A figura 26 (Painel A) mostra que não houve diferença na marcação de E-selectina entre os grupos estudados.
No painel B mostramos aumento na expressão de ICAM-1 no endotélio pulmonar de ratos do grupo FA 15 e redução no grupo FA/OVA em relação à expressão observada no grupo basal. Notamos também aumento na marcação de ICAM-1 no endotélio pulmonar de ratos do grupo FA 15 em relação ao grupo FA. Com relação ao grupo FA/OVA, observamos redução na expressão de ICAM-1 em comparação com os grupos FA, FA 15 e OVA/OVA. Ainda, não houve diferença na marcação de ICAM-1 nos grupos FA e OVA/OVA em relação ao basal.
O painel C mostra aumento na marcação de PECAM-1 em endotélio pulmonar de ratos dos grupos FA, FA 15 e OVA/OVA em relação ao grupo basal. Notamos também, redução na expressão de PECAM-1 no endotélio pulmonar de ratos do grupo FA/OVA em relação aos grupos FA, FA 15 e OVA/OVA.
Como pode ser observado, o painel D mostrou aumento na expressão de VCAM-1 em endotélio pulmonar de ratos dos grupos FA, FA 15 em relação ao grupo basal. Verificamos ainda, redução na expressão de VCAM-1 em endotélio pulmonar de ratos do grupo FA/OVA em relação aos grupos FA, FA 15, OVA/OVA e basal.
0 50 100 150 200 Basal FA 15 FA FA/OVA OVA/OVA E-selectinaA U ni da de s ar bi tr ár ia s 0 50 100 150 200 ICAM-1 * * ∆ ∆ ϕθ B U ni da de s ar bi tr ár ia s 0 50 100 150 200 PECAM-1 * * ∆ϕ * θ C U ni da de s ar bi tr ár ia s 0 50 100 150 200 VCAM-1 * * * * ∆ ∆ ϕ θ D U ni da de s ar bi tr ár ia s
Figura 26. Expressão de moléculas de adesão no pulmão. Grupos de ratos foram expostos ou não à inalação
com FA (90 min/dia, 3 dias, 1%) e imunizados e desafiados ou não com OVA. Após 24 h ou 15 dias da última exposição ao FA ou 24 h após o desafio antigênico com OVA os pulmões foram retirados e congelados para realização de imunohistoquímica. Os dados representam a média ± EPM de 4 animais. *p<0,05 em relação ao grupo basal; Δp<0,05 em relação ao grupo FA; φp<0,05 em relação ao grupo FA 15 e θp<0,05 em relação ao grupo OVA/OVA.
Figura 27. Expressão de E-selectina em pulmão de ratos alérgicos ou não e expostos à inalação com formaldeído. Grupos de ratos foram expostos ou não à inalação com FA (90 min/dia, 3 dias, 1%) e
imunizados e desafiados ou não com OVA. Após 24 h ou 15 dias da última exposição ao FA ou 24 h do desafio antigênico com OVA, os pulmões foram retirados para realização de imunohistoquímica. Coloração hematoxilina (40X).
Basal
FA FA 15
FA/OVA OVA/OVA
Figura 28. Expressão de ICAM-1 em pulmão de ratos alérgicos ou não e expostos à inalação com formaldeído. Grupos de ratos foram expostos ou não à inalação com FA (90 min/dia, 3 dias, 1%) e
imunizados e desafiados ou não com OVA. Após 24 h ou 15 dias da última exposição ao FA ou 24 h do desafio antigênico com OVA, os pulmões foram retirados para realização de imunohistoquímica. Coloração hematoxilina (40X).
Basal
FA
FA 15
FA/OVA
OVA/OVA
Figura 29. Expressão de PECAM-1 em pulmão de ratos alérgicos ou não e expostos à inalação com formaldeído. Grupos de ratos foram expostos ou não à inalação com FA (90 min/dia, 3 dias, 1%) e
imunizados e desafiados ou não com OVA. Após 24 h ou 15 dias da última exposição ao FA ou 24 h do desafio antigênico com OVA, os pulmões foram retirados para realização de imunohistoquímica. Coloração hematoxilina (40X).
