Envolvimento na doença de Parkinson

O termo sinucleinopatias é empregue para definir um grupo de doenças neurodegenerativas nas quais se observa uma acumulação de agregados de α-Syn com um efeito patológico. Nestas doenças a α-Syn forma agregados e depósitos em certas populações de neurónios e células da glia (Galvin, Lee, & Trojanowski, 2001; Goedert, 1999).

A α-Syn é uma proteína pré-sináptica relacionada geneticamente e neuropatologicamente com a DP. Esta proteína pode contribuir para a fisiopatologia da DP de diversas formas, mas supõe-se que os olígomeros solúveis e as protofibrilas são as principais espécies tóxicas que provocam alterações na homeostase celular e a consequente morte neuronal. Além disso, a expressão desta proteína pode exercer, também, efeitos pejorativos nas células vizinhas, inclusive induzir a formação de agregados, o que possivelmente contribui para a propagação da doença (Leonidas Stefanis, 2012).

A identificação, por Uéda et al. em 1993, de elevadas concentrações do fragmento NAC da proteína α-Syn em placas amilóides características da doença de Alzheimer, assim como, a descoberta que esta proteína é um dos componentes maioritários nos CL na DP, formando depósitos de fibrilas amilóides dentro destes, o reconhecimento de cinco mutações a nível do gene SNCA em casos de DP em famílias europeias e o facto desta proteína formar depósitos e agregações a nível dos neurónios dopaminérgicos, levou à suspeita de que esta proteína poderia ter um papel importante na fisiopatologia das doenças neurodegenerativas, nomeadamente na DP. (Recchia et al., 2004; Uéda et al., 1993). Actualmente, existe uma elevada quantidade de evidências experimentais que sustentam o papel da α-Syn na fisiopatologia da DP (Bisaglia, Mammi, & Bubacco, 2009).

Enquanto que as funções fisiológicas da α-Syn continuam a não ser totalmente claras, o seu papel patológico, provocado por diversas alterações, é mais evidente (Bisaglia et al., 2009).

A α-Syn, in vitro, agrega-se em fibrilas amilóides similares, morfologicamente e funcionalmente, às fibrilas amilóides extraídas de CL in vivo, que estão associados a diversas doenças neurodegenerativas, nomeadamente a DP (Waxman & Giasson, 2009). Considerando que a morte neuronal é uma das características mais vinculativas da DP, combinado com o evidente papel da α-Syn na fisiopatologia na DP é deduzível que a α-Syn possa interferir neste processo de morte celular (Cookson, 2009)

Esta acumulação anormal de α-Syn ocorre em estágios precoces do desenvolvimento da doença e parece afectar diversas zonas do cérebro consoante a progressão da doença. A acumulação mais generalizada de α-Syn parece estar subjacente, pelo menos em parte, às deficiências cognitivas e comportamentais na DP com demência. Os mecanismos subjacentes a estas funções anormais da α-Syn e o impacto destas na DP ainda não esta totalmente esclarecido, contudo têm sido sugeridas diversas possibilidades, as quais se encontram descritas nos parágrafos subsequentes (Vekrellis, Xilouri, Emmanouilidou, Rideout, & Stefanis, 2011).

A formação destas fibrilas envolve uma agregação inicial de α-Syn em pequenos olígomeros e protofibrilas que sofrem uma posterior elongação originando em fibrilas maturas (K. a Conway, Harper, & Lansbury, 1998) e pensa-se que é um processo dependente da nucleação (Leong et al., 2009). A agregação da α-Syn envolve uma mudança da conformação inicial do monómero desta proteína numa conformação parcialmente enrolada sendo submetida a diversas auto-associações desfavorecedoras de forma a formar um núcleo altamente instável durante a fase lag (Waxman & Giasson, 2009). A formação do núcleo é seguida de uma fase de crescimento, a elongação, em que este núcleo rapidamente se transforma em fibrilas pela adição de monómeros (Leong et al., 2009). Supõe-se que estas protofibrilas constituam as espécies perniciosas da α-Syn, provocando a morte celular através da sua toxicidade (Beyer et al., 2009).

