Efeito Matriz

O efeito matriz (ME, do inglês matrix effect) é observado como um aumento ou supressão na resposta do detector na presença no analito no extrato da matriz comparado com o mesmo analito presente em solvente orgânico. Quando o resultado for acima de ±20% considera-se que o efeito matriz começa a exercer

influência nas análises qualitativas e quantitativas (PIZZUTTI et al., 2007; PINHO et al., 2009; MARÍN et al., 2009; GOSETTI et al., 2010; FERRER et al., 2011; KWONA; LEHOTAY; GEIS-ASTEGGIANTE, 2012; FACCO et al., 2015; PARRILLA VÁZQUEZ et al., 2015). O efeito matriz exerce um papel bastante importante e por isso deve sempre ser avaliado durante o processo de validação de novos métodos (GOSETTI et al., 2010).

2.8.4.1 Efeito Matriz em Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas

Empregando a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas os fenômenos de aumento ou supressão do sinal decorrente da presença de compostos voláteis na matriz podem ocorrer, sendo a supressão sinal um fator importante ao trabalhar-se com resíduos de contaminantes. No caso de supressão de sinal, tais compostos são capazes de alterar a eficiência de formação de gotas ou evaporação do analito, assim como a quantidade de íons do analito formados na fase gasosa que alcançarão o detector. Este fenômeno afeta consequentemente a capacidade de detecção, a seletividade, repetibilidade, exatidão, linearidade de resposta e o limite de quantificação (MARÍN et al., 2009; GOSETTI et al., 2010; FERRER et al., 2011).

Diferentes espécies químicas podem ser responsáveis pela supressão de sinal como substâncias endógenas da matriz analisada que remanescem mesmo após o procedimento de preparo de amostra. Potenciais íos supressores são: espécies iônicas, substâncias polares e moléculas orgânicas, principamente àquelas com estrutura química semelhante ao analito alvo. Esses coextrativos causam problemas relevantes especialmente quando presentes em altas concentrações e quando coeluem com o analito de interesse (GOSETTI et al., 2010).

Outros fatores que também resultam em supressão do sinal estão relacionados com a concentração do analito, por exemplo, quando o analito está em uma concentração maior a supressão é menor. Por outro lado, quando o analito está em uma concentração menor, a supressão será maior, sendo resultante da maior quantidade de matriz presente. Além disso, a massa e a carga do analito também afetam o processo de ionização e supressão iônica. De um modo geral, moléculas

com massas mais elevadas tendem a suprimir o sinal de moléculas de massas menores (GOSETTI et al., 2010).

O efeito matriz exerce um papel muito importante na espectrometria de massas de alta resolução podendo interferir na efetividade de métodos de varredura porque além de causar a supressão de sinal, pode ainda acarretar em desvios nas medidas de exatidão de massas, bem como interferências por coeluição de interferentes isobáricos. A exatidão de massas, ainda pode ser afetada quando um interferente causa a supressão da(s) massa(s) da solução de referência, a qual é utilizada para corrigir desvios no instrumento através da contínua calibração do eixo de massas. O terceiro efeito associado a presença de interferentes da matriz está relacionado com a resolução de massas associada ao instrumento, e é definido como a habilidade do instrumento em distinguir dois íons de m/z similar. Por apresentarem grande número de interferentes, as matrizes complexas têm maior possibilidade de apresentar a coeluição de massas isobáricas, e estas são responsáveis por resultados falso positivos ou falso negativos (MALATO et al., 2011).

Como descrito anteriormente, o efeito matriz em LC-MS é um evento bastante relevante e deve ser devidamente estudado a fim de assegurar confiabilidade aos resultados obtidos. Sendo assim, algumas alternativas podem ser adotadas a fim de minimizar esse problema. A otimização das condições cromatográficas pode ser alterada, melhorando a eficiência de separação, ou ainda com a escolha da estratégia de calibração mais adequada, seja pela adição de padrão interno, calibração externa preparada no extrato "branco" da matriz (mais utilizada) ou ainda calibração interna (MARÍN et al., 2009; GOSETTI et al., 2010; BOTITSI et al., 2011).

2.9 VALIDAÇÃO

Faz-se necessário a validação de métodos analíticos a fim de mostrar a qualidade nas medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade. A validação de um método é um processo contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência (RIBANI et al., 2004).

De acordo com o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO) é sugerido que seja realizado um planejamento da validação

levando em consideração os seguintes itens: definição da aplicação, objetivo e escopo do método; definição dos parâmetros de validação e critérios de aceitação; verificação das características de desempenho do equipamento; qualificação dos materiais (por exemplo, reagentes); planejamento dos experimentos de validação, incluindo o tratamento estatístico, e execução dos experimentos de validação (INMETRO, 2011).

Existem vários guias de validação disponíveis, tanto em nível nacional quanto internacional. No Brasil podem ser adotados guias disponibilizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003), através da Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003, bem como do INMETRO com o DOQ-CGCRE-008 (revisão 04) de 2011 (INMETRO, 2011). Órgãos internacionais que dispõem de guias são a Conferência Internacional em Harmonização (ICH, 2005), União Internacional de Química Pura e Aplicada - IUPAC (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002) e SANCO (2013).

A validação de um método é uma exigência na prática das análises químicas, e tem como objetivo demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (ANVISA, 2003).

Alguns dos parâmetros envolvidos no processo de validação de métodos analíticos são: curva analítica e linearidade, seletividade, exatidão, precisão (repetitividade), precisão intermediária, limite de detecção e de quantificação. Além desses, é importante determinar a exatidão de massas quando utiliza-se a espectrometria de massas de alta resolução (SANCO, 2013).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho está dividido em três artigos, os quais foram desenvolvidos no Laboratório de Análise de Resíduos de Pesticidas (LARP) no Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Maria (ARTIGOS 1 e 2) e no Aga Lab no Departamento de Química da The State University of New York at Buffalo nos Estados Unidos da América (ARTIGO 3). Os artigos desenvolvidos foram submetidos para publicação em revistas internacionais sendo o ARTIGO 1 submetido para a revista Journal of Chromatography A, o ARTIGO 2 já foi aceito para publicação na revista Journal of AOAC International e o ARTIGO 3 está publicado na revista Environmental Pollution, 212 (2016) 392-400.

Nesse item estão descritos procedimentos gerais realizados para ambos os trabalhos desenvolvidos e informações mais específicas referentes a cada trabalho estão detalhadas em seus respectivos artigos.

3.1 INSTRUMENTAÇÃO

A instrumentação utilizada para o desenvolvimento dos trabalhos segue descrita abaixo:

 Sistema de purificação de água Milli-Q Direct UV3®

(Millipore e Barnstead, EUA);

 Sistema LC-QToF/MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipado com:

 Cromatógrafo líquido de alta performance-HPLC 1260;

 Espectrômetro de massas de alta resolução, do tipo quadrupolo-tempo de voo-6530 com fonte de ionização por eletronebulização;

 Sistema de geração de nitrogênio NM32LA (Peak Scientific);

 Processamento de dados qualitativos e quantitativos através dos softwares Qualitative e Quantitative MassHunter B.06.00.

 Sistema LC-MS/MS (Thermo Scientific, Watham, MA, EUA) equipado com:  Cromatógrafo líquido de alta performance-Surveyor;

 Espectrômetro de massas de tipo triploquadrupolo-TSQ Quantum UltraTM, com fonte de ionização por eletronebulização;