HELEN NAEMI HONMA
ANÁLISE DE UMA SÉRIE DE CASOS DE CARCINOMA DE PULMÃO
NÃO PEQUENAS CÉLULAS, CORRELACIONANDO VARIÁVEIS
CLÍNICAS E TERAPÊUTICAS COM OS GENES EGFR e K-Ras
E SUAS EXPRESSÕES PROTEICAS
CAMPINAS
2015
ANÁLISE DE UMA SÉRIE DE CASOS DE CARCINOMA DE PULMÃO
NÃO PEQUENAS CÉLULAS, CORRELACIONANDO VARIÁVEIS
CLÍNICAS E TERAPÊUTICAS COM OS GENES
EGFR e K-Ras
E SUAS EXPRESSÕES PROTEICAS
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências, área de concentração em Clínica Médica
ORIENTADOR: PROF. DR. LAIR ZAMBON
CAMPINAS
2015
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna HELEN NAEMI HONMA e orientada pelo PROF DR LAIR ZAMBONORIENTADOR: PROF. DR. LAIR ZAMBON
MEMBROS:
1. PROF. DR. LAIR ZAMBON
2. PROFa. DRa. ILKA LOPES SANTORO
3. PROFa. DRa. TERESA YAE TAKAGAKI
4. PROFa. DRa. MÔNICA BARBOSA DE MELO
5. PROF. DR. IVAN FELIZARDO CONTRERA TORO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Ao Prof. Dr. Lair Zambon, agradeço pela ideia do projeto, por sua dedicação e incansável orientação, por confiar na minha capacidade para a realização deste trabalho e acima de tudo, por sua amizade.
À Universidade Estadual de Campinas/UNICAMP, programa de pós-graduação em Clínica Médica, que me proporcionou a realização de um curso de alta qualidade.
À Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESP) pelo financiamento desta pesquisa.
Ao amigo e parceiro de trabalho no laboratório Dr. Maurício Wesley Perroud Jr, obrigada pelas inúmeras e valiosas sugestões, discussões, amizade e perseverança.
Aos amigos Dr. Maurício Sousa de Toledo Leme e Dr. Aristóteles Souza Barbeiro pela grande amizade, desabafos, discussões, ajuda na análise das tomografias, cumplicidade e pelas palavras de carinho e incentivo.
Aos professores da Disciplina de Pneumologia pelo incentivo, em especial ao Prof. Dr. Eduardo Mello De Capitani pelos grandes ensinamentos, esclarecimentos, incentivo, confiança e grande amizade.
Ao Dr Alípio Baltazar, pelo grande incentivo e determinação na coleta das biópsias.
Aos professores da Disciplina de Cirurgia Torácica pela inestimável ajuda na coleta das biópsias, carinho e amizade que tenho por este grupo.
Aos ex-residentes das Disciplinas de Pneumologia e Cirurgia Torácica, em especial à Dra. Mariana Lousada Ferreira, Dr. Guilherme Z. Lorentz, Dr. Paulo Tonidandel, Dr. Maurício Sousa de Toledo Leme, Dr. Alex Mastri, Dra. Karina Cuziol e Dr. Daniel Lombo que muito me ajudaram na coleta das biópsias, sem vocês não haveria casuística para a realização e finalização deste projeto. Muito obrigada!!!
A toda equipe de enfermagem e técnicos, em especial a Cecília Marly Wolke Calhelha, Cidinha Trubano Ramkrapes, Inês Antônia Mantovanelli Dejarte e Tathiane Uehara Marcato, obrigada por toda dedicação com nossos pacientes e pela ajuda na coleta das biópsias.
À Prof. Dra. Maria Luiza Moretti, do departamento de Clínica Médica, pelo empréstimo do sequenciador.
Ao Prof. Dr. Fernando Costa do HEMOCENTRO-UNICAMP por seus conhecimentos e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Daniel Botelho Costa, da Universidade de Harvard, por sua grande ajuda na revisão dos artigos, pela amizade, por estar sempre disposto a contribuir com nossas pesquisas.
Ao Prof. Dr. André Moreno Morcillo do departamento de Pediatria, pela valiosa ajuda estatística, por sua amizade, incentivo e determinação.
Ao Prof. Dr. José Vassallo do departamento de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Unicamp pela grande e valiosa ajuda na leitura das lâminas de imunoistoquímica e por estar sempre disposto a ajudar com seus preciosos conhecimentos.
Aos amigos e colegas do laboratório LAPE-CAISM por deixarem o trabalho mais divertido e agradável, em especial ao Júlio que cortou todos os blocos de parafina para este estudo e a Marisa de Almeida Matsura pela amizade e incentivo.
Ao serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP pelo fornecimento das peças para a realização deste trabalho.
Ao Serviço de Arquivos Médicos (SAM), em especial ao Fabrício sempre gentil e disposto a me auxiliar na separação dos prontuários dos pacientes.
Às secretárias Vera Lúcia Pinto de Moraes de Oliveira e Soraia Damião pelas palavras de conforto, amizade e contribuição sempre gentil na nossa disciplina.
necessitam e dependem de nós. Desfrute de sua aposentadoria com saúde!!!
Aos nossos queridos pacientes que depositaram em mim toda confiança para a realização dessa pesquisa. Estejam vocês onde estiverem sempre estarão no meu coração!!!
Á amiga Lúcia Helena de Siqueira (UCHA) por sua sabedoria, por ter me ensinado a técnica de clonagem. Obrigada por dividir, muitas vezes comigo, a placa de sequenciamento.
Aos amigos e colegas do Hemocentro-UNICAMP, em especial às biólogas Devanira, Dulcinéia, Ucha, Lena, Simone e Tânia Machado por me receberem sempre de braços abertos, seja para o empréstimo de algum aparelho, para a discussão de uma técnica, desabafos, enfim obrigada pela amizade!!!
À amiga Sandra Helena Alves Bonon pelo empréstimo do freezer -80ºC. Às minhas grandes amigas e irmãs: Márcia Regina Tabossi, Sandra Helena Alves Bonon, Regina Mitchiko Ozaki e Tânia S Machado pelas palavras de incentivo, pelo carinho e apoio, agradeço à DEUS por nossa amizade pura e verdadeira. Amigas para sempre!!!!
Aos meus pais Alice e Oscar razão do meu viver, agradeço pela paciência, compreensão, sabedoria e amizade. Sou privilegiada por ser filha de pessoas tão bondosas e carinhosas.
Aos meus irmãos Clésio, Nilson e Renato, que mesmo distantes me incentivaram para a realização e término deste trabalho.
Às minhas cunhadas Iselda, Márcia, Célia e Mônica pelo carinho, cumplicidade e amizade. Ao meu cunhado, Fernando Lema que mesmo morando fora do Brasil, expressa sua curiosidade e interesse por minhas pesquisas.
Aos meus sobrinhos Thiago, Lucas e Bruno e as minhas sobrinhas Kiara, Kamila e Bárbara, o tempo passou rápido demais e nem vi vocês crescerem, agora somos mais que tia e sobrinhos (as), somos amigos (as) e confidentes!!! Obrigada por deixarem minha vida mais feliz!!!
alegria estão no ar!!!
Ao Lucas Jun Kawabata, meu filho do coração é sempre divertido nossas discussões, cresço e aprendo sempre com você!!!
Ao Ricardo, amor de uma vida!!! Obrigada pela paciência de todos esses anos, pela sabedoria, pela compreensão e por todo amor que nos une!!!
Á Deus por estar sempre presente na minha vida e da minha família. Obrigada pelo estímulo, saúde, sabedoria e paz!!!
O câncer de pulmão é a neoplasia com maior taxa de mortalidade, apesar do tratamento agressivo com cirurgia e da evolução no tratamento com quimioterapia e radioterapia. Os derivados de cisplatina são considerados o padrão ouro de tratamento de pacientes Carcinoma de Pulmão Não Pequenas Células (CPNPC). Entretanto, o desenvolvimento da resistência à cisplatina é comum e constitui o principal obstáculo à cura de tumores sensíveis. Recentemente, o avanço do conhecimento sobre as estruturas moleculares tem permitido novos estudos clínicos, principalmente nas vias de sinalização de receptores de tirosina quinase, que resultaram no desenvolvimento de terapias alvo, como os inibidores de tirosina quinase (ITKs) e alguns anticorpos monoclonais. Os aspectos moleculares do carcinoma de pulmão são poucos conhecidos na nossa população. Por isso, este estudo teve o objetivo de analisar as frequências das mutações e expressões dos genes EGFR e K-Ras e correlacionar esses achados com os aspectos clínicos, além de avaliar a influência dessas mutações e/ou expressões na resposta à quimioterapia e na sobrevida.
