PREPARO DE SOLUÇÕES ANALÍTICAS

Preparou-se individualmente cada padrão de referência, levando-se em consideração a pureza (60,0 a 99,7%) para a pesagem da quantidade necessária para o preparo de uma solução na concentração de 1000 mg L-1 em acetonitrila ou metanol grau HPLC. A partir destas soluções estoque preparou-se uma mistura

contendo todos os compostos em uma concentração de 10 mg L-1. Uma solução de todos os analitos na concentração de 1,0 mg L-1, foi utilizada para o preparo das soluções analíticas de trabalho.

3.4 PARÂMETROS AVALIADOS PARA A VALIDAÇÃO DE MÉTODO QuEChERS Em todos os artigos desenvolvidos foi realizada a validação do procedimento de preparo de amostra empregando o método QuEChERS adaptado para cada matriz, e foram avaliadas as figuras de mérito: seletividade, linearidade da curva analítica, limites de detecção e quantificação, exatidão através do ensaio de recuperação, precisão (repetitividade) e precisão intermediária, bem como avaliação do efeito matriz. Além disso, devido ao uso de espectrometria de massas de alta resolução fez-se a avaliação do erro da exatidão de massa.

3.4.1 Seletividade

A seletividade de um método é a capacidade que o mesmo possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002; ANVISA 2003). Pode-se também dizer que é a habilidade dos métodos de extração, de purificação, do sistema de separação e detecção, em realizar a discriminação entre o analito de interesse e outros compostos (SANCO, 2013).

A seletividade do método foi avaliada fazendo injeções no sistema cromatogr fico com a matriz “branco”, ou seja, ausente dos contaminantes em estudo, e da amostra fortificada com os mesmos. A comparação dos cromatogramas obtidos foi realizada a fim de avaliar a ocorrência de coeluição entre as substâncias de interesse e os interferentes da matriz.

3.4.2 Linearidade

A linearidade da curva analítica é a capacidade de um método analítico demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado (ANVISA, 2003; RIBANI

et al., 2004). A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta medida e a concentração do analito (INMETRO, 2011).

A linearidade das curvas analíticas foi realizada através da injeção das soluções analíticas preparadas de acordo com os relatos de cada artigo. As curvas analíticas foram preparadas em solvente orgânico e no extrato da matriz. Após obteve-se a equação da reta e o coeficiente de determinação (r2).

3.4.3 Ensaios de Recuperação para Avaliação da Exatidão

A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (RIBANI et al., 2004; SANCO, 2013). Valores aceitos de recuperação para a análise de substâncias em nível de traços é entre a faixa de 70 a 120%. Porém, uma faixa entre 60 e 140% pode ser utilizada em análises multirresíduo de rotina (SANCO, 2013).

A exatidão do método foi avaliada através dos ensaios de recuperação, fortificando as amostras “branco” em diferentes níveis de concentração. Foram realizadas réplicas de extração para cada nível e a recuperação foi calculada de acordo com a equação 1, seguindo o guia de validação do INMETRO (2011).

100 (%) 3 2 1          C C C o recuperaçã (1) Onde:

C1 = Concentração determinada na amostra fortificada; C2 = Concentração determinada na amostra não fortificada; C3 = Concentração usada para fortificação.

3.4.4 Precisão (repetitividade) e Precisão Intermediária

A precisão representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas, sendo usualmente expressas pelo desvio padrão e pelo desvio padrão relativo (RSD, do inglês relative standard deviation), cujos

valores até 20%, são aceitos (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002; RIBANI et al., 2004; INMETRO, 2011; SANCO, 2013).

A precisão pode ser calculada através da fórmula do desvio padrão relativo (RSD), como mostra a equação 2.

(%)

100





s

RSD

Onde:

s = estimativa de desvio padrão absoluto; s = {∑(xi - xm)2

/n-1}1/2; xi = valores individuais;



A precisão, em termos de repetitividade (RSDr) foi avaliada realizando a extração e análise de réplicas de cada nível de concentração, sendo que cada réplica foi injetada uma única vez. A precisão intermediária (RSDpi) foi avaliada fazendo a injeção da curva analítica dos analitos e das amostras “branco” fortificadas no nível intermediário, sendo estas preparadas em dia diferente da avaliação da repetitividade, ou seja, realizando o procedimento analítico completo em dias diferentes.

3.4.5 Limite de Detecção e Quantificação

O limite de detecção (LOD, do inglês limit of detection) representa a menor concentração da substância em análise que pode ser detectada, mas não

necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento

experimental. Já o limite de quantificação (LOQ, do inglês limit of quantification) representa a menor concentração da substância em análise que pode ser medida, com um grau aceitável de confiança, utilizando um determinado procedimento experimental (RIBANI et al., 2004).

A determinação do limite de quantificação (LOQ) foi realizada adotando a concentração de cada analito que obteve recuperação entre 70 e 120% no ensaio de recuperação (SANCO, 2013). Desse modo, o limite de detecção (LOD) foi determinado como sendo a concentração 3,33 vezes menor que o LOQ.

3.4.6 Avaliação do Efeito Matriz

Para a avaliação do efeito matriz, realizou-se a comparação entre as inclinações das curvas analíticas obtidas, preparadas em solvente orgânico e aquelas preparadas no extrato “branco” da matriz. O cálculo foi efetuado através da equação 3 (FERRER et al., 2011; SOUSA et al., 2013; PARRILLA VÁZQUEZ et al. 2015). 100 1_        S E a a matriz Efeito (3) Onde:

aE = inclinação da curva obtida pela injeção das soluções analíticas de cada composto orgânico, preparadas na matriz;

aS = inclinação da curva obtida pela injeção das soluções analíticas de cada composto orgânico, preparadas em solvente.

3.5 ERRO DE EXATIDÃO DE MASSAS

A determinação do erro de exatidão de massas é importante quando trabalha- se com espectrometria de massas de alta resolução. A medida pode ser determinada de acordo com a equação 4. Para o presente trabalho foram utilizadas as massas m/z 121.0509 (C5H5N4) e 922.0098 (C18H19O6N3P3F24) como referência para a calibração constante do LC-QToF/MS (MALATO et al., 2011).

4 ARTIGO 1 – LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH HIGH RESOLUTION MASS