2. Introdução
2.2.2 Métodos de caracterização da capacidade antioxidante
2.2.2.3 Métodos eletroquímicos
2.2.2.3.1 Ensaios diretos
Estes ensaios fazem uso das características de eletroatividade dos AO, que sendo importantes agentes redutores são facilmente oxidados, em elétrodos inertes. A reação apresentada na equação (5) traduz a oxidação de compostos antioxidantes em elétrodos inertes85.
A utilização de métodos eletroquímicos permite obter parâmetros físico-químicos como o número de eletrões envolvidos na reação de redox, a constante de velocidade e o potencial formal do elétrodo. Estes parâmetros permitem avaliar a ação redutora dos antioxidantes e identificar o mecanismo da reação envolvida113.
Métodos voltamétricos
Uma das técnicas mais utilizadas para avaliar a capacidade antioxidante é a voltametria cíclica (VC). Chevion e colaboradores114 foram pioneiros das abordagens voltamétricas e utilizaram a voltametria cíclica como forma de avaliar o poder antioxidante de alimentos e amostras biológicas. Estes autores relacionaram o potencial de pico de oxidação (Epa) com a atividade antioxidante. Assim, os baixos valores de potencial do pico de oxidação obtidos nos voltamogramas registados para as amostras biológicas eram uma medida da sua elevada atividade antioxidante. Outros parâmetros utilizados na caraterização de AO por VC são a intensidade da corrente de pico anódica (Ipa) e a área sob o varrimento anódico, que são proporcionais à concentração de espécies redutoras presentes na amostra114. A partir da quantificação destes parâmetros é normalmente caracterizada a capacidade antioxidante.
Firuzi e colaboradores115aplicaram a VC ao estudo da oxidação de vários flavonóides em diferentes soluções tampão e diferentes valores de pH. Estes autores constataram que existia uma boa correlação entre os potenciais de pico de oxidação e as propriedades antioxidantes obtidas no ensaio de FRAP. Compostos com menor valor de Epa apresentam maior capacidade antioxidante pelo ensaio de FRAP115.
Kilmartin e colaboradores, aplicaram a VC para a caracterização dos vinhos e dos AO presentes no vinho numa solução a pH 3,3 e obtiveram uma boa correlação entre as medidas voltamétricas, sendo possível caracterizar e estimar o total de antioxidantes presentes nos vinhos116,117.
Apesar da VC apresentar baixo custo e rapidez, não permitem uma análise quantitativa precisa da capacidade antioxidante uma vez que não traduzem o consumo da espécie
reativa (ou oxidante) pelo AO. Assim, a VC tem sido principalmente utilizada em estudos preliminares e comparativos, através da análise do potencial de pico de oxidação118.
Para além da voltametria cíclica114, a voltametria diferencial de impulso119 e a amperometria120–122 têm vindo a ser usadas na caraterização da capacidade antioxidante em diferentes amostras, inclusive amostras de vinho. Com estas técnicas é possível simular o pH das matrizes biológicas ou outras amostras (como o vinho)123 em que a avaliação da capacidade antioxidante seja de levado interesse.
2.2.2.3.2 Ensaios indiretos
Nos ensaios indiretos os AO são caraterizados a partir de reações com espécies formadas electroquimicamente, ou envolvendo a deteção eletroquímica de espécies consumidas ou formadas na reação com os AO. As titulações coulométricas124 são um exemplo deste tipo de métodos.
Korotkora125 e colaboradores desenvolveram ensaios eletroquímicos para a avaliação
da capacidade antioxidante, baseados em informações sobre a redução eletroquímica do oxigénio. Para tal, foi aplicada a técnica da voltametria diferencial de impulso (DPV) a diversas amostras sintéticas, chá verde, vinagre e produtos farmacêuticos para a determinação da capacidade antioxidante registando a corrente de redução do oxigénio num elétrodo de filme de mercúrio125.
A geração de radicais constitui uma tarefa importante que por vezes requer o uso de métodos caros, e por isso pouco acessíveis à maioria dos laboratórios, como é o caso da radiólise e fotólise. Os métodos eletroquímicos constituem uma forma alternativa de produzir radicais, de uma forma mais acessível e simples.
Radical superóxido
A determinação da atividade antioxidante foi efetuada pelo registro da corrente de redução eletroquímica do oxigénio. Este método tem como base a formação do radical superóxido e o efeito do antioxidante na sua concentração e foi desenvolvido por Korotkora e colaboradores125. A reação entre o antioxidante e o radical superóxido resulta no decréscimo da concentração do radical junto à superfície do elétrodo. A corrente resultante da redução do oxigénio diminui e esta diminuição pode ser utilizada como forma de avaliar a atividade antioxidante70,126. Nas equações (6), (7), (8), (9) e (10) estão representadas as reações químicas de redução eletroquímica do oxigénio70.