Foram analisados 129 pacientes para as mutações nos exons 18 ao 21 do gene
EGFR. Nove (7%) apresentaram mutações (6 com deleções no exon 19 E746_A750
e 3 com mutações de ponto em heterozigose no exon 21, L858R, CTG para CGG). Em relação ao gene K-Ras, foram analisados 126 pacientes para os códons 12 e 13. Três (2,4%) apresentaram mutações no códon 12 (GGT para TGT). A expressão do EGFR foi positiva em 49,2% dos 132 pacientes avaliados e a expressão do K-Ras em 63,2% de 136 pacientes.
Por fim, 50 pacientes atenderam aos critérios de inclusão e exclusão e completaram os 4 ciclos de quimioterapia citotóxica. Destes, 6 tinham mutações no gene
EGFR (4 com deleções no exon 19, E746_A750 e 2 com mutações de ponto em
heterozigose no exon 21, L858R) com frequência de 12% e uma mutação no gene
K-Ras códon 12, GGT para TGT (1/44=2,3%).
Dos seis pacientes CPNPC com mutação no EGFR, a taxa de resposta à quimioterapia citotóxica foi de 83,33% (5/6 casos) contrastando significativamente com a resposta dos 44 casos restantes que foi de 34,1% (15/44 casos; p=0,032).
mutação (p=0,047 e IC 95%: 1,03 - 90,41).
A mediana do tempo de sobrevida global do grupo que apresentava mutação do
EGFR 19-21 foi 37,76 meses [IC95%: indefinido] e do grupo sem a mutação foi de 10,26 meses [IC95%: 6,81 - 13,72] (p=0,008 Log Rank Test).
Não houve correlação significativa da mutação do gene K-Ras ou das expressões com os aspectos clínicos, resposta à quimioterapia ou sobrevida.
Os achados deste estudo evidenciaram que os pacientes com mutação no gene
EGFR respondem melhor à quimioterapia citotóxica e têm maior sobrevida global
quando comparados aos pacientes sem mutações.
Palavras Chave: Neoplasia Pulmonar; Quimioterapia; Receptor do Fator de
Lung cancer is the cancer with highest mortality rate, despite aggressive treatment with surgery and the evolution of treatment with chemotherapy and radiotherapy. Derivatives of cisplatin are considered the gold standard therapy for non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. However, development of cisplatin resistance is common and constitutes the main obstacle for tumors sensitive cure. Recently, the advancement in knowledge of molecular structure has allowed new clinical studies, mainly in the receptor tyrosine kinase signaling pathways, which resulted in the development of targeted therapies, such as tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and some monoclonal antibodies. Molecular aspects of lung carcinoma are little known in our population. Therefore, this study aimed to analyze the frequency of mutations and expressions of EGFR and K-Ras and correlate these findings with the clinical aspects, in addition to evaluating the influence of these mutations and/or expressions in chemotherapy response and survival.
129 patients were analyzed for the EGFR gene mutations at exons 18 to 21 and 9 patients (7%) presented mutations (6 with deletions at exons 19, E746_A750 and 3 with heterozygous point mutations at exon 21, L858R, CTG to CGG). In relation to the K-Ras gene, 126 patients were analyzed at codons 12 and 13 and 3 patients (2.4%) presented mutations at codon 12 (GGT for TGT). The expression of EGFR was positive in 49.2% of 132 patients evaluated and the expression of K-Ras in 63.2% of 136 patients was positive as well.
Finally, 50 patients met inclusion and exclusion criteria and completed the 4 cycles of cytotoxic chemotherapy. Of these, 6 were EGFR gene mutations (4with deletions at exon 19, E746_A750 and 2 with heterozygous point mutations at exon 21, L858R, CTG to CGG) with 12% frequency and 1 mutation in the K-Ras gene, codon 12, GGT for TGT (1/44=2.3%).
Of the six patients with EGFR mutation in NSCLC, the response rate to cytotoxic chemotherapy was 83.33% (5/6 cases), in significantly contrasting with the response of the 44 remaining cases which was 34.1% (15/44 cases; p=0.032).
95% CI: 1.03-90.41).
The median overall survival time of the group that presented the EGFR mutation 19-21 was 37.76 months [95% CI: undefined] and the group without the mutation was 10.26 months [95% CI: 6.81-13.72] (p=0.008 Log Rank Test). There was no significant correlation of mutation of K-Ras gene or the expressions with clinical aspects, response to chemotherapy or survival.
The findings of this study showed patients with mutations in EGFR gene respond better to chemotherapy and have greater cytotoxic overall survival when compared with patients without mutation.
Key Words: Lung Cancer; Chemotherapy; Epidermal growth factor receptor;
A Adenina
AC Adenocarcinoma
ALK Anaplastic lymphoma kinase
AS Fita Anti Sense
ATP Adenosina Trifosfato
AUC Área Sob a Curva
BRAF-B-Raf Proto Oncogene, Serine/Threonine Kinase
C Citosina
CP Câncer de Pulmão
CPNPC Carcinoma Pulmonar Não Pequenas Células
CPPC Carcinoma Pulmonar Pequenas Células
dATP Desoxi Adenosina Trifosfato
dCTP Desoxi Citosina Trifosfato
dDNTP Didesoxinucleotídeo
dGTP Desoxi guanosina trifosfato
DNA Ácido Desoxirribonucleico
dNTP Desoxinucleotídeo
dTTP Desoxi Timidina Trifosfato
ECOG Eastern Cooperative Oncology Group EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
EML4 Echinoderm Microtubule-Associated Protein-like 4 FCM Faculdade de Ciências Médicas
FDA Food and Drugs Administration
GTP Trifosfato de Guanosina
H2O2 Água Oxigenada HC Hospital de Clínicas
HCl Ácido Clorídrico
HER-2 Human Epidermal Growth Factor Receptor-Type 2 IC Intervalo de Confiança
IH Imunoistoquímica
IPASS Iressa Pan Asian Study IPTG Iso Propil TioGalactosídeo
ITKs Inibidores de Tirosina Quinases
KDa Quilodaltons
K-Ras Kirsten Rat Sarcoma
LB Luria Bertani
MET MET Proto-Oncogene, Receptor Tyrosine Kinase
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de Magnésio
ml Mililitro
mM MiliMolar
µl Micromoles
NAC Não Adenocarcinoma
NF Nunca fumou
ng Nanograma
ºC Grau Celsius
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Tampão Fosfato Salino
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase, Catalytic Subunit Alpha
pmol Picomol
QTX Quimioterapia
RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors ROS1 ROS Proto-Oncogene 1, Receptor Tyrosine Kinase
RR Risco Relativo
RTX Radioterapia
S Fita sentido
SLP Sobrevida Livre de Progressão
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
SSCP Polimorfismo de Conformação em Hélice Simples
T Timina
T0 Tempo Zero
TC Tomografia Computadorizada
TEB Tampão Tris, Ácido Bórico, EDTA
TNM Tumor, Nódulo, Metástase
Pág. Tabela 1 Distribuição dos pacientes analisados para mutação do gene
EGFR e K-Ras submetido à QTX em relação ao sexo, etnia,
histologia, estadiamento, ECOG e hábito tabágico... 51
Tabela 2 Frequência dos genes EGFR19, 21, EGFR19∕ 21 e K-Ras.... 52 Tabela 3 Distribuição da mutação do EGFR19/21 em relação ao sexo,
etnia, histologia, estadiamento, ECOG e hábito tabágico... 53
Tabela 4 Distribuição dos resultados entre os subgrupos de pacientes com e sem mutação do gene K-Ras em relação ao sexo, etnia, tipo histológico, estadiamento, ECOG e hábito tabágico... 54
Tabela 5 Distribuição com relação às expressões do EGFR e K-ras.... 55
Tabela 6 Distribuição da expressão do EGFR em relação ao sexo, etnia tipo histológico, estadiamento, ECOG e hábito tabágico... 56
Tabela 7 Distribuição da expressão do K-Ras em relação ao sexo, etnia, tipo histológico, estadiamento, ECOG e hábito tabágico... 57
Tabela 8 Valores de OR não ajustado da Resposta à QTX em relação às mutações do EGFR 19, 21 e K-Ras... 58
Tabela 9 Valores de OR ajustado da resposta à QTX por regressão logística multivariada... 59
Tabela 10 Valores das Razões de Chances (OR) não ajustados da resistência à QTX em relação à expressão do EGFR e K-Ras... 59
Pág. Quadro 1 Estudo de fase III com EGFR ITKs na 1ª linha de tratamento
para carcinoma de pulmão não pequenas células... 29
Quadro 2 Iniciadores dos genes EGFR e K-Ras... 35
Quadro 3 Escores para análises das proteínas (células tumorais e Imunocolorações)... 43
Pág. Ilustração 1 Domínio Completo da Tirosina Quinase... 24
Ilustração 2 Mecanismos de ação dos Inibidores Tirosina Quinases... 26
Ilustração 3 Fluxograma das frequências das mutações no EGFR e
K-Ras nas amostras estudadas e no subgrupo que
receberam QTX... 48
Ilustração 4 Fluxograma das frequências das expressões do EGFR e K-Ras nas amostras estudadas e no subgrupo que receberam QTX... 49
Ilustração 5 Análise da sobrevida dos pacientes que responderam à QTX... 60
Ilustração 6 Análise da sobrevida dos pacientes com mutação no gene
EGFR 19 e 21... 61 Ilustração 7 Eletroferograma mostrando deleção no exon 19 do gene
EGFR... 63 Ilustração 8 Eletroferograma mostrando mutação de ponto no exon 21
do gene EGFR L858R... 63
Ilustração 9 Eletroferograma mostrando mutação de ponto no códon 12 do gene K-Ras em heterozigose G para T (GGT para TGT)... 64
Pág.
