Identificação das proteínas da matriz do esmalte

A correlação entre as propriedades das AMELs e o mecanismo pelo qual se desenvolve a fluorose dentária, tornou-se uma peça chave para o entendimento da sua patogenia (AOBA; FEJERSKOV, 2002; BRONCKERS, A.L.; LYARUU; DENBESTEN, 2009; BUZALAF et al., 2011; DRUMM; COLLINS, 1993; ROBINSON et al., 2004). O arranjo tridimensional do principal grupo de proteínas do esmalte, composto pelas AMELs, forma agregados de estruturas quaternárias chamadas nanosferas. Essa conformação permite que as AMLs se posicionem ao redor dos cristais, permitindo o direcionamento do seu crescimento e modulando a arquitetura da sua estrutura (BANSAL et al., 2012; DENBESTEN et al., 2002; DENBESTEN et al., 2011; FAN et al., 2011; FINCHAM et al., 1991; MORADIAN-OLDAK, 2001; PUGACH et al., 2010; RAVINDRANATH et al., 2004; TANIMOTO et al., 2008; YANG et al., 2011). Durante o estágio de maturação do esmalte, a remoção ordenada das proteínas, promove o crescimento simultâneo de uma superfície mineralizada. Desse modo, ocorre o alongamento dos cristais, evento este atribuído às AMELs em função da sua alta afinidade de ligação à superfície mineral do esmalte e a sua presença em maior quantidade em relação às outras proteínas ENAMs (BANSAL et al., 2012; LACRUZ et al., 2012a; LACRUZ et al., 2010b; LACRUZ et al., 2011; RAUTH et al., 2009; ROBINSON et al., 1998; SIMMER; HU, 2001; SIMMER et al., 2012; SMITH, 1998). A ocorrência de qualquer interferência durante esse processo, resulta em distúrbios do desenvolvimento do esmalte, dentre os quais se destaca a fluorose dentária.

Diversas hipóteses têm sido associadas à patogenia da fluorose dentária. Em síntese, destacam-se três mecanismos bastante discutidos até os dias atuais (AOBA; FEJERSKOV, 2002; BRONCKERS; LYARUU; DENBESTEN, 2009; DENBESTEN; LI, 2011). O primeiro mecanismo envolvido seria devido às alterações funcionais observadas nos ameloblastos, que afetariam diretamente suas propriedades de síntese e degradação da matriz. O segundo mecanismo estaria relacionado à inibição ou diminuição da atividade das enzimas proteolíticas residentes na matriz do esmalte (MMP20 e KLK4) (BARTLETT; SIMMER, 1999; BARTLETT et al., 2011; BARTLETT; SMITH, 2013; BRONCKERS; LYARUU; DENBESTEN, 2009; DENBESTEN; LI, 2011; DENBESTEN; HEFFERNAN, 1989; DENBESTEN et al., 2002; ROBINSON et al., 2004; WEI et al., 2013). E por último, o F seria incorporado à estrutura do cristal de hidroxiapatita promovendo uma ligação mais estável entre a matriz inorgânica e a orgânica, tornando a degradação das proteínas pelas enzimas proteolítica mais difícil (DENBESTEN et al., 2011; TANIMOTO et al., 2008; ZHU