Basal
FA
FA 15
FA/OVA
OVA/OVA
Figura 30. Expressão de VCAM-1 em pulmão de ratos alérgicos ou não e expostos à inalação com formaldeído. Grupos de ratos foram expostos ou não à inalação com FA (90 min/dia, 3 dias, 1%) e
imunizados e desafiados ou não com OVA. Após 24 h ou 15 dias da última exposição ao FA ou 24 h do desafio antigênico com OVA, os pulmões foram retirados para realização de imunohistoquímica. Coloração hematoxilina (40X).
Basal
FA
FA 15
FA/OVA
OVA/OVA
5 DISCUSSÃO
Neste estudo investigamos o efeito da inalação de FA sobre o estado funcional de fagócitos pulmonares (mononucleares e neutrófilos) e da medula óssea obtidos de ratos submetidos à inflamação alérgica pulmonar. Utilizando rato como modelo experimental, realizamos culturas de células do LBA e do LF obtidas de animais alérgicos ou não e expostos à inalação com FA (1%, 3 dias, 90 min/dia). Amostras de sobrenadante destas culturas celulares foram recolhidas 1 h ou 24 h após a adição ou não de estímulo secundário (PMA ou LPS) para quantificação de mediadores inflamatórios. Dessa forma, avaliamos a interferência do FA sobre a geração de mediadores inflamatórios causada pela alergia. Além disso, os experimentos realizados com células incubadas com PMA ou LPS permitiram avaliar se estímulos adicionais poderiam gerar novas ondas de liberação de mediadores inflamatórios. Em nossos estudos quantificamos TNF-α, NO2, H2O2, LTB4, TXB2 e PGE2, vistos serem estes
mediadores inflamatórios criticamente envolvidos na doença alérgica pulmonar. Além disso, são responsáveis pelo desencadeamento de eventos como recrutamento e ativação de células inflamatórias para as vias aéreas, perda do epitélio brônquico e reatividade exacerbada do músculo liso, características da asma (BICE et al., 2000). Utilizamos também amostras de sobrenadante de cultura pulmonar (explante) recolhidas 4 ou 24 h após adição ou não de LPS e quantificamos IL-1β, IL-10 e IL-4. Os estudos conduzidos utilizando a técnica de explante pulmonar são interessantes na mediada em que permitem a análise de geração continuada de mediadores pelo pulmão. Assim, é possível analisar conjuntamente o estado funcional das células estruturais e daquelas recrutadas para o pulmão sem influência de mecanismos reguladores da inflamação observados in vivo. Dessa forma, estudamos o controle inflamatório localmente.
A proposta apresentada nesse estudo dá continuidade àquela onde avaliamos o curso da resposta inflamatória alérgica pulmonar após a exposição de ratos ao FA, focando a migração celular e a reatividade das vias aéreas (FRANCO, 2004). Neste trabalho ampliamos o estudo e investigamos os mecanismos acionados pelo FA que possam orquestrar a inflamação alérgica pulmonar e que interfiram com a funcionalidade de fagócitos.
Nossos resultados anteriores mostraram que, isoladamente, o FA e a OVA induzem inflamação pulmonar. Porém, o FA causa hiporreatividade brônquica e a OVA discreta hiperreatividade in vitro a metacolina (FRANCO, 2004). Á partir desses resultados avaliamos a inflamação alérgica pulmonar em ratos previamente submetidos à inalação com FA. Os resultados revelaram que a inalação com FA reduz o número de células presentes no LBA de animais alérgicos. Todavia, estes animais apresentaram hiperreatividade das vias aéreas superiores e hiporreatividade das vias aéreas inferiores in vitro a metacolina (FRANCO, 2004).