1- INTRODUÇÃO... 21
1.1- Considerações gerais... 21
1.2- EGFR (Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico)... 23
1.3- Experiências clínicas com os inibidores tirosina quinase do EGFR (ITKs) gefinib e erlotinib... 27
1.4- K-Ras (Kirsten Rat Sarcoma)... 30
2- OBJETIVOS... 32
2.1- Geral... 32
2.2- No grupo que recebeu a terapêutica... 32
2.2.1- Frequência da mutação no EGFR e suas correlações com aspectos clínicos e histológicos... 32
2.2.2- Observar taxa de resposta à QTX e sobrevida... 32
2.2.3- Avaliar a influência da presença de mutações e/ou expressões proteicas do EGFR e K-Ras na resposta à quimioterapia... 32
3- CASUÍSTICA E MÉTODO... 33
3.1- População de estudo... 33
3.2- PCR dos genes EGFR exons 18 ao 21 e K-Ras... 35
3.3- PCR - SSCP... 36
3.7- Análise estatística... 43
4- RESULTADOS... 45
4.1- População total... 45
4.1.1- Análise da mutação no gene EGFR... 45 4.1.2- Análise da mutação no gene K-Ras... 45
4.1.3- Análise da expressão da proteína EGFR... 46
4.1.4- Análise da expressão da proteína K-Ras... 47
4.2- Grupo de pacientes submetidos à QTX... 50
4.2.1- Análise descritiva do grupo submetido à QTX... 50
4.3- Perfil dos pacientes com mutação no gene EGFR... 62
4.4- Perfil do paciente com mutação no gene K-Ras... 64
5- DISCUSSÃO... 65
6- CONCLUSÕES... 72
7- REFERÊNCIAS... 73
INTRODUÇÃO
1.1- Considerações gerais
De doença rara no início do século XX (Parkin, 2001apud), o câncer de pulmão (CP) tornou-se a neoplasia de maior mortalidade. Para 2012, a Organização Mundial da Saúde estimou uma incidência de 1,8 milhões de casos e 1,59 milhões de mortes (“Fact Sheets by Cancer”, [s.d.]; “WHO / Cancer”, [s.d.]).
No Brasil, a estimativa para 2014 foi de aproximadamente 27.330 casos novos de CP, sendo 16.400 entre homens e 10.930 entre mulheres. Em 2012, houve 23.500 óbitos por neoplasia de pulmão (INCA 2014).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou que o número mundial de mortes por doenças relacionadas ao hábito tabágico, incluindo o CP, totalizará 10 milhões por ano a partir de 2030 (Payne, 2009).
O tabaco é o principal fator etiológico do CP e pode associar-se com outras causas externas, como as exposições ambientais e profissionais (Okazaki et al., 2014; Shafey et al., 2002). Recentemente, houve um melhor entendimento da doença, quanto ao seu desenvolvimento, diagnóstico e terapia, devido ao avanço no conhecimento dos genes relacionados com a biometabolização dos carcinógenos, com a diferenciação celular e supressão de tumores (Honma et al., 2008), além dos mecanismos epigenéticos relacionados com a transcrição gênica (Oliveira et al., 2012).
A interação de fatores externos e intrínsecos envolvendo muitos genes torna a carcinogênese extremamente complexa, o que conjuntamente com a falta de método de rotina eficaz para o diagnóstico precoce, explica porque se evoluiu tão pouco no seu prognóstico quando comparados às outras neoplasias. (Zambon et al., 2007).
A taxa de cura em 5 anos é cerca de 15% em países desenvolvidos, mas abaixo de 10% no nosso país porque, em média, 75% dos casos estão no estádio avançado no momento do diagnóstico (Zambon, 1994; Szabo et al., 1993;
Perroud et al., 2011; Bayman et al.,2014). O tratamento cirúrgico, o único método potencialmente de cura, fica restrito à minoria dos pacientes devido ao diagnóstico tardio e à associação com outras comorbidades relacionadas ao tabagismo e à senilidade (Novaes et al, 2008).
Na prática clínica, o carcinoma brônquico ainda é classificado em câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) e câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC). Este último inclui o carcinoma de células escamosas, o adenocarcinoma e o carcinoma de grandes células. Essa classificação dicotômica não é mais usada na abordagem terapêutica, porque os adenocarcinomas constituem, à luz do conhecimento molecular, uma nova entidade histopatológica com padrão de comportamento biológico específico, principalmente quando se considera a exposição, ou não, aos produtos do tabaco (Eguchi et al., 2014; Travis et al., 2011).
A quimioterapia (QTX) citotóxica e a radioterapia (RTX) são os métodos terapêuticos habitualmente utilizados. Especificamente no grupo do CPNPC, os esquemas quimioterápicos baseados na associação de platina e drogas de 3° geração (gencitabina, docetaxel e paclitaxel) têm uma taxa média de resposta de 30% (Minna & Schiller, 2008; Schiller et al., 2002; Blackhall et al., 2005) que reflete em uma sobrevida média de 8 a 10 meses (Ardizzoni et al., 2007). Desde o início deste século, o desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular propiciou grandes avanços no estudo do CP que deverão contribuir para a terapêutica individualizada, levando a tratamentos mais eficazes e eficientes. (Blackhall et al., 2005).
Nos últimos anos, houve uma mudança de paradigma na abordagem terapêutica do câncer de pulmão com o avanço da terapia personalizada orientada por biomarcadores no CPNPC (Vaguliene et al.,2012; Zhou et al., 2011). Atualmente, há medicamentos alvo-dirigido aprovados para casos com mutações no gene EGFR e com translocação EML4-ALK, todos são da classe dos inibidores de tirosina quinase (ITK) e apresentam resultados animadores [Vaguliene et al., 2012; Zhou et al., 2011; Sandler AB 2006). No Brasil, as drogas aprovadas para as mutações do gene EGFR são o erlotinib e gefitinib. O Crizotinib está disponível para os casos com fusão dos genes EML4-ALK (Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4 e Anaplastic Linfoma Quinase). Para as demais alterações
moleculares (e.g. K-Ras, MET, BRAF, ROS1, HER2, e PIK3CA), há drogas potenciais em estudos pré-clínicos e clínicos (Vaguliene et al., 2012; Gerber et al., 2014).
A característica de doença multifacetada, com diferentes tipos histológicos e comportamentos biológicos distintos, constitui um grande desafio a ser enfrentado na tentativa do aprimoramento das terapêuticas atuais baseadas em análises moleculares e expressões proteicas (Gaughan et al., 2011).