𝑂
2+ 𝑒
−⇌ 𝑂
2●− (6)𝑂
2●−+ 𝐻
+⇌ 𝐻𝑂
2 (7)𝐻𝑂
2+ 𝐻
++ 𝑒
−⇌ 𝐻
2𝑂
2 (8)𝐻
2𝑂
2+ 2𝐻
++ 2𝑒
−⇌ 2𝐻
2𝑂
(9)𝑂
2+ 2𝐻
++ 2𝑒
−⇌ 𝐻
2𝑂
2 (10)O radical superóxido, ao contrário da maioria dos radicais livres, é inativo. Em meio aquoso, a sua reação principal é a dismutação na qual se traduz uma molécula de peróxido de hidrogénio e uma molécula de oxigénio.
Radical hidroxilo
A forma mais comum usada na geração de radicais hidroxilo é a partir da decomposição do peróxido de hidrogénio envolvendo iões metálicos, como o Fe2+ (equação 12). O método, baseado na reação de Fenton, é descrito pelas seguintes reações:
O
2+ 2H
++ 2e
−→ H
2𝑂
2 (11)𝐹𝑒
2++ H
2
𝑂
2→ 𝐹𝑒
3++ 𝐻𝑂
−+ 𝐻𝑂
● (12)A possibilidade de gerar os radicais hidroxilo sem recorrer ao uso de percursores químicos é sem dúvida vantajosa pois diminuí a ocorrência de reações paralelas entre os AO e os percursores dos radicais como o peróxido de hidrogénio ou os iões ferro.
No nosso grupo foi desenvolvido um método para a caraterização de AO baseado na geração eletroquímica de radicais hidroxilo através da electro-oxidação da água127–129. Este método permite gerar diretamente, e de forma controlada, radicais hidroxilo recorrendo a eletrólises galvanostáticas, tendo-se identificado a formação de produtos hidroxilados em diferentes posições do anel quando estas eletrólises eram realizadas na presença de compostos aromáticos127. A geração de radicais HO ocorre como um intermediário da reação de evolução de oxigénio tal como se descreve nas equações (13), (14):
𝐻
2𝑂 → 𝐻𝑂
●+ 𝐻
++ 𝑒
− (13)2 𝐻𝑂
●→ 𝑂
2+ 2𝐻
++ 2𝑒
− (14)Os radicais HO ficam adsorvidos na superfície do ânodo e reagem com substâncias orgânicas que são consumidas a uma velocidade que é determinada por um conjunto de variáveis, nomeadamente das condições em que são realizadas as eletrólises e da própria reatividade dessas mesmas substâncias127.
A utilização deste método para a caraterização de antioxidantes pressupõe a utilização de uma espécie que é utilizada como sonda, cuja velocidade de consumo é monitorizada na ausência e na presença de antioxidantes.
Considerando um caso genérico de uma sonda (S) que é eletroativa, o seu consumo poderá ser descrito pelas seguintes equações:
𝑆 → 𝑃
𝑆,𝑖+ 𝑒
− (16)A constante de velocidade que correspondente ao seu consumo na ausência de AO é traduzida pela seguinte equação128,130:
𝑘
𝑎𝑝0=
𝑗𝑧𝐹
𝑘𝑆,𝐻𝑂
2𝑘𝑂2+𝐶𝑆
+ 𝑘
𝑆,𝑒 (17)Onde j é a densidade de corrente (A m-2); F é a constante de Faraday, z corresponde ao número de eletrões utilizados na produção do radical HO a partir da água; 𝑘𝑆,𝐻𝑂 é a constante de velocidade da reação entre S e os radicais HO; 𝑘𝑂2 é a constante de velocidade
de evolução de oxigénio e
𝑘
𝑆,𝑒 é a constante de velocidade da oxidação da espécie por transferência eletrónica direta e CS é definido como:𝐶𝑆 = 𝑛
𝑆𝑘
𝑆,𝐻𝑂[𝑆] + ∑ 𝑛
𝑃𝑆,𝑖𝑘
𝑃𝑆,𝑖 𝐻𝑂[𝑃
𝑆,𝑖]
(18)Onde 𝑘𝑃𝑆,𝑖 𝐻𝑂 é a constante de velocidade relativa à reação dos produtos formados a
partir da oxidação de S e 𝑃𝑆,𝑖, com os radicais HO; 𝑛𝑆 e 𝑛𝑃𝑆,𝑖 são os coeficientes
estequiométricos das reações de S e de 𝑃𝑆,𝑖 com os radicais HO.
