3.7.1 Nitritos (NO2)
A produção de nitritos foi determinada de acordo com o método de Griess. O ensaio foi realizado pela adição de 50 µl de sobrenadante de cultura de células do LBA ou do LF em placas de 96 poços contendo o mesmo volume do reagente de Griess em temperatura ambiente por 10 min. Como grupo controle foram utilizados sobrenadante de cultura de células de animais não manipulados (basal). A densidade óptica (540 nm) foi obtida utilizando leitor ELISA automático (Bio-Tek Instruments) e os níveis de nitritos foram determinados utilizando curva padrão previamente estabelecida de NaNO2 (5µM -60µM).
3.7.2 Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Nesta série de experimentos foi avaliada a produção de peróxido de hidrogênio pelo método de Pick e Mizel (1981). Para tanto, o botão celular obtido e centrifugado do LBA e do LF foram diluídos em PBS glicosado (NaCl 140M; KH2PO4 1mM; glicose 5mM), contendo
0,56 mM do indicador vermelho de fenol acrescido de peroxidase de rabanete (20 UI/ml) e superóxido dismutase (2 mg/ml). A concentração final de células foi ajustada para 2,0 x 106células/ml.
O ensaio consistiu da adição de 100 µl da solução contendo as células em 8 poços da placa de 96 poços. Em quatro dos poços foram adicionados 10 µl (20nM) do estimulante forbol 12 acetato 13 miristato (PMA, 20 ng/poço). A placa contendo as células e reagentes foram mantidas por 1 h em estufa de CO2 e então, a reação foi paralisada adicionando-se 10 µl
A densidade óptica foi determinada em leitor de ELISA, em comprimento de onda de 620 nm. Para controle da reação, a densidade óptica foi obtida em solução contendo vermelho de fenol e NaOH 1N.
Os resultados obtidos em densidade óptica foram transformados em nmoles de H2O2/2,0x105 células, mediante equação de regressão linear com base em uma curva padrão
que foi feita com concentrações conhecidas de peróxido de hidrogênio (5,10,20 e 40 nmoles).
3.7.3 Eicosanóides (LTB4, TXB2 ePGE2)
Alíquotas do sobrenadante de cultura de fagócitos pulmonares e medulares foram utilizadas para as dosagens de LTB4, TXB2 e PGE2. Para tanto foram utilizados “Kits” de
ensaio imunoenzimáticos (EIA-Cayman). O procedimento foi realizado de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente, o sobrenadante de cultura de células foi incubado com os eicosanóides conjugados a acetilcolinesterase e anticorpos monoclonais de camundongo anti-coelho. Após incubação por 18 h a temperatura ambiente, o substrato enzimático foi adicionado (Reagente de Elliman) e a densidade óptica determinada espectrofotometricamente.
3.7.4 Quantificação da produção de fator de necrose tumoral (TNF)
A concentração de TNF-α foi mensurada através da sua atividade lítica contra células L-929. O ensaio foi conduzido a partir da cultura (3,5 x 104 células/poço) colocada para aderir em placas de 96 poços (NUNC) em meio de cultura RPMI-1640, contendo 10% de soro bovino fetal.
As placas foram incubadas a 37ºC em atmosférica úmida (95% de CO2) durante 24
horas. Decorrido esse período, o meio RPMI-1640 (50 µl) das placas foi trocado e acrescentado 100 µl das amostras de cultura de células diluídas seriadamente. Foram acrescidos à cultura 50 µl de meio RPMI-1640 contendo actinomicina D (2 g/ml). A seguir, a placa de cultura retornou à estufa e permaneceu incubada por mais 24 h. Após este período, o
sobrenadante da cada poço foi desprezado e adicionado 100 µl (por poço) de cristal violeta (0,05%) em ácido acético (30%). Decorridos 15 min, as placas foram lavadas em água corrente e colocadas para secar.
Após a secagem das placas foram adicionados 100 µl de metanol (por poço) para dissolução do cristal violeta e a densidade óptica foi determinada em leitor de ELISA (Bio-tek Instruments) em comprimento de onda de 620nm.
A porcentagem de lise celular foi baseada na densidade óptica calculada através da seguinte fórmula: % de lise = 1 – [ABSa/ABSc] x 100
Onde ABSa representa a absorbância da amostra e ABSc a absorbância do controle. As amostras foram sempre dosadas em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética das leituras. O título de TNF-α em U/ml foi definido como recíproca da diluição onde se observa 50% de lise celular.
Manutenção da cultura de células L-929 para quantificação de TNF-α
Células da linhagem de fibroblastos murinos L-929 foram cultivadas em garrafas plásticas (Corning) contendo meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina (0,2mM) e gentamicina (10 µg/ml).
As garrafas plásticas contendo as células em culturas foram mantidas em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37ºC. Ao formarem uma monocamada na superfície da garrafa,
normalmente a cada 2 dias, o meio RPMI-1640 foi retirado e em substituição foi adicionado tampão Versene [PBS+ tripsina (0,05%)+ EDTA (0,02%)]. Uma vez que as células encontram-se em suspensão, o tampão Versene foi inativado (adicionando-se meio RPMI- 1640+SBF-10%). Após centrifugação, as alíquotas foram redistribuídas em outras garrafas.
3.7.5 Citocinas (IL-1β, IL-4 e IL-10 )
As citocinas IL-1β, IL-4 e IL-10 foram quantificadas por ELISA em amostras de cultura de parênquima pulmonar. Para tanto, foram utilizados Kits Duo Set disponíveis
comercialmente (R & D System®). Os ensaios foram conduzidos de acordo com as normas do fabricante.
Em síntese, placas de 96 poços NUNC-MAXISORP foram sensibilizadas “overnight” a temperatura ambiente com 100 μl de anticorpos monoclonais específicos de captura para as citocinas: anti-IL-1β, anti- IL-4 e anti-IL-10. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS- Tween 0,05% e bloqueadas por 2 h com 200 μl de PBS contendo 1% de BSA e 5% de sacarose. Após este período, as placas foram novamente lavadas e 50 μl das amostras ou da curva padrão foram adicionados e incubados por 2 h a temperatura ambiente. A seguir, as placas foram lavadas e adicionados 100 μl do anticorpo de detecção biotilinado específico para cada citocina, seguido de incubação por 2 h a temperatura ambiente. As placas foram lavadas novamente e incubadas com solução de peroxidase de raiz forte conjugada a avidina em PBS contendo 1% de BSA durante 20 min a 37º C. Após lavagem das placas foram adicionados 100 μl de reagente para revelação da reação. Finalmente, após 30 min a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 1 M e a densidade óptica lida em 450 nm. A concentração das citocinas presentes nas amostras foi calculada com base em curva padrão.