1.2- EGFR (Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico)
O gene EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) está localizado no braço curto do cromossomo 7 e codifica uma proteína de 170-kDa do tipo transmembrana que pertence à família Erb/HER do receptor de tirosina quinase, composta pelos receptores HER1 (EGFR/erb1), HER2 (neu/ erb2), HER3 (erb3) e HER4 (erb4). Estes receptores exibem estruturas moleculares similares com um domínio de ligação ligante extracelular, rica em cisteína; um segmento transmembrana lipofílico e um domínio intracelular que possui atividade intrínseca de tirosina quinase em todos os receptores, exceto em HER3 (Wells A, 1999; Ullrich et al., 1990; Herbst RS 2004).
Com a presença de um ligante acoplado ao EGFR, o receptor forma um dímero que promove a sinalização intracelular através da auto fosforilação do receptor por meio da ação de tirosina quinase (Citri & Yarden 2006).
A via sinalizadora desencadeada pelo EGFR tem grande importância ao regular o crescimento, a sobrevida, a proliferação e a diferenciação celular (Oda et al., 2005).
O domínio completo da tirosina quinase compreende os exons 18 a 24 (Ilustração 1). As mutações no EGFR mais prevalentes ocorrem nos exons 18 a 21 e são agrupados ao redor da bolsa de ATP da enzima (Sharma et al., 2007). Entre 80 e 90% das mutações detectáveis no EGFR compreendem deleções no exon 19 (resíduos 747-750), seguido de uma mutação específica de ponto no resíduo 858 do exon 21 (Riely et al., 2006), substituições no exon 18 e inserções
e/ou substituições no exon 20. Cada uma destas últimas representa cerca de 5% das alterações moleculares (Sharma et al., 2007).
Ilustração 1- Domínio Completo da Tirosina Quinase: o domínio completo da
tirosina quinase compreende os exons 18 a 24. As mutações mais prevalentes, cerca de 90%, acometem os exons 19 e 21. Mutações no exon 20 geralmente acontecem devido à resistência aos inibidores de tirosina quinase (T790M) (adaptado de Sharma et al., 2007).
Mutações do domínio tirosina quinase são geralmente referidas como mutações ativadoras, pois parecem resultar em atividade quinase aumentada do receptor (Sharma et al., 2007). Essas mutações acionam preferencialmente as vias sinalizadoras de pró-sobrevivência PI3K-AKT e as vias STAT nas células tumorais que levam à proliferação celular, ao desenvolvimento da capacidade de invasão tecidual e disseminação por metástase, além do estímulo à neovascularização (Hynes & Lane 2005).
As mutações do gene EGFR no CPNPC são encontradas em cerca de 10 a 20% dos pacientes brancos (D’Angelo et al., 2011) e em mais de 30% dos pacientes do leste asiáticos. Além disso, estão fortemente associadas com algumas características clínicas (Shigematsu et al., 2005; Rosell R, 2009), sendo mais frequente entre mulheres não tabagistas (Sequist & Lynch, 2008).
Pacientes com CPNPC e EGFR mutado fazem parte de uma classe molecular distinta, pois apresentam um “vício oncogênico” que é uma dependência adquirida das células tumorais em ativar oncogenes para a sua sobrevivência e/ou
proliferação. Um fenômeno importante nas implicações para o sucesso das terapias alvo (Sharma et al., 2006). Esse fenômeno ajudou, por meio de vários estudos, o desenvolvimento de drogas como o cloridrato de erlotinib e gefitinib (Hehlmann et al., 2007; Rubin et al., 2007).
O desenvolvimento dos ITKs do EGFR data do início da década de 1990. Os primeiros estudos em humanos, como droga de primeira linha, tiveram resultados desanimadores (Baselga et al., 2002; Hidalgo et al., 2001). A detecção de resposta clínica em um perfil de pacientes com maior incidência de mutações no EGFR - i.e. mulheres asiáticas, não fumantes com adenocarcinoma - permitiu correlacionar a ação dos ITKs com a mutação do gene EGFR (Zhu et al., 2008; Shigematsu et al., 2005).
Erlotinib e Gefitinib são potentes inibidores do receptor EGFR/HER1 ao bloquear a atividade da tirosina quinase através da competição com adenosina trifosfato (ATP) para seu sítio de ligação no domínio intracelular. Por este mecanismo, reduzem seletivamente a auto fosforilação e a ativação do receptor levando a regressão tumoral através da indução da apoptose, da inibição da proliferação celular e da angiogênese (Costa et al., 2014; Heist RS, 2009; Davies, et al, 2007; Sridhar et al., 2003) (Ilustração 2).
Ilustração 2- Mecanismo de ativação das vias de sinalização e ação dos ITKs. A) Mecanismo de ativação das vias de sinalização JAK/STAT,
MAPK/ERK e PI3K/AKT pelo receptor do fator de crescimento epidérmico e B) ação dos inibidores de tirosina quinase (gefitinib, erlotinib ou afatinib) quando o paciente apresenta mutação (ões) no gene EGFR, há um bloqueio das vias de sinalização, levando a célula à apoptose (adaptado de Yasuda et al., 2012).
Os tumores com mutação no gene EGFR são altamente sensíveis ao gefitinib e erlotinib (Paez et al., 2004). Entre os pacientes tratados com gefitinib, vários estudos evidenciaram que os portadores de mutações no EGFR têm sobrevida significantemente maior quando comparados aos que não apresentam essas mutações (Johnson and Janne PA, 2005). Segundo o estudo de Lee et al., 2015 houve uma redução de 63% no risco da progressão da doença ou morte (p=0,001) nos pacientes tratados com ITK em comparação com a QTX citotóxica.
Apesar da eficácia do cloridrato de gefitinib e do erlotinib como monoterapia para CPNPC com EGFR mutante, a resistência adquirida à terapia com ITK-EGFR ocorre em aproximadamente 50% dos pacientes com progressões radiográficas (Linardou et al., 2009; Engelman et al., 2007; Pao et al., 2005; Shigematsu & Gazdar, 2006; Balak et al., 2006; Kosaka et al., 2006).
O primeiro mecanismo de resistência adquirida a esses medicamentos relatado na literatura foi à aquisição da mutação EGFR T790M (Kobayashi et al., 2005; Pao et al., 2005).
A substituição do aminoácido metionina por treonina na posição 790 do exon 20 gera uma corrente lateral mais robusta que reduz a ligação de gefitinib/erlotinib e aumenta a afinidade da bolsa EGFR tirosina quinase ao ATP. (Kobayashi et al., 2005; Yun et al., 2008).
Alguns estudos sugerem que esta mutação já estava presente em algumas células tumorais até mesmo antes da exposição à droga e o tratamento leva à seleção do clone mutado (Greulich et al.,2005; Kobayashi et al., 2005).
1.3- Experiências clínicas com os inibidores tirosina quinase do EGFR (ITKs) gefinib e erlotinib
O desenvolvimento de inibidores tirosina quinase do EGFR (ITKs) data do início da década de 1990. O primeiro composto desenvolvido foi denominado ZD-1839, rebatizado como gefitinib. Logo depois, começou o desenvolvimento clínico do composto OSI 774, renomeado como erlotinib (Baselga et al., 2002; Hidalgo et al., 2001).
Os dois compostos foram aprovados pelo FDA dos Estados Unidos e liberados para uso na quimioterapia de 2ª e 3ª linha após falha da primeira linha com drogas derivadas da platina, contudo os estudos de Thatcher et al., 2005 não mostraram benefícios com o uso da droga no grupo dos pacientes com estádio avançado, não selecionados. Estava claro que somente uma minoria dos pacientes poderiam se beneficiar do tratamento com os inibidores de tirosina quinase. As características clínicas que indicariam boa resposta terapêutica incluíam: sexo feminino, tipo histológico adenocarcinoma, etnia asiática e indivíduos não fumantes (Miller et al., 2004).
O primeiro “trial” para confirmar a utilização da mutação no EGFR como preditor da eficácia foi o IRESSA PAN-ASIAN STUDY (IPASS), estudo de fase III comparando o gefitinib 250mg com a carboplatina/paclitaxel por três semanas por até 6 ciclos em CPNPC previamente não tratados, a taxa de resposta objetiva foi de 71,2% para o gefinib versus 47,3% com a carboplatina/paclitaxel no subgrupo de mutações positivas (Mok et al., 2009).