Assim, sugerimos que o FA afeta as células residentes pulmonares (macrófagos e/ou mastócitos), as quais poderiam orquestrar a resposta inflamatória pulmonar, por meio da liberação de mediadores inflamatórios. Baseados nesses achados fomos avaliar o estado funcional das células recrutadas para o pulmão tanto após a inalação dos ratos com FA, como também na vigência do desafio alérgico. Adicionalmente, estudamos o potencial efeito dessas condições experimentais sobre a atividade das células da medula óssea.
Avaliamos inicialmente a liberação de nitritos após exposição ao FA, haja vista o envolvimento do NO na magnitude da resposta contrátil das vias aéreas observada em estudos anteriores (LINO DOS SANTOS FRANCO et al., 2006). Nossos dados com células do LBA indicaram que o FA induziu aumento na geração de NO2 e que macrófagos alveolares parecem
ser a sua maior fonte geradora, visto a expressiva diferença na liberação de NO2 obtida pelas
células totais do LBA, onde há predomínio de macrófagos alveolares e na discreta liberação de NO2 observada pela cultura de neutrófilos isolados (Fig. 1). De fato, é sabido que macrófagos
alveolares liberam quantidades apreciáveis de NO (MEYER-HOFFERT et al., 2003). Outros autores também associaram inflamação das vias aéreas inferiores de crianças expostas a níveis domésticos altos de FA a um aumento do NO exalado. Estes autores sugeriram que possivelmente, o FA cause inflamação e indução da i-NOS (NO sintase indutível) (FRANKLIN et al., 2000).
O tratamento prévio dos ratos expostos ao FA com L-NAME, inibidor não seletivo da NO sintase, inibiu significativamente a hiporreatividade brônquica a metacolina, mas não afetou o recrutamento de neutrófilos no LBA (LINO DOS SANTOS FRANCO et al., 2006), sugerindo a existência de distintos mecanismos modulados pelo NO e que estejam envolvidos no controle do recrutamento celular e da reatividade das vias aéreas.
Com respeito à interação FA/OVA, nossos dados indicaram que o FA potencializou a liberação espontânea de NO2 pelas células totais do LBA de animais alérgicos (Fig. 1A).
Todavia, não observamos este mesmo efeito nos neutrófilos (Fig. 1B). Assim, nossos resultados parecem sugerir que na interação FA/OVA, os macrófagos alveolares poderiam também ser os responsáveis pelo aumento da liberação de NO2. Cultura de células do LBA de
animais expostos ao FA e mortos 15 dias após a última inalação (grupo FA 15), portanto no mesmo período da sensibilização dos ratos à OVA (veja métodos), não apresentaram aumento na liberação de NO2 (Fig. 1A). Deste modo, é razoável supor que o FA modifique o estado
funcional de macrófagos alveolares, tornando-os mais reativos a um segundo estímulo. Ressalte-se que animais alérgicos, quando submetidos previamente à inalação com FA, desenvolveram reduzida inflamação alérgica pulmonar (FRANCO, 2004). Nesse contexto, foi interessante observar o aumento significativo na liberação de NO2 pelas culturas de células de
animais do grupo FA/OVA que não apresentaram influxo de células inflamatórias no espaço alveolar. Além disso, observamos hiporreatividade brônquica nesses animais, que eventualmente pode ser devida ao aumento na liberação de NO2 (Fig. 1A). É bem estabelecido
que o NO exerce efeito relaxante sobre a musculatura lisa vascular e não vascular, bem como na regulação das interações leucócito-endotélio (HICKEY e KUBES, 1997; RICCIARDOLO et al., 2006). Assim, nossos dados sugerem que o FA modifique funções metabólicas de macrófagos alveolares, as quais podem ser relevantes para doenças respiratórias, agindo distintamente no recrutamento celular pulmonar e na reatividade do músculo liso das vias aéreas. De fato, Adams et al. (1987) mostraram que a exposição de camundongos ao FA induz macrófagos a liberarem H2O2.