A concentração de radicais hidroxilo à superfície do ânodo na presença de AO é menor, dependendo da eficiência com que esse AO reage com os radicais. A concentração de radicais será tanto menos quanto maior for a velocidade com que os AO os eliminem, o que depende da sua concentração, da constante de velocidade da sua reação e da estequiometria da reação. A equação (19) traduz esta dependência128,130:
𝑘
𝑎𝑝𝐴𝑂=
𝑗𝑧𝐹
𝑘𝑆,𝐻𝑂
Onde [AO]0 é a concentração de antioxidante presente na amostra 𝑘𝑎𝑝𝐴𝑂 é a constante de velocidade relativa à reação de S com os radicais HO na presença de AO; 𝑛𝑆𝐶 é o
coeficiente estequiométrico das reações de captura de radicais e 𝑘𝑆𝐶 a respetiva constante de velocidade, definidos a partir da equação (20):
𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶 =[𝐴𝑂]𝑛𝐴𝑂𝑘𝐴𝑂+ ∑[𝑃𝐴𝑂,𝑖]𝑛𝑃𝐴𝑂,𝑖𝑘𝑃𝐴𝑂,𝑖
[𝐴𝑂]0 (20)
Onde 𝑛𝐴𝑂 e 𝑛𝑃𝐴𝑂,𝑖 são os coeficientes estequiométricos das reações do AO e dos
produtos formados pela oxidação do AO, 𝑃𝐴𝑂,𝑖, com os radicais HO, e 𝑘𝐴𝑂, 𝑘𝑃𝐴𝑂,𝑖 são as
constantes de velocidade das respetivas reações.
A determinação da capacidade antioxidante é feita a partir da representação do inverso da diferença entre as constantes de velocidade aparente da sonda determinada na ausência e na presença de concentrações variáveis de AO (1/∆𝑘𝑎𝑝 = (𝑘𝑎𝑝0 − 𝑘𝑎𝑝𝐴𝑂)
−1 ) em função do inverso da concentração inicial de AO, ([AO]0) de acordo com a equação (21)130:
1 ∆𝑘𝑎𝑝
=
𝑧𝐹 𝑗𝑘𝑆,𝐻𝑂((2𝑘
𝑂2+ 𝐶𝑆) + (2𝑘
𝑂2+ 𝐶𝑆)
2 1 𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶[𝐴𝑂]0)
(21)Caso a concentração de antioxidante seja desconhecida, a determinação é efetuada pela representação de 1 / kap em função do inverso do fator de diluição, de acordo com a equação (22)130: 1 ∆𝑘𝑎𝑝 = 𝑧𝐹 𝑗𝑘𝑆,𝐻𝑂((2𝑘𝑂2+ 𝐶𝑆) + (2𝑘𝑂2+ 𝐶𝑆) 2 1 𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶[𝐴𝑂]0𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝐹𝑑 ) (22)
O valor que carateriza a capacidade antioxidante 𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶[𝐴𝑂]0𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎/𝑘𝑆,𝐻𝑂 é calculado a partir da razão entre o quadrado da ordenada na origem pelo declive de acordo com a equação (23):
𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶[𝐴𝑂]0 𝑘𝑆,𝐻𝑂
=
𝑜𝑜2 𝑑 𝑗 𝑧𝐹 (23)Em que oo representa a ordenada na origem (equação 24) e d o declive (equação 25):
𝑜𝑜 =
𝑧𝐹 𝑗𝑘𝑆,𝐻𝑂(2𝑘
𝑂2+ 𝐶𝑆)
(24)𝑑 =
𝑧𝐹 𝑗𝑘𝑆,𝐻𝑂((2𝑘
𝑂2+ 𝐶𝑆)
2 1 𝑛𝑆𝐶𝑘𝑆𝐶[𝐴𝑂]0𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
(25)Por sua vez, a ordenada na origem corresponde a 1 / (𝑘𝑎𝑝0 − 𝑘𝑆,𝑒) de acordo com a equação (17). A determinação de 𝑘𝑎𝑝0 é efetuada a partir do consumo da sonda na ausência de AO, nas mesmas condições em que é feito o estudo na presença da sonda. Por outro lado, 𝑘𝑆,𝑒 pode ser determinado a partir de eletrólises efetuadas a diferentes densidades de corrente. Representando 𝑘𝑎𝑝0 em função da intensidade de corrente, i, obtém-se o valor de 𝑘𝑆,𝑒 na ordenada na origem.