IPASS demonstrou uma média de sobrevida livre de progressão (SLP) de 9,6 meses, significantemente maior em pacientes com mutação no EGFR que receberam gefitinib do que entre os que receberam carboplatina-paclitaxel (OR 0,48; IC95% 0,36-0,64; p0,001). Com taxa de resposta de 71,2% com gefitinib
versus 47,3% para carboplatina + paclitaxel (p<0,001). Dados semelhantes foram
evidenciados nos estudos NEJ002 e WJTOG3405 (Vadakara J, 2012).
OPTIMAL, um estudo de fase III, comparou o tratamento com erlotinib versus carboplatina/gencitabina em pacientes com CPNPC estádio avançado e mutações no EGFR. A mediana de SLP foi superior nos pacientes que fizeram uso de erlotinib (13,1 versus 4,6 meses) (Zhou et al., 2011). Resultados similares foram observados em um estudo posterior, o EURTAC (Rosell et al., 2012).
Os estudos de LUX Lung 3 estudaram o Afatinib vesus cisplatina mais o Pemetrexed avaliando a sobrevida livre de progressão que foi de 11,1 meses para o Afatinib e 6,9 meses para cisplatina + pemetrexed (p=0,001), portanto pacientes com adenocarcinoma e mutação no EGFR tiveram benefícios na sobrevida livre de progressão e resposta quando tratados com Afatinib (primeira linha) (Sequist et al., 2013).
O estudo de fase III, LUX Lung 6 usando afatinib versus gencitabina mais cisplatina, mostrou uma média de sobrevida global para pacientes com deleção no exon 19 de 31,4 meses versus 18,4 meses para gencitabina (p=0,023) (Yang et al., 2015).
O quadro 1 resume os dados dos estudos de fase III, com o uso de
EGFR - ITKs na primeira linha de tratamento em CPNPC avançado.
Quadro 1- Estudos de fase III com EGFR-ITKs na primeira linha de tratamento para
CPNPC avançado.
Estudo População
Estudada Tratamento Resultados
IPASS (Mok et al., 2009)
Adenocarcinoma Carboplatina/paclitaxel vs Gefitinib
Intenção de tratar o grupo tiveram OR=0,74; IC 95%: 0,65-0,85; P=0,001. No grupo com EGFR mutado tiveram OR=0,48; IC 95%: 0,36-0,64; P=0,001. A taxa de resposta foi 71,2% para Gefitinib vs 47,3% para carboplatina/paclitaxel (P=0,001) no subgrupo sem EGFR mutado.
NEJSG (Maedomo et al., 2010) Mutação EGFR positivo Carboplatina/paclitaxel vs gefitinib
Grupo Gefitinib tiveram OR=0,30; IC 95%: 0,22-0,41; P=0,001. A taxa de resposta foi 73,7% para gefitinib vs 30,7% para carboplatina/ paclitaxel, (P=0,001). WJTOG (Mitsudomi et al., 2010) Mutação EGFR positivo Cisplatina/docetaxel vs gefitinib
Grupo gefitinib tiveram OR=0,489; IC 95%: 0,336-0,710; P=0,0001. A taxa de reposta foi 62,1% para Gefitinib vs 32,2% para cisplatina/ docetaxel (P=0,0001). OPTIMAL (Zhou et al., 2011) Mutação EGFR positivo Gencitabina/carboplatina vs erlotinib
Grupo Erlotinib tiveram OR=0,16; IC 95%=0,10–0,26; P=0,0001. A taxa de resposta foi 83% para erlotinib vs 36% para gencitabina/ carboplatina (P=0,0001). EURTAC (Rosell et al., 2012) Mutação EGFR positivo
Platina vs erlotinib Grupo do Erlotinib tiveram OR=0,80; P=0,42.
A taxa de resposta foi de 54.5% para erlotinib vs 10.5% platina (P=0,0001) LUX Lung 3 (Sequist et al.,2013) Mutação EGFR positivo Afatinib vs Cisplatina + Pemetrexed
Grupo do Afatinib tiveram uma média de SLP de 11,1 meses e 6,9meses para cisplatina+pemetrexed LUX Lung 6(Yang et al., 2015) Mutação EGFR (del 19) Afatinib vs gencitabina + cisplatina
Taxa de resposta de sobrevida global foi de 31,4 meses para Afatinib vs 18,4 meses para Gencitabina + cisplatina (P=0,023)
1.4- K-Ras (Kirsten rat sarcoma)
O gene K-Ras está localizado no braço curto do cromossomo 12 e codifica uma proteína de 21 kd localizada na face interna da membrana celular, logo abaixo da proteína do EGFR, que se liga ao difosfato de guanosina (GDP) ou trifosfato de guanosina (GTP), (Smit et al., 1996; Anderson & Spanndi 1993; Birrer & Brown, 1992; Slebos et al., 1991) e tem atividade GTPase intrínseca. A forma ativa está ligada ao GTP e a inativa ao GDP (Anderson & Spanndi, 1993).
A mutação no K-Ras é mais frequente nos códons 12, 13 ou 61 do exon 2 e promove a codificação de uma proteína que se liga ao GTP. Essa ligação leva à ativação da sinalização e, por consequência, induz a proliferação celular descontrolada (Bos JL,1989).
A ativação do Ras é comum nas células tumorais por mutações somáticas e pode desenvolver um caminho crítico na proliferação celular (Downward J, 2003). A mutação no gene K-Ras está associada com um pior prognóstico (Lewandowska et al. 2013; Mascaux et al., 2005) ocorre frequentemente no CPNPC (Rodenhuis et al., 1987), principalmente em adenocarcinoma (20 a 30%) e a mutação raramente é encontrada em carcinoma epidermóide, em torno de 7% (Roberts et al., 2013; Jemal A, et al 2008). Além disso, tem associação com uso do tabaco (Roberts PJ, 2013; Jang et al.,2009; Riely et al.,2009; Forbes S, et al., 2006; Pacheco 2002).
A frequência das mutações no K-Ras varia conforme o grupo étnico, sendo baixa entre asiáticos e alta entre afro-americanos. Entre estes extremos, os caucasianos constituem o grupo intermediário (Riely GJ, et al., 2008).
É interessante notar que as mutações do EGFR e K-Ras são raramente encontradas no mesmo tumor (Roberts PJ, 2013) e para alguns autores são mutações mutuamente exclusivas (Lozano et al., 2011, Schmid et al., 2009, Linardou et al., 2008). Segundo Soung e colaboradores há uma relação inversa entre as mutações nos genes EGFR e K-Ras em adenocarcinomas de pulmão (Soung et al., 2005). Estas observações sugerem que cada uma destas alterações moleculares tem funções distintas no processo da carcinogênese (Roberts PJ, 2013). Outro ponto relevante, na discussão sobre as diferenças entre estas mutações, é a correlação com o tabagismo. Enquanto, a mutação K-Ras tem
associação com o uso de tabaco (Roberts PJ, 2013; Jang et al., 2009; Riely et al., 2009; Forbes S, et al., 2006; Pacheco 2002; Marchetti et al., 2005; Ahrendt et al., 2001), a mutação no gene EGFR foi observada em não fumantes (Mok et al., 2009).
As mutações no K-Ras foram associadas como marcadores de prognóstico para carcinoma de pulmão não pequenas células em vários estudos (Young et al., 2012; Marks et al., 2008) e estariam relacionadas a pior prognóstico (Lewandowska et al., 2013; Mascaux et al., 2005).
Existe evidência inconclusiva sobre o papel das mutações K-Ras em prever o benefício da quimioterapia baseada em platina em adenocarcinoma de pulmão (Loriot Y, 2009). Por outro lado, análises retrospectivas parecem sugerir que os pacientes com mutação no K-Ras apresentam resistência primária para os ITKs anti-EGFR (Roberts PJ, 2013; Kosaka et al., 2006; Mascaux et al., 2005). Para Schmid e colaboradores a resistência à primeira geração dos ITK - EGFR pode ser devido à presença do EGFR tipo selvagem, não por mutações no K-Ras (Schmid et al., 2009). Por outro lado, Massarelli e colaboradores observaram que todos os pacientes com mutação no K-Ras, independente de alterações no EGFR, evoluíram com progressão de doença (Massarelli et al., 2007).