É sabido que agentes químicos e poluentes ambientais induzem formação de espécies reativas do oxigênio (EROs) (KUM et al., 2007). Há muitas fontes intracelulares para produção de EROs, entre elas mitocôndria, enzimas como lipoxigenase, cicloxigenase, xantina oxidase e NADPH oxidase (CROSS e JONES, 1991). Sendo o FA um gás altamente reativo, poderia, portanto reagir com diversas estruturas biológicas, como lipídios, DNA, RNA, esteróides entre outras. Estudos realizados por Lin et al. (2005) revelaram que o FA age sinergicamente com o H2O2 causando lesão nas células endoteliais.
Neste estudo tivemos indicações que o H2O2 liberado pelas células dos grupos FA, FA
de neutrófilos em cultura, não observamos aumento significativo da geração de H2O2,
estimulada ou não com PMA (dados não mostrados). Como hipótese, sugerimos que macrófagos alveolares sejam os responsáveis por esta produção. Estudos realizados por Cuschieri et al. (2005) mostraram que a exposição de macrófagos as EROs, notadamente, H2O2, promove reprogramação celular, alterando a resposta celular a estímulos inflamatórios e
aumentando a produção de mediadores inflamatórios. Macrófagos parecem ser sensíveis aos efeitos das EROs (CUSCHIERI et al., 2005). Apesar do mencionado, não podemos descartar a participação de neutrófilos na geração de H2O2, visto que eventualmente, o ânion superóxido
ou o NO, originados de neutrófilos, ainda que em pequenas concentrações, poderiam contribuir para a formação de H2O2. Para avaliar esta sugestão, tratamos os animais com
vimblastina, um agente imunomodulador que depleta fagócitos (SINGER et al., 2002). Nossos resultados indicaram o envolvimento dos neutrófilos sobre o estado funcional de macrófagos alveolares. De fato, a redução de neutrófilos circulantes causada pelo tratamento com vimblastina reduziu significativamente a liberação de H2O2 apenas no grupo FA (Fig. 17).
Assim, é razoável supor que mediadores originados de neutrófilos podem alterar o metabolismo de macrófagos. Estudos realizados por Janardhan et al. (2006) mostraram que a depleção de neutrófilos circulantes inibe o aumento do número de macrófagos na inflamação pulmonar decorrente da instilação intratraqueal de LPS, indicando que, de fato, há uma importante interação destas células no controle da inflamação pulmonar. Apesar de interessante, este dado deve ser visto com cautela, pois a vimblastina exerce marcante ação mielosupressora (SINGER et al., 2002) e nesse sentido, dentre seus efeitos poderia haver redução também de células mononucleares. Portanto, no contexto dos nossos achados a redução na liberação de H2O2 poderia estar relacionada também com a redução no número de
mononucleares. Por outro lado, é importante mencionar que o tratamento dos ratos com vimblastina no nosso modelo, não alterou o número de mononucleares circulantes.
De forma geralnossos resultados mostrando que o FA induz liberação de H2O2 (Fig. 3)
estão de acordo com Dean et al. (1984), os quais mostraram que a exposição de camundongos ao FA durante 21 dias (6h/dia, 15ppm), aumenta a liberação de H2O2 pelos macrófagos,
aumento este associado à elevada atividade microbicida dessas células. No entanto, não podemos deixar de ressaltar as diferenças nas concentrações e no tempo de exposição dos animais ao FA entre os modelos. Além disso, 15 dias após a última exposição ao FA (grupo
FA 15), níveis elevados de H2O2 ainda puderam ser quantificados (Fig. 3). Esses dados
sugerem um efeito do FA sobre a atividade funcional de macrófagos alveolares que parece ser mantido ao longo dos dias após a cessação da exposição ao FA. Estudos realizados por Saito et al. (2005) demonstraram que o FA é capaz de gerar EROs pela ligação em proteínas do DNA, um fato que reveste de importância os nossos achados, visto o potencial efeito do FA sobre o genoma.
A geração de EROs pelo FA parece estar relacionada também com a redução de glutationa celular (TENG et al., 2001). É digno de nota que a enzima glutationa é dependente da formaldeído desidrogenase bem como da s-nitrosoglutationa redutase (XIONG et al., 1999). Além disso, o NO reagindo com a glutationa forma s-nitrosoglutationa, a qual possui ação broncodilatora e pode também afetar a sinalização molecular, fatores de transcrição, síntese de enzimas entre outras (GERARD, 2005).
