, troca da
base TG (CTG para CGG, levando à substituição do aminoácido leucina por arginina-L858R). Sequenciamento pelo Método de Sanger.
Dos 6 pacientes com mutações no gene EGFR, apenas três tomaram o inibidor de tirosina quinase (150mg de cloridrato de erlotinib/dia). Uma paciente sobreviveu 2 anos a partir da data do diagnóstico e tomou 1 ano e 2 meses do medicamento após tratamento com QTX citotóxica. O segundo paciente sobreviveu 2 anos e nove meses e tomou 1 ano e 7 meses do cloridrato de erlotinib. A última paciente diagnosticada em junho de 2011 tem doença estável até o momento e vem fazendo o uso do inibidor de tirosina quinase desde dezembro de 2012 (2 anos e 6 meses).
4.4- Perfil do paciente com mutação no gene K-Ras
O único paciente que apresentou mutação no gene K-Ras era do sexo feminino, fumante, com tipo histológico adenocarcinoma e com mutação de ponto em heterozigose, no códon 12 (uma transversão de GT (GGT para TGT), como mostra o eletroferograma 9.
Ilustração 9- Eletroferograma mostrando mutação de ponto no códon 12 do gene K-Ras em heterozigose G para T (GGT para TGT).
DISCUSSÃO
O prognóstico sombrio do câncer de pulmão é explicado pela associação de uma série de fatores. Além de ter um processo complexo de carcinogênese, o carcinoma brônquico é uma doença oligossintomática na maior parte de sua existência epouco valor se dá quando há sintomatologia clínica, tanto pelo médico como pelo paciente, resultando quase sempre em doença metastática no momento do diagnóstico, como os 66% observados neste estudo, por não haver uma rotina de procedimentos eficiente para o diagnóstico precoce (Bayman et al., 2014, MCWilliams et al., 2009; Molina et al., 2008; Yasumoto et al., 2009). Este fato tem um enorme impacto sobre o prognóstico, porque somente a minoria dos pacientes tem indicação de tratamento cirúrgico que, ainda hoje, é o único método com potencial de cura. A maior parte dos pacientes é direcionada apenas para o tratamento agressivo da quimioterapia e/ou radioterapia, mas com resultados desanimadores (Baleeiro et al., 2008; Yasumoto et al., 2009), com sobrevida média de 8 a 12 meses nos estadios avançados (Yamashita et al., 2013; Jemal et al., 2010; Stewart et al., 2010).
Frente ao problema do diagnóstico tardio, que é uma questão mundial e mais relevante no Brasil do que nos países desenvolvidos, é imprescindível avançar no conhecimento dos processos moleculares para enfrentar esse desafio. Nosso estudo é uma continuação de projetos anteriores, que têm como objetivo aprimorar a assistência à uma população atendida no ambulatório de Oncopneumologia do Hospital de Clínicas da Unicamp, através do estudo das mutações nos genes EGFR e K-Ras e suas expressões proteicas, correlacionando os achados com aspectos clínicos e terapêuticos, visando melhorar a qualidade de vida associada ao aumento da sobrevida, além de otimizar custos.
No Brasil não havia nenhum estudo publicado sobre a frequência de mutações no gene EGFR até 2011. Em 2012, Bacchi et al., publicaram uma frequência de 30,4% e Melo et al., em 2015, observaram uma frequência de 21,6%. Carneiro et al, encontraram uma frequência de 4,5% em uma população mineira de Belo Horizonte, um pouco menor que nosso estudo 7% (IC 95%: 3,7% a 12,7%) (Carneiro et al., 2014).
A alta frequência encontrada por Bacchi e Melo, provavelmente decorre da população analisada, desviada para coortes conhecidas por abrigar maior número de mutações no EGFR, como mulheres, não fumantes e tipo histológico adenocarcinoma.
No nosso estudo, bem como nos estudos de Carneiro et al., 2014, foram incluídos todos os tipos histológicos de CPNPC e com uma distribuição típica do sudeste brasileiro (a maioria homens, fumantes ou ex- fumantes com alta carga tabágica ou fumo de corda e tipo histológico epidermóide). Os resultados destes trabalhos podem refletir a frequência de uma mutação no gene EGFR em CPNPC no estado de São Paulo e no sudeste do Brasil. As características epidemiológicas desta mutação em outras áreas do Brasil, como no Norte e Nordeste, onde prevalece a ascendência de índios e africanos, podem ser significativamente diferentes.
