Efeitos da Criopreservação sobre a Integridade das Células Espermáticas

A realização de avaliações do sêmen pós-descongelamento durante os processos de criopreservação são muito importantes, pois elas permitem evidenciar possíveis danos que podem acontecer durante o processo de congelamento e descongelamento afetando as células espermáticas

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Para diminuir os efeitos ocasionados pelo frio durante o processo da criopreservação nas células espermáticas, a gema de ovo vem sendo utilizada. Por ter uma composição alta de lipoproteínas de baixa densidade. A gema de ovo propicia uma proteção para as células espermáticas expostas a estresse pelo frio, durante o processo de criopreservação (WATSON 1981). Entretanto, não somente a gema de ovo é utilizada para a conservação; existem substâncias que favorecem este importante processo como os citratos, fosfatos, glucosa, frutose e leite

(RAMIREZ-MERLANO; MEDINA ROBLES; CRUZ-CASALLAS, 2010). Estas substâncias são utilizadas com os crioprotetores DMSO e DMA em busca da proteção celular. Em P. corruscans utilizando DMSO e DMA (8%;10%), gema de ovo 10% e glucose 5% foi encontrado uma proteção espermática e conservação da motilidade e as velocidades espermáticas. Em bagre rajado Pseudoplatystoma fasciatum, encontrarom que DMSO 10% protege as células espermáticas e concentrações superiores podem reduzir significativamente a viabilidade de espermatozoides (PINZÓN-ARCINIEGAs et al. 2005). Resultados similares foram encontrados em bagre africano utilizando a combinação de gema de ovo 10% e DMSO o qual permitiu conservar as velocidades espermáticas pós-descongelação sem alterações (RURANGWA et al., 2000). Em diversos trabalhos de criopreservação, a utilização da gema de ovo tem sido um fator ressaltado pelos bons resultados encontrados nos protocolos de criopreservação utilizados para diversas espécies, como em Sorubim cuspicaudus, onde a utilização da gema de ovo 12%, juntamente com os crioprotetores DMA e DMSO, propiciou bons resultados da motilidade total pós-descongelamento e uma boa proteção celular (REZA E SALAS 2010).

Em bagre europeo (Silurus glanis), Ogier, Labbé e Maisse (1999), encontraram que utilizando o crioprotetor DMSO 5% e 15%, proporciona proteção às células espermáticas, conservando a integridade e funcionalidade da membrana e conservação de ATP. Outros bons resultados foram encontrados utilizando DMA onde este crioprotetor conserva a capacidade de motilidade espermática pré e pós- congelamento. Estes resultados som similares aos encontrados em P. corruscans, devido a que os analises feitos não apresentaram diferença estatística, indicando que os crioprotetores DMA 8% e DMSO 10% são uma boa alternativa para a preservação das células espermáticas, pelo fato de não apresentarem grandes alterações nas velocidades espermáticas.

Outro trabalho feito em Diplodus puntazzo, Taddei (2001) realizou uma pesquisa utilizando o crioprotetor DMSO a 10% e 15%, tendo encontrando diferenças e efeitos similares entre as duas concentrações. Em P. corruscans foram encontradas diferenças entre os tratamentos sendo a melhor concentração utilizada com DMSO 10% devido a que uma porcentagem apresenta danos na estrutura espermática. Coincidindo com Mengumphan, Whangchai e Amornlerdpison (2010) constataram que DMSO superior a 10% pode ser tóxico e causar danos ao

espermatozoide. Por tal motivo utilizaram DMSO 8% encontrando um alto grau de motilidade espermática. Em outras espécies como Diplodus puntazzo a utilização de DMSO 15% conservo a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides sem apresentar danos. He e Woods (2004) encontraram bons resultados em amostras criopreservadas com DMSO 5% e 10%, onde as estruturas e membranas plasmáticas foram mais definidas e conservadas em comparação com os espermatozoides conservados com DMSO 2,5%.

Ao analisar os efeitos dos crioprotetores DMSO e DMA sobre as células espermáticas de Pseudoplatystoma corruscans, foi encontrada uma diminuição gradual da motilidade e das velocidades espermáticas nos tratamentos utilizados. Os maiores valores de velocidade linear foram encontrados utilizando o crioprotetor DMSO 10% (45,02±16,37%), e a menor velocidade linear foi obtida utilizando o crioprotetor DMA 8% (37,43± 12,72%). Este foi um resultado satisfatório, apesar de ter sido encontradas dentro dos tratamentos células imóveis e com uma curta duração da motilidade (abaixo de 40 segundos). Estes resultados são similares aos encontrados por Rurangwa et al. (2001). Em trabalho de criopreservação com Clarias gariepinus, onde estes autores encontraram células espermáticas pós- congelamento com um alto número de células imóveis e com uma corta duração de movimento. Também encontraram diminuição da motilidade e as velocidades espermáticas, além disso, uma redução significativa da sobrevivência espermática e a capacidade de fertilização.