Resultados e Discussão 175 et al., 2011). A falta de remoção das proteínas do esmalte pode ser considerada como o principal responsável pela diminuição da quantidade e do índice de nucleação dos cristais de hidroxiapatita do esmalte (AOBA; FEJERSKOV, 2002; AOBA et al., 1992; DENBESTEN; LI, 2011). Essa hipótese foi verificada em um estudo in vitro que avaliou o potencial de inibição do crescimento dos cristais pelas proteínas da matriz do esmalte (AOBA et al., 1987). Notou-se que uma interferência na degradação dessas proteínas poderia estar vinculada à permanência prolongada das mesmas, ou seja, a um retardo na degradação e remoção, e, consequentemente, à ocorrência de um distúrbio na mineralização do esmalte. Como esperado, no presente estudo, a AMEL, foi identificada, na fase de maturação, exclusivamente na linhagem A/J tratada com 50 mg/L de F, quando comparada à linhagem 129P3/J submetida ao mesmo tratamento (tabela 11). Estes dados estão de acordo com a literatura, que relata retenção de AMELs no estágio de maturação do esmalte quando há fluorose dentária (DENBESTEN; LI, 2011; DENBESTEN et al., 2011; MORADIAN-OLDAK, 2012; ZHU et al., 2011). Também confirmam a maior susceptibilidade genética à fluorose dentária da linhagem A/J e a resistência da linhagem 129P3/J, como relatado em estudos prévios (CARVALHO et al., 2009; EVERETT et al., 2002; EVERETT et al., 2009). Tem sido relatado que a hidrólise reduzida das AMELs no esmalte com fluorose pode ser parcialmente causada por um aumento na concentração de apatita fluoretada, o que contribuiria para o fenótipo de matriz hipomineralizada observado no esmalte com fluorose (DENBESTEN et al., 2011; TANIMOTO et al., 2008). Entretanto, no presente estudo, as concentrações de F no esmalte dos animais da linhagem 129P3/J tratados com 50 mg/L F foram significativamente maiores que aquelas observadas nos animais da linhagem A/J submetidos ao mesmo tratamento, o que indica que há outros mecanismos envolvidos na susceptibilidade genética à fluorose dentária, além daquele descrito por Denbesten et al. (2011). Em adição, Everett et al. (EVERETT et al., 2009), detectaram loci de características quantitativas (QTL) associados à fluorose dentária nos cromossomos 2 e 11 dos camundongos A/J e 129P3/J, mas não no cromossomo X, onde se encontra a AMEL, o que sugere um papel pequeno desta proteína na susceptibilidade/resistência à fluorose dentária. Deve ser ainda mencionado que no presente estudo não houve alteração na expressão de AMEL entre as linhagens e nem entre os grupos controle e tratado no estágio de secreção do esmalte, o que está de acordo com estudos que relatam a ausência de efeito do F na secreção de AMEL (DENBESTEN, 1986). Em outras palavras, pode-se dizer que a presença de AMEL apenas nos animais tratados com F da linhagem A/J e não nos da linhagem 129P3/J, no estágio de maturação do esmalte, é uma consequência dos eventos moleculares que levam à fluorose dentária, e não a sua causa.

176 Resultados e Discussão

Senda Charone

No esmalte, a interface mineral-orgânica é muito importante para guiar o crescimento dos cristais de apatita, sendo o papel das AMELs fundamental, uma vez que estas proteínas formam nanosferas que recobrem a superfície do cristal seletivamente na fase de secreção da amelogênese e atuam como moléculas espaçadoras entre os cristais (FINCHAM et al., 1995). Esta cobertura guia o crescimento do cristal tornando-o preferencial em comprimento (eixo c), prevenindo sua fusão lateral. O papel da interface mineral-orgânica no mecanismo da fluorose dentária tem sido recentemente enfatizado num novo modelo proposto para explicar o desenvolvimento da fluorose dentária. Segundo este modelo, o F acelera o crescimento do cristal, resultando numa rápida deposição mineral, o que aumenta muito a produção de prótons (para cada apatita formada, 8 prótons são liberados), que não podem mais ser tamponados pelas AMELs. Em pH ácido, as nanosferas de AMELs se desagregam e se destacam da superfície do cristal, ao mesmo tempo em que novas moléculas de AMELs não são capazes de formar nanosferas, permanecendo monoméricas. Isto faz o controle preferencial de crescimento do cristal ser perdido, ou seja, os cristais crescem lateralmente, tornando-se mais largos, levando às características conhecidas da fluorose dentária (BRONCKERS; LYARUU; DENBESTEN, 2009). Tem sido relatado que os cristais de apatita do tecido ósseo dos animais da linhagem 129P3/J são significativamente mais estreitos e curtos que aqueles da linhagem A/J, mesmo sem tratamento com F, sugerindo crescimento mais lento do cristal (MOUSNY et al., 2008) o que também foi observado para os cristais do esmalte, empregando microscopia de força atômica (dados não publicados). Este crescimento mais lento, permitiria uma ação tamponante mais apropriada das amelogeninas, que no pH adequado poderiam permanecer aderidas à superfície do cristal, guinado seu crescimento preferencialmente em altura.

Outra possibilidade seria haver a ação de outra proteína tamponante, que poderia compensar a grande geração de prótons causada pela presença de maiores quantidades de F no esmalte dos animais da linhagem 129P3/J. No presente estudo, a carbonic anhydrase 2 foi encontrada exclusivamente no estágio de secreção dos animais da linhagem 129P3/J não tratados com F, quando comparados àqueles da linhagem A/J na mesma condição (tabela 4). Esta enzima tem um importante papel na homeostase do pH durante o estágio de secreção do esmalte (LACRUZ et al., 2010a).

As mudanças observadas na estrutura do esmalte têm sido associadas às injúrias que acometem a sua principal célula formadora, os ameloblastos, e mediante esse aspecto, estudos têm atribuído ao F alterações no reticulo endoplasmático (RE) dessas células (KUBOTA et al., 2005; SHARMA; TSUCHIYA; BARTLETT, 2008; SIERANT; BARTLETT, 2012; WEI