3. Parte experimental
3.1 Amostras
As amostras do vinho que foram usadas neste trabalho foram fornecidas pela empresa
Sogrape S.A. As amostras que foram transportadas e armazenadas em garrafas de vidro
foram posteriormente transferidas, cerca de 25 mL, sob atmosfera de azoto para erlenmeyers. As soluções diluídas eram preparadas a partir destas porções de amostra.
Para preservar as características físicas e químicas das amostras originais, estas foram mantidas sob vácuo, na ausência de luz.
Foram analisadas seis amostras de vinhos de mesa tintos e quatro amostras de vinhos do Porto. Os vinhos de mesa tintos analisados eram provenientes de diferentes regiões (Região Demarcada do Douro, Região Demarcada do Dão e Região Demarcada do Alentejo), diferentes anos de colheira (2012, 2013 e 2014) e de diferentes categorias (Standard,
Premium e Reserva). Duas das amostras analisadas eram provenientes do mesmo vinho
(VT1 e VT1/2). Os vinhos do Porto analisados tinham 10 anos (VP2 – 10) e 30 anos (VP3 – 30). Duas outras amostras de vinho do Porto sofreram uma micro-oxigenação a temperatura controlada durante 22 meses (VP1, VP2), sendo uma das amostras vinho do Porto com 10 anos (VP2).
Na Tabela 2 estão apresentados dados relativos à caraterização química dos vinhos usados neste estudo que foram fornecidos pelo laboratório da Sogrape em Avintes.
Tabela 2: Caracterização química dos vinhos de mesa tintos e vinhos do Porto Amostra VT1 - 34310 Amostra VT1/2 - 34310/2 Amostra VT4 - 3509001 Amostra VT5 - 3400901 Amostra VT2 - 35963 Amostra VT3 - 34856 Amostra VP1 OXI.11.0.0 Amostra VP2 OXI.11.3.1 Amostra VP2 - 10 Amostra VP3 - 30
Extrato não redutor (g/L) 29,6 29,6 30,9 34,4 36,3 27,8 30,7 30,2 21,2 25,6
Açucares redutores (g/L) 2,2 2,2 2,4 2,6 2,2 2,7 101,2 101,9 132,5 131,7
Dióxido de enxofre livre (mg/L) 43 43 30 43 45 40 - - - -
Dióxido de enxofre total (mg/L) 125 125 68 99 102 134 22 17 32 19
Acidez volátil (g/L ácido acético) 0,54 0,54 0,54 0,52 0,56 0,57 0,19 0,25 0,39 0,47
Acidez total (g/L ácido tartárico) 5,1 5,1 5,2 5,2 5,2 5,9 3,8 3,9 5,7 6
Taninos (g/L equivalentes Epicatequina)
1,93 1,96 2,07 3,59 2,11 3,67 - - - -
Pigmentos (unidades absorvância) 16,89 17,84 28,04 32,31 16,25 31,08 - - - -
Polifenóis (unidades absorvância) 59,15 59,32 67,6 94,1 61,91 94,71 - - - -
Taninos pig. (unidades absorvância) 3,16 3,07 2,69 5,06 3,01 5,25 0,61* 0,5* 0,43* 0,26*
Antocianinas livres (unidades absorvância)
11,62 12,73 23,56 23,88 11,23 22,33 - - - -
3.2 Reagentes e soluções
Na Tabela 3, estão representados os reagentes utilizados, assim como a fórmula química, a marca e a massa molar.
Tabela 3: Lista dos reagentes utilizados e respetivas características
Reagentes Fórmula Química Marca Massa Molar
(g/mol)
Ácido fosfórico H3PO4 Acros Organics 98
Ácido Gálico C7H6O5 Sigma-Aldrich 170,12
Ácido tartárico C4H6O6 Merck 150,09
Dihidrogenofosfato de sódio NaH2PO4 Acros Organics 119,98
Fosfato de potássio
monobásico KH2PO4 Fisher Scientific 136,09
Hidróxido de sódio NaOH Acros Organics 40,00
RNO (N,N-Dimetil-4-
nitrosoanilina) C₈H₁₀N₂O Sigma-Aldrich 150,18
Trolox C14H18O4 Sigma-Aldrich 250,29
Soluções tampão fosfato pH 3,20 e pH 7,40
A solução de tampão fosfato pH 3,20 foi utilizada para a preparação de soluções com o vinho para análises através de eletrólises. Também foi utilizada para limpeza eletroquímica e ativação do elétrodo de platina. A solução de tampão fosfato pH 7,40 foi utilizada para efeitos de leitura das absorvâncias das amostras por espetrofotometria de UV-vis.
