Ensaios envolvendo transferência de átomos de hidrogénio (HAT)

A caracterização de antioxidantes baseados em ensaios HAT baseia-se na caracterização cinética da reação entre o AO e uma ROS específica, envolvendo uma reação de competição entre o AO e uma sonda por espécies reativas de oxigénio. Na equação (2) está representada a reação base em ensaios HAT85_.

𝑅𝑂𝑆

+ 𝐴𝑂𝐻 → 𝑅𝑂𝑆𝐻 + 𝐴𝑂

Na maioria destes ensaios o antioxidante e o substrato competem por radicais peroxilo (ROS●). Estes radicais podem ser produzidos através da decomposição térmica de compostos azo88_{. A reatividade relativa nos ensaios HAT é determinada pela energia da} ligação do átomo de hidrogénio no grupo dador do antioxidante89_{. Existem vários ensaios} baseados em reações HAT, sendo os mais utilizados os ensaios de Oxygen Radical

Absorbance Capacity (ORAC) e Total Radical-trapping Antioxidant Parameter (TRAP)90_.

Ensaio ORAC

Este ensaio foi desenvolvido por Cutler e Cao em 199391 _{e testa a capacidade do} antioxidante em quebrar uma reação em cadeia, típica dos radicais. Assim, a reatividade do antioxidante é avaliada face ao radical peroxilo, que é gerado a partir da decomposição

térmica de compostos azo, como o AAPH (2,2-azobis(2-amidino-propano)dihidrocloreto). O radical peroxilo reage com uma sonda fluorescente e forma um produto não fluorescente, podendo o consumo da sonda fluorescente ser facilmente quantificado por fluorescência. Num ensaio posterior, a adição do antioxidante inibe o consumo da sonda, sendo a quantificação efetuada com base nas diferenças das áreas sob as curvas de decaimento da fluorescência, na ausência e presença do antioxidante92–94_.

Este método tem sido bastante utilizado na caracterização da capacidade antioxidante de alimentos, frutas, extratos vegetais95 _{e nos vinhos}96–99_.

Ensaio TRAP

O ensaio TRAP foi desenvolvido por Wayner e colaboradores em 1985100 _{sendo este} ensaio bastante similar ao ensaio de ORAC, tendo como principal objetivo a determinação da atividade antioxidante no plasma sanguíneo. Tal como no ensaio de ORAC são utilizados radicais peroxilo gerados a partir do composto azo AAPH. Após a adição de AAPH ao plasma sanguíneo, a oxidação é monitorizada a partir, por exemplo, do controlo do oxigénio consumido durante a reação, com um elétrodo de oxigénio. O período em que a oxidação é inibida pelos antioxidantes do plasma é comparado ao valor obtido com um antioxidante de referência (normalmente o Trolox), sendo então quantitativamente relacionado com a capacidade antioxidante do plasma87_.

Este método utiliza a técnica de “lag fase”, ou seja, avalia somente o período de inibição da atividade do radical pelo oxidante. Este ensaio não pode ser considerado um método de determinação total dos radicais gerados, tal como acontece no ensaio de ORAC, que combina tanto o tempo de inibição como a percentagem de inibição da ação do radical pelo antioxidante101_.

2.2.2.2 Ensaios envolvendo transferência eletrónica (ET)

Nos ensaios ET, a atividade AO é caracterizada pela capacidade que um antioxidante possui para reduzir um composto oxidante num tempo predeterminado. Comparativamente aos ensaios HAT, os ensaios ET são mais lentos, requerendo algum tempo até estarem completos e por isso, a determinação da atividade AO é baseada na percentagem de decaimento do produto em vez da análise cinética88_{. Os ensaios} envolvendo ET detetam a capacidade de um antioxidante em transferir um eletrão para reduzir um determinado composto, incluindo metais, carbonilos e radicais. Na equação (3) está representada a reação base em ensaios ET69,90_.

𝑂𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 + 𝑒

(𝑑𝑜 𝐴𝑂) → 𝑂𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒

+ 𝐴𝑂

(3)

Atualmente existem diferentes ensaios baseados em mecanismos ET sendo os mais comuns os ensaios de Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC), Ferric Ion Reducing

Antioxidant Parameter (FRAP) e os ensaios de scavenging do radical DPPH.

Ensaio TEAC

Este método foi desenvolvido por Rice-Evans e Miller em 1993102 _{e consiste na} monitorização do radical ABTS+● _{produzido pela oxidação do ABTS (2,2-azinobis-(3-etil-} benzotiazolin-6-sulfonato)), na sequência da adição de uma amostra contendo um AO. A medição é realizada considerando o grau de descoloração da solução, associada à extensão da reação com o radical ABTS+●_.

Em termos de quantificação, o valor da absorvância (proporcional à concentração de ABTS+● _{que ficou por reagir) é medido após um tempo de reação fixo. Os resultados são} expostos em equivalentes de trolox103_{. Este método é bastante simples e por isso muito} utilizado para medir a capacidade antioxidante de várias amostras, inclusive nos vinhos,

onde vários autores utilizaram este método para avaliar a capacidade antioxidante de vinhos bancos e vinhos de mesa tintos 97,104–106_.

Ensaio FRAP

Este ensaio baseia-se na capacidade dos antioxidantes de reduzir o complexo de tripiridilis-triazina férrico ([Fe(III)-(TPTZ)2]3+_{), formando-se um complexo azul intenso [Fe(II)-} (TPTZ)2]2+ _{em meio acido.}

Como potenciais problemas identificados relativamente a este método é a sua incapacidade em detetar AO que atuam por transferência de átomos de hidrogénio. Simultaneamente, podem se constituir potenciais interferentes compostos que não possuindo capacidade antioxidante, apresentam um potencial de redução mais baixo que o par redox Fe(III)/Fe(II). Outro facto a considerar, é que o Fe(II) pode contribuir para a formação de radicais hidroxilo e o valor da capacidade antioxidante pode ser sobrestimado. Compostos que absorvam no mesmo comprimento de onda que o complexo podem também contribuir para uma sobrestimava da capacidade antioxidante90,107_.

Ensaio de scavenging do radical DPPH

O ensaio de scavenging do radical DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo) aplica-se para

testar a capacidade dos compostos atuarem como scavengers de radicais livres ou como dadores de átomos de hidrogénio. Este ensaio baseia-se na captura do radical DPPH pelo composto antioxidante, sendo o radical DPPH reduzido, formando-se a difenil-picril- hidrazina (equação (4))108,109_.

𝐷𝑃𝑃𝐻

+ 𝐴𝑂𝐻 → 𝐷𝑃𝑃𝐻 + 𝐴𝑂

+ 𝐻

(4)

O radical DPPH é estável e apresenta coloração arroxeada, contudo, na forma reduzida apresenta uma coloração amarelada. A quantidade de DPPH consumido pelo antioxidante

no ensaio relaciona-se com a capacidade antioxidante da amostra. O resultado do ensaio é expresso pelo parâmetro EC50, ou seja, a concentração de antioxidante que promove um decréscimo de 50% da concentração do radical DPPH iniciale quanto menor o valor de EC50, maior a capacidade antioxidante da amostra110_.

Uma das grandes limitações do método baseado no uso de DPPH é a inexistência deste ou de radicais similares nos sistemas biológicos, sendo que as análises espectroscópicas podem ser afetadas pela presença de outros compostos com cor, como os carotenoides, uma vez que absorvem a comprimentos de onda semelhantes aos do radical DPPH111_.

Nos últimos anos este método tem sido utilizado para quantificar antioxidantes em sistemas biológicos complexos e em alimentos e bebidas, inclusive vinhos112_.