É importante mencionar que a redução da glutationa aumenta os efeitos citotóxicos do H2O2 e de oxiradicais (CUZZOCREA et al., 1998). A glutationa é um dos maiores
constituintes do sistema antioxidante e exerce seus efeitos também em conjunto com outras enzimas como glutationa peroxidase (TAKEBE et al., 2002). Assim, apesar de não haver quantificado os níveis de glutationa, os nossos achados permitem supor que na presença do FA ocorra redução na sua atividade, aumentando assim, a geração espontânea de H2O2 e de NO.
No contexto da geração de EROs, o peroxinitrito merece destaque. De fato, o peroxinitrito é produto da reação entre ânion superóxido e NO gerados durante a inflamação e exerce importante efeito citotóxico (KIM et al., 2005). Além disso, estudos mostram efeitos moduladores do peroxinitrito sobre a liberação de outros mediadores inflamatórios, tais como histamina e leucotrienos em mastócitos ativados (KIM et al., 2005). Sugerimos adicionalmente, que o FA exerça parte de seus efeitos tóxicos por meio da liberação de peroxinitrito; concordando com essa sugestão é o fato de que o FA causa aumento tanto na liberação de H2O2 quanto de NO. De maneira a investigar indiretamente o potencial
envolvimento desse radical derivado do NO em nosso modelo de inflamação avaliamos a expressão de proteínas nitradas em resíduos de tirosina, a qual é considerada um indicador da produção de peroxinitrito in vivo. Nestes estudos constatamos que o FA promoveu aumento na nitração de proteínas em homogenatos de pulmão, o qual pôde ser observado após 15 dias da última exposição dos ratos ao FA (Fig. 5). Ainda, a interação FA/OVA também promoveu
aumento na nitração destas mesmas proteínas, entretanto em menor intensidade quando comparada a obtida nos grupos FA e FA 15. Vale lembrar que outros compostos reativos também podem causar nitração de proteínas; por exemplo, o ácido hipocloroso originado a partir da mieloperoxidase. Assim, apesar da inespecificidade do método, este experimento permite avaliar o estresse oxidativo após exposição ao FA sem, contudo afirmar que o composto responsável por tal efeito é o peroxinitrito.
De forma geral, observamos que o FA induziu estresse oxidativo, evidenciado pelo aumento de espécies reativas derivadas do oxigênio (H2O2) e espécies reativas derivadas do
nitrogênio (NO2 e supostamente o peroxinitrito). Além disso, os efeitos do FA parecem ser
persistentes, uma vez que após 15 dias da última inalação dos ratos com FA os níveis de H2O2
gerados pelas células em cultura, bem como a nitração de proteínas permaneceram aumentadas (Figuras 3 e 5). A menor intensidade na nitração observada no grupo FA/OVA pode ser atribuída ao segundo estímulo inflamatório de origem alérgica, o qual parece alterar a sinalização redox desencadeada pela exposição ao FA. Outra possibilidade para justificar a menor intensidade de nitração no grupo FA/OVA é que tenha ocorrido a conversão do peroxinitrito em nitrito, o que inclusive explicaria o aumento observado na liberação de NO2
no grupo FA/OVA. O estresse oxidativo parece ser relevante para doenças inflamatórias pulmonares como a asma (BARNES, 2000; BLESA et al., 2002). Evidências clínicas e experimentais indicam que o desequilíbrio do sistema oxidante/antioxidante potencialmente causa danos a diversas estruturas biológicas. As EROs são importantes mediadores na lesão celular e desempenham papel essencial no estresse oxidativo, podendo contribuir para o desencadeamento e/ou exacerbação de diversas doenças, incluindo a asma (MATSUZAWA e ICHIJO, 2008).