A frequência da mutação no gene EGFR entre os Asiáticos (Japoneses) foi de aproximadamente 30% (Shi et al., 2014; Kawaguchi et al., 2010) comparado com aproximadamente 20% na população americana e espanhola (D’ Angelo et al., 2011; Rossel et al., 2009). Os estudos de Dogan e colaboradores encontraram frequências um pouco diferentes: 27 a 60% em Asiáticos, 8-15% nos Europeus Ocidentais e de 12-16% nos Americanos (Dogan et al., 2012; Sequist et al., 2007; Riely et al., 2006). A frequência da nossa população foi de 7%, semelhante à encontrada em uma população da Noruega de 7,5% (Helland et al., 2011) e próxima à Alemã, de 9,8% (Gahr et al., 2013).
Nossa discussão a partir desse momento sobre as mutações do gene
EGFR será feita a partir dos 50 pacientes, sendo 25 com adenocarcinoma,
que finalizaram os 4 ciclos de QTX citotóxica. Foi possível avaliar 44 pacientes em relação à mutação no gene K-Ras.
Cabe lembrar que, inicialmente, foram excluídos 101 casos (46 epidermóides, 36 adenocarcinomas e 19 não pequenas células), sendo que em 84 casos não foi possível fazer quimioterapia, devido ao baixo performance status, fato que corrobora com o estadio avançado dos nossos pacientes. Inicialmente, 24 casos foram identificados apenas como carcinoma não pequenas células e essa
dificuldade em definir o tipo histológico pode indicar um comportamento biológico mais agressivo, tanto que apenas um paciente tinha performance status para realizar o tratamento quimioterápico. Por outro lado, do grupo de 129 pacientes com CPNPC, nove apresentavam mutação no gene EGFR e, destes, seis estavam no grupo de 50 pacientes que tinham performance status para QTX, podendo sugerir que essa mutação, ou outra relacionada, poderia indicar um comportamento menos agressivo.
Observamos a frequência de 12% (6/50) de mutações no EGFR, sendo todos no grupo dos adenocarcinomas, o que corresponde a 24% (6/25) se considerarmos apenas este tipo histológico, dados semelhantes aos encontrados por Melo et al., 2015.
Com relação às mutações no gene EGFR e aspectos clínicos, nosso estudo observou correlação com o tipo histológico adenocarcinoma e não tabagistas (p=0,022 e 0,024 respectivamente). Os estudos de Deng, Li e Vaguliene também mostraram essas mesmas associações, reforçando os achados de que essas mutações acometem com maior frequência esse tipo histológico e não tabagistas. A maioria destes estudos observou a associação da mutação no EGFR com sexo feminino, o que não foi observado por nós (Deng et al., 2014; Li et al., 2013; Vaguliene et al., 2012).
No Brasil, os dados publicados apresentam uma ampla variação da frequência de mutações do gene K-Ras no câncer de pulmão. Bacchi et al., 2012 observaram uma frequência de 14,6%, Carneiro et al., 2014 e Melo et al., 2015 encontraram uma frequência de 8,0% e 26,4%, respectivamente. No nosso estudo esta frequência foi de apenas 2,3% (1/44).
Essa variação da frequência da mutação do gene K-Ras também é comum em outras populações. Na população espanhola a frequência variou entre 12 e 41,9% (Borrás et al., 2012; Lozano et al., 2011), mas foi semelhante nos estudos conduzidos na América Latina e Grécia, respectivamente, 16,6% e 18,5% (Arrieta et al., 2012; Trigka et al., 2013). Taxas menores foram encontradas na população asiática, variando de 2,8% a 10,6% entre os chineses (Li et al., 2013; Lu et al., 2012) e abaixo de 7% no Japão (Fukuyama et al., 1997).
Provavelmente, essa variação na frequência decorre das características da população estudada, tais como etnia, tipo histológico predominante e hábito tabágico.
Segundo os estudos de Lewandowska e colaboradores, as mutações no gene K-Ras foram encontradas em cerca de 30% dos casos de carcinoma não pequenas células e relacionados como biomarcador de pior prognóstico (Lewandowska et al., 2013).
Os dados da literatura não permitem estabelecer uma correlação entre a mutação e expressão da proteína e, portanto, entre os resultados obtidos pela biologia molecular e pela técnica de imunoistoquímica (Nelson et al., 1999; Moldvay et al., 2000).
Assim como Li e colaboradores, não observamos nenhuma associação entre a presença de mutações no gene K-Ras e os aspectos demográficos (sexo, etnia) ou clínicos (tipo histológico, estadiamento, ECOG e hábito tabágico). Deng e colaboradores observaram uma correlação positiva em fumantes (p=0,01) (Deng et al., 2014), diferente dos estudos de Kim e colaboradores que não observaram diferença significativa entre fumantes e não fumantes (p=0,435) (Kim et al., 2013).