O direcionamento do K-Ras como alvo terapêutico tem sido difícil. Uma abordagem com promessa inicial baseou-se na utilização de drogas que pertenciam à classe dos inibidores da farnesil transferase que impedem as modificações pós-traducional. Com relação à essas modificações, o K-Ras sofre farnesilação da sua citosina no carboxi- terminal, o que é essencial para sua interação com a membrana plasmática. Outro composto com promessa inicial era ácido farnesil tiosalicíclico, ou salirasib, que diminui a atividade do RAS ativado por inibir competitivamente o RAS-GTP. Apesar do K-Ras parecer ser um bom alvo para o desenvolvimento de novas drogas, infelizmente nenhuma foi desenvolvida e aprovada até o momento para sua inibição (Vakiani and Solit, 2011; Banerji, 2009).
OBJETIVOS
2.1- Geral
Estudar as frequências das mutações do gene EGFR e K-Ras e as expressões das proteínas EGFR e K-ras na população atendida no Ambulatório de Oncopneumologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP.
2.2- No grupo de pacientes que receberam terapêutica
2.2.1- Frequência da mutação no EGFR e suas correlações com aspectos clínicos e histológicos;
2.2.2- Observar taxa de resposta à QTX e sobrevida;
2.2.3- Avaliar a influência da presença de mutações e/ou expressões proteicas do EGFR e K-Ras na resposta à quimioterapia.
CASUÍSTICA E MÉTODO
O delineamento do estudo foi do tipo transversal na fase da avaliação da frequência de mutações e expressões do EGFR e K-Ras entre os pacientes com CPNPC recrutados no Ambulatório de Oncopneumologia do HC/Unicamp. A partir da definição de uma coorte de pacientes com as mutações detectadas, delineou-se um estudo prospectivo visando avaliar a influência da presença dessas mutações na resposta à quimioterapia citotóxica e à terapia alvo.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios institucionais e o estudo foi aprovado pelo Comitê em Ética Médica (CEP:550/2009; CAAE: 0442.0.146.0001-09). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1).
3.1- População de estudo
A população de estudo foi definida através de critérios de inclusão e exclusão, como descritos abaixo.
Os critérios de inclusão foram: paciente ter idade igual ou superior a 18 anos independente da origem, nacionalidade, cor, sexo, credo ou condição social; ter diagnóstico de CPNPC sem ter realizado QTX, radioterapia e cirurgia oncológica curativa para CP; ser capaz de entender os parâmetros do protocolo e desejar esclarecidamente participar do estudo, através da assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética Médica FCM/UNICAMP, após todos os aspectos do estudo, que podem ser relevantes para a decisão dele/dela, terem sido explanados, com questões e dúvidas elucidadas, e antes do início de qualquer seleção ou procedimento específico do estudo.
Os critérios de exclusão foram: presença de metástase cerebral; gravidez ou estar amamentando; presença de comorbidades que contraindicam a QTX e performance status maior que 2.
Todas as biópsias foram coletadas no setor de broncoscopia do Hospital de Clínicas da Unicamp. O broncoscopista retirou dois fragmentos do tumor, um foi levado para o setor da Anatomia Patológica, onde o diagnóstico do CPNPC foi realizado e o outro fragmento da biópsia foi levado ao laboratório de Oncopneumologia para extração do DNA e análises dos genes. As análises das proteínas foram realizadas no material emblocado pela técnica de IH (imunoistoquímica).
O estádio foi definido por exames de imagens, seguindo o sistema TNM (Tumor, Nódulo, Metástase) (Edge and Campton, 2010). Os dados clínicos e história de fumo foram coletados a partir do prontuário do paciente, ou durante a entrevista, antes de assinar o termo de consentimento.
Cento e cinquenta e um pacientes com CPNPC englobando todos os estádios foram atendidos e tratados no ambulatório de oncopneumologia na UNICAMP, no período de agosto de 2009 a junho de 2012. Contudo, apenas 50 pacientes inoperáveis e com estádios avançados III (a ou b) e IV tiveram condições para receber o tratamento de quimioterapia à base de platina e paclitaxel [75mg/m2 de cisplatina ou 5 AUC (área sob a curva) de carboplatina e 200mg/m2 de paclitaxel, a cada 21 dias] por 4 ciclos e com tecido o suficiente para a análise da mutação do gene EGFR.
Nenhum dos 50 pacientes recebeu quimioterapia e radioterapia concomitantemente, nem mesmo os 17 pacientes com estádio III inoperáveis. Destes, apenas seis pacientes [35,3% (6/17)] receberam quimioterapia e 11 [64,7% (11/17)] receberam radioterapia em sequência à QTX citotóxica. Dos seis pacientes com mutações no gene EGFR (deleções no exon 19 ou mutação no exon 21), somente três tomaram o inibidor de Tirosina Quinase (ITKs).
Os pacientes foram submetidos à tomografia computadorizada (TC) antes de começar a quimioterapia, e um mês após a finalização dos quatro ciclos. O grau de resposta à quimioterapia, avaliada pela tomografia, seguiu os critérios de RECIST v1.1, sendo classificados em: Resposta Completa (remissão completa da lesão); Resposta Parcial (diminuição de 30% ou mais no diâmetro da lesão comparado à tomografia sem tratamento); Doença Estável (quando não há aumento,
nem diminuição do diâmetro da lesão) e Progressão da Doença (aumento de mais de 20% da lesão em seu diâmetro ou aparecimento de novas lesões) (Nishino et al., 2010).
3.2- PCR dos genes EGFR exons 18 ao 21 e K-Ras
O DNA foi extraído de cada biópsia pulmonar pelo kit QIAmp DNA Micro Kit (Qiagen). A quantificação das amostras foi realizada em nanodrop 2000 (Thermo Scientific), determinada pela razão de absorbância 260/280nm, sendo viáveis para o uso quando observadas entre 1,7 e 1,9. Utilizamos a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) para analisar os genes EGFR exons 18, 19, 20, 21 e K-Ras. Foram utilizadas a mistura de 100mM de Tris-HCl, pH 8,4; 2,0mM de MgCl2; 1µl (0,2mM) de cada nucleotídeo trifosfato (dATP,dCTP, dTTP, dGTP),
15 a 20pmol dos iniciadores para o gene EGFR e 50pmol para o gene K-Ras; 50-100ng de DNA genômico e 1U de Taq Polimerase (Invitrogen- Life Technologies) em um volume total de 50µl . As temperaturas de anelamento para os exons 18 e 19 foram de 63°C, para o exon 20, 52°C, para o exon 21, 51°C e para o gene
K-Ras 50°C. A reação de PCR foi realizada no termociclador PTC-100
(MJ Research) por aproximadamente 35 ciclos. A verificação da amplificação do DNA se deu em gel de agarose 2%. O produto amplificado para os exons 18 e 19 foi de 1000pb, para o exon 20-302pb, para o exon 21-225pb e para o gene
K-Ras-241pb.
Os iniciadores utilizados para o gene EGFR e K-Ras estão listados no quadro 2.
Quadro 2- Iniciadores dos genes EGFR e K-Ras Temperatura
Anelamento Sense (5’-3’) AS (5’-3’)
EGFR exons 18
e 19
63º C ATGGTGAGGGCTGAGGTGACCC GGGCCTGAGGTTCAGAGCCATG
EGFR exon 20 52ºC GGCACAGCTTTTCCTCCATGA GTTGAGCAGGTACTGGGAGCC EGFR exon 21 51ºC GCAGAGCTTCTTCCCATGATG GCCACCTCCTTACTTTGCCTC K-Ras 50ºC GGTGGAGTATTTGATAGTG GGTCCTGCACCAGTAATATGC
3.3- PCR - SSCP (Polimorfismo de Conformação em Hélice Simples)
Após a realização da PCR, foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida 20% no aparelho chamado PhastSystem. Essa técnica permitiu identificar variações na sequência através da detecção de alterações de conformação em hélice simples de DNA utilizada para o rastreamento de mutações e/ou polimorfismos genéticos. A mudança em uma base na sequência do ácido nucleico amplificado pela PCR pode ser detectada pela técnica PCR-SSCP (polimorfismo de conformação em hélice simples).
O rastreamento dos exons 20, 21 do gene EGFR e dos códons 12 e 13 para o gene K-Ras foi realizado pelo método SSCP. Utilizamos o equipamento “PhastSystem” - Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden.