Em estudos anteriores, mostramos que a exposição de ratos ao FA aumentou o número de células no baço e no sangue periférico Em contraste, não afetou a celularidade da medula óssea (LINO DOS SANTOS FRANCO et al., 2006). Por outro lado, o grupo FA/OVA apresentou redução no número de células na medula óssea, sugerindo potencial efeito imunomodulador do FA, o qual torna-se observável após o segundo estímulo (ovoalbumina). Eventualmente, este efeito do FA sobre a medula óssea pode estar associado à redução no influxo celular pulmonar observado no grupo FA/OVA (FRANCO, 2004). Por causa disso,
assumimos que o FA apesar de haver sido inalado, pode também exercer efeitos sistêmicos. Com relação à liberação de NO2 e H2O2 pelas células da medula óssea, notamos aumento
significativo após a exposição dos animais ao FA apenas quando as culturas de células foram estimuladas (com LPS ou PMA) (Figuras 2 e 4), sugerindo a necessidade de um segundo estímulo para o desencadeamento da resposta. Ainda, a liberação de H2O2 pelos fagócitos da
medula óssea de animais alérgicos parece ser alterada pela exposição ao FA. De fato, as células da medula óssea dos animais do grupo FA/OVA reduziram a liberação de H2O2 (Fig.
4). É digno de nota que as células da medula óssea do grupo FA no momento da sensibilização com OVA estão produzindo quantidades apreciáveis de IL-10, citocina antiinflamatória que poderia modular negativamente a resposta a OVA (Fig. 16).
Considerando que o FA gera estresse oxidativo, seqüencialmente exploramos o papel das espécies reativas sobre o estado funcional das células em cultura. A nossa expectativa era de que as EROs geradas em decorrência da exposição dos ratos ao FA, poderiam alterar o metabolismo dos fagócitos, tornando-os mais responsivos a estímulos secundários ou ainda aumentando a intensidade e o período de liberação de seus mediadores. Assim, tratamos os animais com vitamina C (ácido ascórbico) e vitamina E (α-tocoferol), as quais têm importante papel no seqüestro de espécies reativas (DI MASCIO et al., 1991). Além disso, estes antioxidantes previnem a peroxidação lipídica e a lesão celular (OZDIL et al., 2004). Nesta série de experimentos priorizamos a quantificação de NO2, H2O2 e LTB4 porque culturas de
células do LBA apresentaram aumento espontâneo destes mediadores após exposição ao FA (Figuras 1, 3 e 6).
Recentes estudos demonstram que antioxidantes reduzem a inflamação pulmonar e hiperreatividade brônquica em modelo de asma (LEE et al., 2007). Nesses estudos, o tratamento com N-acetilcisteína de camundongos sensibilizados com OVA, reduziu a geração de EROs, citocinas Th2, VEGF, a permeabilidade vascular, a produção de muco e a resistência
pulmonar. Os autores concluíram que este tratamento atenuou a inflamação e hiperreatividade brônquica devido a diminuição da geração de EROs e também pela modulação sobre a ativação do NFκB e HIF-1α.
Os nossos dados indicando a redução na liberação das espécies reativas (H2O2, NO2) pelas células do LBA pode ser considerada como uma confirmação da eficácia do tratamento
com estes antioxidantes após exposição ao FA. Estes tratamentos também reduziram os níveis de LTB4 e o número de células totais presentes no LBA de animais expostos ao FA (Fig. 18A).
Há de se considerar que EROs não são apenas toxicantes, mas também podem funcionar como segundos mensageiros sinalizando vias intracelulares, tais como MAP quinases, JNK, ASK1 entre outras (MATSUZAWA e ICHIJO, 2008). Ainda, a regulação do estado redox da célula é crítica para determinar sua viabilidade, ativação, proliferação e função do órgão (YAO et al., 2007). Assim, podemos supor que as EROs geradas após exposição ao FA poderiam estar sinalizando vias envolvidas com a geração de mediadores inflamatórios.
As EROs têm sido implicadas na modulação da resposta inflamatória pulmonar pela ativação de fatores de transcrição, tais como NFκB, AP-1, MAP quinases, PI-3K entre outros,