A solução de tampão fosfato pH 3,20 (150 mM) foi preparada por pesagem do sal de fosfato de potássio monobásico (m=20,41g) e por adição de 6,0 mL de ácido fosfórico (0,10
mM) sendo o pH ajustado para 3,20 pela adição da solução de NaOH (1,0 M) num volume total de 1 L de solução.
A solução de tampão fosfato pH 7,40 (150 mM) foi preparada por pesagem de cerca de 10,30 g de KH2PO4 e de 10,72 g de Na2HPO4, em água ultra-pura para um balão volumétrico de 1 L. O acerto de pH para 7,40 foi realizado usando uma solução de NaOH 1,0 M.
Solução de ácido tartárico (0,033 M)
A solução de ácido tartárico (0,033 M) foi preparada dissolvendo cerca de 4,9529 ± 0,0001 g do composto em água ultra-pura num balão volumétrico de 500 ± 0,40 mL. Posteriormente, o pH desta solução foi ajustado para 3,20 pela adição gota a gota de solução de NaOH (1,0 M), sendo armazenada no frigorífico para posterior utilização. Esta solução foi utilizada para diluir as amostras de vinho para análise por técnicas voltamétricas.
Solução de RNO (0,500 ± 0,013 mM)
Para obter a reta de calibração da sonda de RNO foi preparada uma solução de 0,50 ± 0,013 mM por dissolução de 0,0038 ± 0,0001 g do RNO em tampão fosfato pH 7,40 (150 mM), num balão volumétrico de 25,00 ± 0,04 mL. Por diluição da solução de 0,50 mM preparou-se uma solução de concentração de 0,050 ± 0,001 mM num balão volumétrico de 50,00 ± 0,06 mL. Por diluição da solução 0,050 ± 0,001 mM prepararam-se soluções em tampão fosfato a pH 7,4 com concentrações de 0,5 µM; 2 µM; 4 µM; 6 µM; 8 µM; 10 µM em balões volumétricos de 10,00 ± 0,03 mL, utilizando uma micropipeta com capacidade até 1000,0 ± 1,6 µM e uma pipeta graduada de 5,00 ± 0,03 mL.
Para caracterização da sonda por eletrólise foram preparadas soluções de RNO por dissolução de 0,0038 ± 0,0001 g do RNO em tampão fosfato pH 3,20 (150 mM), num balão volumétrico de 50,00 ± 0,06 mL.
Solução de ácido gálico (0,500 ± 0,012 mM)
A solução de ácido gálico (0,500 ± 0,001 mM) foi preparada por dissolução de 0,0043 ± 0,0001 g do ácido gálico em solução de ácido tartárico, num balão volumétrico de 50,00 ± 0,06 mL. Por diluição desta solução prepararam-se soluções com concentrações 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; 0,4mM e a partir da diluição da solução de 0,05 mM prepararam- se soluções com concentrações 0,01 mM e 0,005 mM em balões volumétricos de 10,00 ± 0,03 mL, utilizando duas pipetas graduadas, 10,00 ± 0,05 mL e 5,00 ± 0,03 mL, para a sua análise através de técnicas voltamétricas.
Solução de trolox (0,500 ± 0,008 mM)
Foi preparada uma solução de trolox (0,500 ± 0,008 mM) por dissolução de 0,0063 ± 0,0001 g do trolox em tampão fosfato a pH 3,20, num balão volumétrico de 50,00 ± 0,06 mL e por diluição prepararam-se três soluções de concentração 0,50 mM; 0,25 mM; 0,10 mM; em balões volumétricos de 10,00 ± 0,03 mL, utilizando uma pipeta graduada de 5,00 ± 0,03 mL para a sua análise através de eletrólises.
Solução de amostra de vinho
Para a análise da capacidade scavenging dos antioxidantes dos vinhos (eletrólises galvanostáticas), cada amostra de vinho foi inicialmente diluída de 1:10 em balões volumétricos de 10,00 ± 0,03 mL, usando tampão fosfato a pH 3,20. As soluções de amostra diluídas de 1:50 e de 1:100 foram preparadas medindo para um balão volumétrico de 10,00 ± 0,03 mL 2,00 ± 0,01 mL e 1,00 ± 0,01 mL da solução de amostra diluída de 1:10, respetivamente.
Para a análise voltamétrica dos vinhos prepararam-se soluções de cada uma das amostras de vinho em balões volumétricos de 25,00 ± 0,04 mL diluídos de 1:25 usando uma solução de ácido tartárico a pH 3,20.