À uma alíquota de 2l do produto da reação de PCR para os respectivos exons e códons dos genes EGFR e K-Ras, respectivamente, foram adicionados 2l de uma solução contendo formamida 95%, EDTA a 10mM pH 8,0, azul de bromofenol 0,1% e xileno cianol 0,1%. Esta mistura foi desnaturada a 95ºC por 5 minutos, mantida em gelo até o momento da aplicação. Foram utilizados géis de poliacrilamida 20% homogêneo (PhastGel- GE Healthcare). Uma pequena alíquota de 0,3l de cada paciente foi aplicada no gel de poliacrilamida, a corrida foi realizada em tampão (PhastGel Native Buffer Strips- GE Healthcare), sob as seguintes condições, segundo dados de Mohabeer e colaboradores em 1991, foram:
Exons 20 do gene EGFR:
1- Pré Corrida: 400V; 10mAmp; 2,5W; 15ºC; 150Vh;
2- Aplicação das amostras: 400V; 1mAmp; 2,5W; 15ºC; 2Vh; 3- Corrida: 400V; 10mAmp; 2,5W; 15ºC; 200Vh.
Exon 21 do gene EGFR e códons 12 e 13 do gene K-Ras:
1- Pré Corrida: 400V; 10mAmp; 2,5W; 15ºC; 150Vh;
2- Aplicação das amostras: 400V; 1mAmp; 2,5W; 15ºC; 2Vh; 3- Corrida: 400V; 10mAmp; 2,5W; 15ºC; 150Vh.
As diferentes condições de voltagem, temperatura e voltagem/hora foram as que possibilitaram melhor padrão de migração eletroforética no SSCP.
Finalizada a corrida eletroforética, coramos os géis da seguinte forma:
1- Cinco minutos a 26ºC no ácido tricloroacético 20% (fixação); 2- Três minutos a 50ºC no glicerol 13% (preservação);
3- Cinco minutos a 50ºC no glutaraldeído 25% (sensibilizador); 4- Duas lavagens de dois minutos a 50ºC em água deionizada; 5- Oito minutos a 40ºC em Nitrato de Prata 0,4% (coloração);
6- Cinco minutos a 30ºC em uma solução de Carbonato de Sódio 5% mais 90l de
formaldeído (revelador);
7- Dois minutos a 50ºC de Ácido acético 5% (bloqueia a reação).
3.4- Sequenciamento (Método Sanger)
O sequenciamento direto dos fragmentos da PCR foi realizado em amostras representativas de DNA de padrões diferentes de migração pela técnica SSCP em gel de poliacrilamida 20% (PhastSystem - GE). Os exons 18 e 19 do gene
EGFR foram sequenciados diretamente, sem a triagem pela técnica PCR-SSCP.
Após a purificação da PCR com o Kit GFX PCR DNA and gel band purification Kit - (GE Healthcare), foi feita a quantificação do produto da PCR purificada em gel de agarose 1,5%, aplicando-se 2μl do Low DNA Mass Ladder (Fermentas, Life Sciences) mais 2μl do azul de bromofenol (MERCK) no primeiro poço. Nos demais poços foram aplicados, 2μl das amostras com 2μl do azul de bromofenol (MERCK). A eletroforese foi realizada em aproximadamente 100ml de tampão TEB a 90 volts por 20 minutos.
Tendo como resultado a quantificação de cada banda em ng/μl, foi calculada a reação de sequenciamento usando-se 30ng da PCR purificada, 1μl do iniciador na concentração de 1,6pmol, 1µl do tampão, 1μl de BigDye (BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 3.0 with AmpliTaq DNA Polymerase, FS- Applied Biosystems) que contém: dNTPs, ddNTPs, AmpliTaq DNA
polimerase, MgCl2, tampão Tris-HCl) e quantidade necessária de água para
completar 10μl. Os primers utilizados foram os mesmos da reação de PCR, diferindo apenas na concentração (1,6pmol).
A reação de sequenciamento consistiu de um ciclo de 96ºC por 10 segundos; 25 ciclos de 96ºC por 20 segundos; 63ºC por 20 segundos; 60ºC por 4 minutos; o último ciclo foi prolongado por 10 minutos no aparelho termociclador de temperatura PTC-100 (MJ - RESEARCH).
Ao final dos ciclos, a reação de sequenciamento foi purificada com etanol 100% e 70%.
O sequenciamento foi realizado em sequenciador automatizado ABI PRISM modelo 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Os fragmentos marcados com fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e à medida que são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda que são detectados por um fotomultiplicador. Em seguida essa informação é transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma.
Cada eletroferograma foi comparado com as sequências depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), admitindo-se concordância de no mínimo 95% para confirmação da especificidade da sequência.
3.5- Clonagem
As amostras que tiveram alterações, ou melhor, mutações do tipo frameshift no sequenciamento, com exceção da mutação pontual, foram clonadas com o Kit p-Gem Easy System II (Promega) para análise confirmatória.
O Kit pGEM-T-easy (Promega) contém um plasmídeo linear que possui uma desoxitimidina (T) em cada uma de suas extremidades 3’ e permite a inserção direta de produtos de PCR adenilados, pela enzima T4 DNA ligase.
O primeiro dia foi denominado de ligação, a mistura de: 1,5 a 3µl da PCR (dependendo da banda) mais 5µl do tampão de ligação para a enzima T4 DNA ligase (2X concentrada) mais 1µl do vetor (plasmídeo) mais 1µl da enzima T4 ligase (6U) e água para completar o volume total de 10µl foi incubada por uma hora a temperatura ambiente ou “overnight” a 4ºC.
O segundo dia, chamado de transformação, as células competentes de
Escherichia coli DH5 (Promega) estocadas a -80°C foram descongeladas e foi
adicionado 5µl do produto de ligação, homogeneizou-se gentilmente e a mistura foi mantida por 30 minutos no gelo.
Em seguida, estas misturas foram incubadas a 42ºC em Banho Maria por 1 minuto e 30 segundos (choque térmico), e foram transferidas novamente para o gelo e incubadas por 2 minutos.
Novamente no fluxo laminar, foi adicionado 800µl do meio SOC (é usado em biologia molecular para o cultivo de cepas recombinantes de E. coli) ou LB (Luria Bertani) no tubo contendo as células transformadas com as reações de ligação. As novas misturas foram mantidas sob agitação a 350rpm (rotações por minuto) no shaker a 37ºC por 1 hora.
Meia hora antes de retirada da amostra do shaker, foi colocado na placa Petri contendo meio LB sólido suplementado com 10µl do antibiótico ampicilina a 100mg/ml-1, 35µl de X-gal (50mg) e 20µl de IPTG (0,5M) que são meios seletivos. Essa placa ficou em repouso, por no mínimo 30 minutos, antes de plaquear a amostra.
A amostra foi retirada do shaker e centrifugada por 1 minuto a 8.000rpm. No fluxo laminar, 600µl do sobrenadante foi descartado. O pellet foi suspenso no volume restante e 120µl do pellet foi plaqueado na placa de Petri com meio LB sólido tratado com ampicilina e meios seletivos: X-gal e IPTG.
A placa foi colocada na estufa a 37ºC overnight.
Na manhã seguinte a placa foi retirada, embrulhada em filme plástico e levada à geladeira. O processo de seleção das colônias foi realizado no final da tarde.
Antes da seleção das colônias, uma placa cell star (Greiner Bio-One-U-shape, with LID, plate 96 well, sterile), foi separada contendo 120µl do meio LB líquido com ampicilina em cada poço [exemplo: 20ml de LB + 20µl de ampicilina (concentração de 50mg/ml)].
Na placa de Petri, cresceram colônias brancas e azuis, a seleção das colônias foi realizada com a ajuda de um palito de dente, somente as colônias brancas (com possíveis genes recombinantes ou clones positivos) foram selecionadas e colocadas nos devidos poços da placa cell star. Para cada colônia/um poço da placa, até completar os 96 poços.
A placa cell star foi tampada e vedada com filme plástico e levada ao shaker a uma rotação de 130rpm a 37ºC overnight.
No dia seguinte, foi realizada a PCR dos 96 poços com os iniciadores dos plasmídeos M13 ou T7 e SP6, na concentração de 5pmol e 10pmol, respectivamente.
O produto da PCR foi corrido em gel de agarose 2%. Foram escolhidas as amostras que apresentaram uma banda diferente no gel e a Reação de Sequenciamento foi realizada, utilizando-se os iniciadores do plasmídeo a 1,6pmol, com temperatura de anelamento do plasmídeo a 54ºC, por 25 ciclos.
