Eletroforese Bidimensional (2DE)

A 2DE, desenvolvida por O’Farrell e Klose (KLOSE, 1975; O'FARRELL, 1975), é uma técnica de separação amplamente utilizada para a análise de misturas complexas de proteínas extraídas de células, tecidos ou outras amostras biológicas. Essa técnica promove a separação das proteínas em duas dimensões, de acordo com duas propriedades independentes. Na primeira dimensão, focalização isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos (pI). Na segunda dimensão, uma eletroforese em gel de

poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) separa as proteínas de

acordo com suas massas moleculares (MM) relativas (figura 1) (WESTERMEIER; NAVEN, 2002).

Figura 1. Etapas envolvidas no processo de separação de proteínas por eletroforese bidimensional. Inicialmente, as proteínas solubilizadas de uma amostra são separadas de acordo com o seu pI (primeira dimensão). Após a focalização, as mesmas são transferidas para um gel de poliacrilamida, onde são separadas de acordo com sua massa molecular relativa (segunda dimensão) (LEITE, 2010).

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Senda Charone

Proteínas são moléculas anfóteras, ou seja, podem apresentar carga líquida positiva, negativa ou neutra, dependendo de sua estrutura primária (dos aminoácidos que a compõem) e do pH do meio. Dessa forma, em um gradiente de pH e sob a influência de um campo elétrico, as proteínas irão migrar para a posição do gradiente na qual sua carga líquida será zero, focalizando-se neste ponto, onde o valor de pH é numericamente igual ao pI (NELSON; COX, 2002). Na metodologia original, a IEF das proteínas era realizada em um tubo de gel de poliacrilamida, onde um gradiente de pH era estabelecido por meio de uma pré-corrida com anfólitos carreadores específicos, que apresentam alta capacidade tamponante em pHs próximos aos seus pIs. Atualmente, o uso desses anfólitos carreadores geradores foi substituído por fitas com gradientes de pH imobilizados (immobilized pH gradient - IPG), fabricadas por uma reação de copolimerização de monômeros de acrilamida, bisacrilamida e acrilamidas modificadas. Essas últimas possuem em sua estrutura grupamentos R, os quais podem ser ácidos ou bases fracas com valores de pKa bem estabelecidos (WESTERMEIER; NAVEN, 2002).

As proteínas previamente separadas pela IEF são então transferidas para um gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), que realizará uma nova separação, mas agora baseada na MM das proteínas. O gel de poliacrilamida é formado pela mistura dos monômeros acrilamida e bisacrilamida, sendo a porosidade do mesmo, determinada por dois parâmetros: a porcentagem total de acrilamidas (%T) e a razão de entrecruzamento, proporcionado pela bisacrilamida (%C). Quanto maior for a %T, menor será o poro da malha, e por isso a escolha da concentração do gel é um parâmetro de extrema importância para que se tenha uma boa separação (CANTU, 2007; GE-HEALTHCARE, 2004). Antes de iniciar a eletroforese, as variáveis forma e carga da proteína devem ser eliminadas, para que a separação dependa exclusivamente de sua MM. Para isso, as mesmas são lavadas com uma solução contendo ditiotreitol (DTT) e SDS. O DTT é um agente redutor cuja função é desfazer as pontes dissulfeto, eliminando assim a forma nativa da proteína e conferindo-lhe uma conformação linear. O SDS é um tensoativo aniônico que se associa às proteínas numa proporção de aproximadamente 1,4 g de SDS por grama de proteína, tornado- as assim negativamente carregadas, o que fará com que a migração das mesmas dependa basicamente de sua massa molecular (GE-HEALTHCARE, 2004).

Após a realização da eletroforese, o gel deve ser corado para visualização das proteínas. O método ideal de coloração deve ser sensível para detectar concentrações extremamente baixas de proteínas, ter uma faixa dinâmica de detecção, linearidade, reprodutibilidade entre experimentos e compatibilidade com métodos de identificação. Os

Revisão de Literatura 83 métodos de coloração mais comumente utilizados são os que utilizam a coloração por prata ou por azul de Coomassie (CANDIANO et al., 2004). A coloração por prata (Ag+) é o método colorimétrico mais sensível existente (1 ng/spot), porém, de difícil quantificação, visto que, a intensidade da coloração é saturável e depende do tempo de revelação. O princípio é saturar o gel com íons de prata e reduzir a prata que interage com as proteínas, a prata metálica (Ag0) (REINDERS; SICKMANN, 2002).

O azul de Coomassie é o método colorimétrico pós-eletroforese mais confiável para quantificação dos spots, já que apresenta linearidade quantitativa na faixa de concentração de proteína de 10-100 ng/spot. Trata-se de um corante orgânico que é atraído pelos grupamentos carregados das proteínas, formando fortes complexos corante/proteína. O azul de Comassie pode ser encontrado nas versões G-250 e R-250, onde a letra G indica que o corante apresenta uma coloração esverdeada, ao passo que R indica que uma coloração avermelhada. O número 250 é um indicador da força do corante. Os aminoácidos básicos apresentam particular influência na interação entre moléculas de Comassie e proteínas, uma vez que existe uma correlação proporcional entre a intensidade da coloração e o número de resíduos de lisinas, histidinas e argininas na proteína. Embora não se possa negar que a prata seja muito mais sensível que o Coomassie, muitos cientistas que trabalham com análises proteômicas diferencial e quantitativa preferem os corantes orgânicos como o Coomassie. Isso se deve ao fato de que a menor sensibilidade do Coomassie é compensada amplamente pela maior reprodutibilidade, pois, ao contrário da prata, possui protocolos mais simples com menos chances de erros (CANDIANO et al., 2004). Outra vantagem da coloração com Coomassie é que o mesmo não interfere na análise por espectrometria de massa dos spots de proteínas visualizados (CANDIANO et al., 2004; REINDERS; SICKMANN, 2002).