Em relação às expressões proteicas nos indivíduos que receberam quimioterapia citotóxica, foram analisados 42 pacientes para o EGFR e 46 para o K-Ras e a expressão foi positiva em 45,2% e 60,9%, respectivamente.
A proteína EGFR é expressa na mucosa brônquica normal, apenas pelas células basais aderidas à lâmina basal. A área de expressão é ampliada para toda a mucosa durante o processo de carcinogênese (Hirsch et al., 2003), sendo acompanhada por aumento na intensidade de expressão (Kurie et al., 1996; Piythilake et al., 2002).
Neste estudo a frequência da expressão de EGFR foi inferior à encontrada em uma população japonesa (59,6%) (Azuma et al., 2012), provavelmente, devido às características da amostra, porque no estudo japonês há predomínio de pacientes com o tipo histológico adenocarcinoma, não fumantes e do sexo feminino.
Por outro lado, Hirsch e colaboradores observaram que a proteína EGFR está frequentemente superexpressa em pacientes com carcinoma epidermóide, entre os quais foi encontrado em cerca de 80% dos casos, quando comparado com adenocarcinoma (35-60%) e carcinoma de grandes células (20-60%) (Hirsch et al., 2003). De forma semelhante, no nosso estudo a expressão positiva de EGFR foi maior no grupo histológico ‘não adenocarcinoma’ (epidermóide e não pequenas células) quando comparada aos adenocarcinomas, respectivamente, 56,5% (13/23) e 31,6% (6/19), mas sem significância estatística (p=0,106). Segundo o estudo de Hirsch e colaboradores, todas essas análises e interpretações dependem da escolha da técnica adequada para a análise, tal como IH, Western Blot, Enzima Imunoensaio -ELISA e Real Time. Deve-se salientar que utilizamos a mesma metodologia do estudo de Hirsch e cols.
Atualmente há anticorpos específicos para a detecção das mutações no gene EGFR exon 19 (deleção E746-A750) e mutação pontual no exon 21 (L858R) (Kozu et al., 2011; Yu et al., 2009). Os dados de Yu et al., 2009 mostraram sensibilidade de 92% e 99% de especificidade com esta técnica quando comparado com o sequenciamento direto. Muitos autores acreditam que essa técnica da expressão de proteína seja um método bastante eficaz para utilizar ao invés do método de identificação das mutações (deleções e/ou mutação de ponto).
Segundo Brevet e colaboradores, é desafiador desenvolver anticorpos que reagem apenas com a forma mutante de uma oncoproteína, desenvolver essa tecnologia é essencial, pois pode ser executada em amostras nas quais o número ou a proporção de células tumorais não são adequados ou suficientes para o uso de testes moleculares baseados na extração de DNA (Brevet et al., 2010). Para outros pesquisadores, não seria correto utilizar a técnica de IH para EGFR devido à fraca correlação desta com a presença de mutações ou deleções e inserções (Pinter et al., 2008; Li et al., 2007). Parece que apenas o HER2 no câncer de mama, guarda uma correspondência das técnicas de IH e mutação. (Barnes et al., 1993; Slamon et al., 1989)
A expressão positiva para K-Ras no nosso estudo foi de 60,9%, já nos estudos de Papadakis et al., 1992 foi bem maior, de 85%. Mais uma vez ressaltando que as expressões das proteínas ainda é um assunto bastante
controverso. No nosso estudo não foram observadas diferenças significativas entre a expressão do K-Ras e os aspectos clínicos.
A taxa de resposta à quimioterapia citotóxica foi de 40% nos 50 pacientes submetidos à pesquisa de mutação do gene EGFR. Essa taxa é superior às encontradas em outros estudos que variam de 25 a 33% (Ardizzoni et al., 2007; Schiller et al., 2002; Sandler et al., 2000). Nossa taxa de sobrevida neste grupo de pacientes foi de 16,6 meses, superior à taxa de 7,8 meses observada por Schiller e colaboradores em pacientes com a mesma mutação (Schiller et al., 2002). Os dados do estudo não permitem concluir o motivo de termos encontrado uma taxa de sobrevida superior. Entre as hipóteses para tal achado, podemos considerar como obra do acaso ou devido à baixa frequência de mutação no gene K-Ras entre os pacientes estudados, pois dados de literatura sugerem que a presença de mutação neste gene confere pior prognóstico (Meng et al., 2013;Aréchaga-Ocampo et al., 2013).