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o método de didesoxinucleotídeo marcado com fluoróforo. O sequenciador automático ABI PRISM modelo 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante.
A placa cell star foi guardada para possíveis repetições das PCRs, em freezer -80ºC. Foi adicionado 40µl de glicerol a 70% em cada poço a fim de preservar o plasmídeo.
3.6- Técnica de Imunoistoquímica (IH)
A análise da expressão das proteínas EGFR e K-Ras foram realizadas pela técnica IH, método indireto, em cortes de tecidos tumorais retirados do bloco de parafina, após o diagnóstico informado pela anatomia patológica.
Os tumores emblocados em parafina tiveram seus cortes histológicos feitos em micrótomo a uma espessura de três micrômetros e colocados em banho-maria a 42oC. A seleção dos cortes em suspensão no banho-maria se fez com lâminas histológicas silanizadas.
Essas lâminas silanizadas com o tecido aderido foram levadas para estufa (60ºC) por no mínimo 1 hora (de 1 a 2 horas), antes de começar a desparafinização.
Para a desparafinização e reidratação dos cortes, as lâminas foram imersas em xilol, a 60oC por 30 segundos, posteriormente imergidas novamente em xilol a temperatura ambiente (2 vezes) e em álcool absoluto (3 vezes), por último em álcool 80% e álcool 50%.
Finalmente, fez-se a lavagem em água corrente por 5 minutos. Após a lavagem, o bloqueio da peroxidase endógena foi feita trocando-se a água oxigenada - H2O2 - 10%de 3 em3 minutos.
Novamente, fez-se uma lavagem em água corrente por 5 minutos e procedeu-se da seguinte forma:
1- Para EGFR, foi feita a digestão enzimática com proteinase K (Dako - ready to
use) por 13 minutos a 37ºC. As lâminas foram lavadas três vezes com tampão PBS;
2- Para K-Ras, foi feita a recuperação antigênica na panela de vapor,
com a incubação das lâminas por 30 minutos em tampão citrato 10mM, pH 6,0 a 95ºC ou Tris-EDTA 1Mm pH8,9. Após a incubação, as lâminas foram resfriadas à temperatura ambiente por 20 minutos, lavada em água corrente e colocada em tampão PBS.
O bloqueio da proteína foi feito com leite em pó desnatado (3g de leite diluídos em 100ml de água) por 30 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação foram realizadas lavagens em água destilada e PBS de 5 minutos cada.
As incubações das lâminas foram feitas com anticorpos primários diluídos com diluente da Dako em câmara úmida na estufa a 37ºC por 30 minutos; EGFR - Anticorpo monoclonal, clone H11, Dako (1:50; controle positivo:
adenocarcinoma de pulmão); K-Ras anticorpo policlonal, Spring Bioscience (diluição 1:150; controle positivo: tumor de próstata). Após a incubação em estufa, colocou-se overnight na geladeira a 4°C.
As lâminas foram retiradas da incubação com anticorpo primário e foram realizadas três lavagens com PBS, no agitador, de 5 minutos cada a temperatura ambiente.
As lâminas foram secas com papel de filtro, para retirar o excesso de PBS e a incubação com o anticorpo secundário (ADVANCE - HRP Link- Dako) se deu por 30 minutos a 37ºC.
Após a incubação, as lâminas foram lavadas por três vezes com PBS (5 minutos cada, à temperatura ambiente) e secas com papel de filtro para retirar o excesso de PBS.
A incubação com anticorpo polimerizado (ADVANCE - HRP Enzyme - Dako) foi realizada por 30 minutos a 37ºC (estufa) e lavadas 3 vezes por 5 minutos em PBS à temperatura ambiente.
Terminadas as lavagens, as lâminas foram colocadas em tampão PBS e o substrato cromógeno foi preparado: (1gota de DAB cromógeno + 1ml de tampão substrato - Dako).
A contra coloração foi feita com Hematoxilina de Mayer, por 10 a 30 segundos, as lâminas foram lavadas em água corrente e em água destilada e foram incubadas por 3 segundos em água amoniacal e nova lavagem em água corrente. As lâminas foram desidratadas e montadas com resina apropriada entellan (Merck).
As análises dos níveis de proteína foram observadas levando-se em consideração dois escores: I- porcentagem (%) de células tumorais positivas para um dado marcador; e II- Intensidade da imunocoloração. O escore final é dado pela soma dos escores I + II. Os escores foram dados conforme o quadro 2 abaixo, analisado em microscópio óptico comum, com objetiva de 40X:
Quadro 3- Escores para as análises das proteínas (células tumorais e
Imunocoloração).
I- % de células tumorais positivas II- intensidade da imunocoloração
0 negativo 0 negativo
1 até 25% das células + 1 leve
2 25-50% 2 moderada
3 50-75% 3 intensa
4 mais de 75% das células +
Assim, os escores finais somam 0, 2 a 7. Para realização posterior de análises estatísticas, os casos são considerados:
NEGATIVOS: escores finais 0 e 2 POSITIVOS: escores finais 3 a 7.
As lâminas de IH foram analisadas pelo conceituado patologista Prof. Dr. José Vassallo.
3.7- Análise Estatística
Os dados foram processados com o software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). As variáveis quantitativas foram apresentadas na forma de média, desvio padrão (DP), mínimo, mediana e máximo. As variáveis qualitativas foram apresentadas em tabelas contendo as frequências absoluta e relativa.
A associação entre as mutações nos genes EGFR, K-Ras e as características clínicas patológicas foram analisadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. A comparação das distribuições das variáveis quantitativas foi feita por meio do teste de Mann-Whitney (dois grupos independentes). Em todos os casos adotou-se o nível de significância de 5% (p≥0,05).
Análise de sobrevida foi realizada no grupo de quimioterapia citotóxica e no grupo de terapia alvo. Nesta análise considerou-se como “evento” a ocorrência de óbito devido ao tumor ou como consequência direta do tratamento instituído.
Os pacientes que não apresentaram o evento foram classificados como "censura". A data de início da observação para cada indivíduo (T0), foi definida como a data da primeira sessão de QTX. A data final foi a do óbito quando ocorreu o evento ou a data do final do estudo nos casos de censura. O tempo de observação de cada sujeito foi determinado a partir destas duas datas. A sobrevida foi estimada empregando-se o método de Kaplan-Meier. O teste Log-Rank foi aplicado para avaliar se as curvas diferiam entre categorias de uma mesma variável.
RESULTADOS
4.1- População total
Foram incluídos inicialmente, de forma prospectiva, 151 pacientes com CPNPC, em todos os estádios, que foram atendidos e tratados no Ambulatório de Oncopneumologia/FCM/UNICAMP, no período de agosto de 2009 a junho de 2012. Na análise das mutações do gene EGFR e K-Ras e das expressões proteicas do EGFR e K-Ras, foram excluídos casos em que o material das biópsias foi insuficiente para análise, resultando casuística diferente.
4.1.1- Análise da mutação no gene EGFR
Foram excluídos 22 casos, sendo analisados um universo de 129 pacientes. Houve predomínio do sexo masculino (68,2% 88/129), média de idade foi de 65,5 anos (41-85 anos), para os homens 65,4 anos (41-84 anos) e para as mulheres 65,6 anos (43-85 anos). Em relação à raça, não tivemos pacientes de origem oriental e houve um predomínio de pacientes brancos sobre não brancos (negros e pardos), respectivamente 86,0% (111/129) e 14,0% (18/129). A maioria dos pacientes era fumante ou ex-fumante (82,2%; 106/129).
O carcinoma epidermóide correspondeu a 46,5% (60/129) dos casos, o adenocarcinoma a 40,3% (52/129) e 13,2% (17/129) foram classificados apenas como carcinoma não pequenas células. A mutação no gene EGFR foi encontrada em 9 pacientes (7,0%; 9/129), sendo seis deleções no exon 19 e três mutações de ponto no exon 21. Todos os tumores eram adenocarcinoma e sete pacientes nunca haviam fumado (Ilustração 2).
4.1.2- Análise da mutação no gene K-Ras
Foram excluídos 25 casos, resultando no universo de 126 pacientes, a média de idade foi de 65,7 anos (41-85 anos), para os homens 65,7 anos (41-84 anos) e para as mulheres 65,3 anos (43-85 anos). Houve predomínio do sexo