Em bagre (Ictalurus furcatus), a utilização dos crioprotetores DMA e DMSO apresentaram efeitos sobre o tempo de motilidade espermática, e uma diminuição gradual Lang, KENNETH e RILEY (2003). Estes resultados são similares aos encontrados em P. corruscans. Em espécies como Prochilodus lineatus e Leporinus obtusiden, Viveiros et al. (2008) reportaram uma redução da motilidade pós- descongelação de (0% e 8%) respectivamente com o crioprotetor DMSO. Muitos são os efeitos que causam danos durante a criopreservação e descongelação do material espermático. Ao mesmo tempo o processo de criopreservação pode produzir alterações e danos sobre a membrana plasmática do espermatozoide, como os encontrados em P. corruscans.

5.3 Análises de Microscopia Eletrônica de Varredura

Nas análises de microscopia eletrônica de varredura, foi possível observar na Figura 13 a estrutura espermática, como a cabeça, que tem um comprimento de 2µm e um diâmetro longitudinal de 2,32 µm, a peça intermediária tem um comprimento de 1,5 µm e o flagelo tem um comprimento de 32,6 µm. A peça intermediária e o flagelo se apresentaram estruturalmente completos e sem danos. Resultados similares foram encontrados em Salmo Salar, onde o comprimento do flagelo foi de 32,3 µm (GAGE et al., 2002) e em Brycon amazonicus, onde o comprimento do flagelo foi de 31,9 µm (CRUZ-CASALLAS et al., 2005). Também foram encontrados danos na estrutura espermática como a inflamação da cabeça, rompimento da membrana, danos na peça intermediaria, nas figuras 14 A,B,D e 15 ACD. A perda do flagelo em um alto numero de espermatozoides Figura 14 F. Outros danos foram encontrados no flagelo, como os encontrados nas figuras 14B - 15B, onde o flagelo esta enrolado. Estes danos no espermatozoide levam a diminuição da sua motilidade e a redução na possibilidade de fertilização do ovócito (BROKAW, 1965).

A figura 14E, apresenta uma grande quantidade de espermatozoides que estão unidos entre os flagelos. Esta situação foi possivelmente ocasionada pelo processo a qual são submetidas às amostras durante a preparação das análises e o efeito dos crioprotetores e diluentes, como a gema de ovo. Este efeito foi também encontrado por Martínez (2010) em Prochilodus magdalenae, onde grandes quantidades de espermatozoides estavam unidas, o qual dificultava a identificação das cabeças e flagelos.

Em estudos ultraestruturais de Morone saxatilis, He e Woods, (2004) encontraram, em tratamentos com DMSO 2,5% - 10%, ruptura de membranas na região da cabeça, peça intermediária e o flagelo, sendo estes resultados similares aos encontrados em pintado, onde foram encontrados danos na cabeça, peça intermediaria e flagelo. Estes danos são ocasionados de acordo com a concentração do crioprotetor, podendo variar de acordo a cada espécie. Danos similares foram reportados por Martinez, Pardo (2010), em Prochilodus magdalenae, e por Yao et al. (2000) em Macrozoarces americanus L., em que foram encontradas diversas mudanças na estrutura do espermatozoide, como inflamação espermática, danos na mitocôndria, desidratação do citoplasma e danos na peça intermediária na utilização

do crioprotetor DMSO 20%. Para evitar ou diminuir estes danos por desidratação nas células, é necessário que, durante o ingresso do crioprotetor e a saída da água da célula, seja de forma gradual para evitar danos durante o processo de criopreservação, sendo necessária a utilização de crioprotetores internos e externos para garantir assim a qualidade espermática (MAZUR, 1980). Taddei (2001) observou em espermatozoides de Diplodus puntazzo inflamação da cabeça e cauda, e lesões secundárias, como perda da funcionalidade das mitocôndrias e saída do fluxo da cromatina nuclear. Resultados similares foram encontrados em pintado, onde as maiores partes dos espermatozoides apresentavam inflamação na cabeça, danos na peça intermediária e no flagelo. Estes danos diminuem a motilidade espermática e a capacidade de fertilização. Em Cyrprinus carpio, foi observada uma diminuição da velocidade e motilidade espermática, e capacidade de fertilização, devido à alteração em catorze proteínas produzida pela criopreservação (LI et al.,2010). Em truta Billard (1978) encontrou alterações na estrutura espermática como ruptura da membrana plasmática e inflamação mitocondrial, o qual pode levar a uma diminuição da taxa de fertilização.