Essas variações de resposta aos quimioterápicos provavelmente serão explicados no futuro de uma forma mais clara, pelos novos conhecimentos moleculares.
A variação de taxas de resposta também está relacionada às variações de esquemas quimioterapêuticos usados. Sandler et al., 2000 observou que pacientes no estádio III tratados com a combinação de duas drogas, como gencitabina mais cisplatina, apresentaram uma maior sobrevida quando comparados aos tratados apenas com cisplatina (13,7 meses vs 8,1 meses respectivamente; p=0,0108). A escolha da combinação desses componentes varia em diferentes países. Na Europa, a cisplatina ou a carboplatina são administradas em combinação com gencitabina, nos Estados Unidos é comum a combinação de um composto de platina e paclitaxel ou docetaxel (Ramalingam et al., 2008; Shepherd et al., 2003). Entretanto, não há diferença nas taxas de resposta e sobrevida no primeiro ano entre os esquemas que utilizam uma platina associada a quimioterápicos de terceira geração (Schiller et al., 2002).
Observamos uma taxa de resposta de 83,3% (5/6) e sobrevida global de 37,7 meses no grupo dos pacientes portadores de mutação no gene EGFR.
Entre os pacientes sem mutação, os resultados foram de 34,1% e 10,2 meses, respectivamente. A taxa de resposta e a sobrevida global deste grupo também foram superiores às descritas na literatura para esquemas com quimioterápicos de terceira geração (Schiller et al., 2002).
Entretanto, estudos prévios demonstraram resultados contraditórios quanto à resposta ao tratamento quimioterápico em pacientes com mutação no gene
EGFR. Mok e colaboradores relataram taxas de resposta à quimioterapia com
carboplatina e paclitaxel de 47,3% em pacientes com mutação EGFR e de 23,5% naqueles sem mutações neste gene que é próxima à relatada por Schiller e colaboradores (Mok et al., 2009; Schiller et al., 2002). Outros estudos avaliaram a influência da mutação no EGFR nos resultados da quimioterapia com drogas de terceira geração. As taxas de resposta com carboplatina/paclitaxel, cisplatina/docetaxel e carboplatina/gencitabina foram de 30,7%, 32,2% e 36%, respectivamente, e são superiores à descrita no estudo de Schiller e colaboradores (2002) (Maedomo et al., 2010; Mitsudomi et al., 2010; Zhou et al., 2011). A taxa de resposta foi superior à encontrada na literatura e não podemos descartar que tenha ocorrido um viés devido ao tamanho da amostra, por isso é necessário aumentar a casuística para permitir uma análise comparativa.
Entretanto, Zwitter e colaboradores observaram resultados animadores, com taxa de resposta de 86,8% e média de sobrevida 32,5 meses, com um ITK em esquema de manutenção após o uso concomitante de cisplatina/gencitabina e erlotinib (Zwitter et al., 2014).
A meta-análise realizada por Lee e colaboradores, envolvendo 7 estudos e 1649 pacientes com mutação no EGFR submetidos à terapia com ITK, mostrou benefício superior à 50% nos pacientes com mutação do exon 19 quando comparados aos com mutação no exon 21. Em contraste, os pacientes com mutação no exon 21 e que não receberam ITK tiveram prognóstico mais favorável em relação aos com mutação do exon 19. Além disso, pacientes do sexo feminino e não fumantes tiveram prognóstico mais favorável, entretanto variáveis como
performance status, idade, etnia e tipo histológico, não adicionaram benefícios
CONCLUSÕES
6.1- Gerais
6.1.1- A frequência de mutações no gene EGFR em nossa casuística foi semelhante à descrita na Europa Ocidental;
6.1.2- A frequência da mutação no gene K-Ras foi menor que a descrita na literatura, mas semelhante à encontrada em populações Asiáticas;
6.1.3- As frequências das expressões das proteínas EGFR e K-Ras foram menores que as descritas na literatura.
6.2- No grupo de pacientes que recebeu terapêutica
6.2.1- A frequência das mutações do gene EGFR no tipo histológico adenocarcinoma foram semelhantes aos dados nacionais. Observamos a correlação do gene EGFR mutado com adenocarcinoma e não tabagistas, não havendo com outras variáveis estudadas;
6.2.2- A resposta à QTX citotóxica e a sobrevida foram maiores que as descritas na literatura, que poderia em parte, ser explicado pelo baixo número de mutações no gene K-Ras nesta população estudada;
6.2.3- Pacientes com mutações no gene EGFR tiveram maior chance de resposta à QTX citotóxica. Não houve influência das expressões proteicas do EGFR e K-Ras com a resposta à QTX ou com outras variáveis estudadas.
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