Figura 8 - Representação Esquemática do Processo de Agregação da α-Syn (Adaptado de Marques

& Outeiro,2012)

A forma monomérica da α-Syn pode, também, sofrer várias alterações, subjacentes a modificações pós-traducionais e mutações genéticas, que aparentam estar relacionadas com a formação de espécies patogénicas de α-Syn (Bisaglia et al., 2009).

A descoberta das mutações a nível do gene SNCA relacionadas com a DP foi critica na pesquisa da etiologia da DP. Contudo, os mecanismos moleculares através dos quais estas mutações provocam a DP ainda não estão elucidados na totalidade (Bisaglia et al., 2009).

Análises detalhadas através do recurso a uma combinação de técnicas de baixa resolução revelaram que as mutações A30P, E46K e A53T não afectam a estrutura global da α-Syn, que permanece no seu estado nativo ‘’unfolded’’(V. Uversky & Eliezer, 2009).

Contudo estudos mais detalhados, revelaram que todas as três mutações alteram a cinética de agregação da α-Syn. As mutações A53T e E46K aumentam a taxa de agregação (mas não necessariamente a taxa de fibrilação) ao passo que a mutação A30P diminui (Choi et al., 2004; K. a Conway et al., 1998; K. A. Conway et al., 2000). Em comparação com a α-Syn WT, as mutação A53T e A30P promovem a acumulação de olígomeros prefibrilares enquanto a E46K tem um efeito oposto (K. A. Conway et al., 2000). Análises à mutação E46K demonstraram que esta leva a mudanças na conformação da proteína monomérica e forma fibrilas insolúveis in vitro mais rapidamente que a proteína WT, também a capacidade das protofibrilas, nesta mutação e na WT, de permeabilizar as vesículas lipídicas foram demonstradas, in vitro, neste estudo (Fredenburg et al., 2007).

A tendência da estrutura secundaria da α-Syn WT permanecer num estado desarranjado é alterada por duas mutações. A A30P atenua a propensão da região N- terminal para adoptar conformações helicoidais enquanto que, a mutação A53T possui uma tendência para formar uma estrutura secundaria regular em torno do local da mutação (V. Uversky & Eliezer, 2009).

Relativamente à interacção com lípidos, a mutação A53T parece ter um efeito moderado no impedimento da ligação às membranas enquanto que a mutação A30P diminui extensivamente a interacção da α-Syn com os lípidos in vitro e in vivo. Já a mutação E46K aumenta a capacidade de ligação, desta proteína, a lipossomas carregados negativamente (Choi et al., 2004).

Embora os estudos sobre as mutações genéticas na α-Syn levem a uma maior compreensão sobre as funções e os mecanismos patológicos desta proteína, estas só contribuem para uma pequena percentagem dos casos de DP. Na realidade, mais de 90% dos casos de DP são esporádicos e, portanto, caracterizados pela presença de agregados de α-Syn (Spillantini, Crowther, Jakes, Hasegawa, & Goedert, 1998).

Por esse motivo, o interesse direccionou-se para as alterações que convertem a α-Syn WT numa espécie patogénica. Já foi demonstrado que a α-Syn WT forma agregados idênticos aos encontrados em cérebros de pacientes com DP, contudo, a sua formação ocorre a uma taxa inferior à das espécies mutadas de α-Syn (Serpell, Berriman, Jakes, Goedert, & Crowther, 2000).

Foram propostas, então, diversas modificações pós-traducionais capazes de alterar a função da α-Syn e, assim, induzir a formação de agregados de fibrilas. Estão descritas diversas modificações pós-traducionais que envolvem diferentes processos resultando, todas elas, em alterações do tamanho, carga, estrutura e conformação das proteínas, levando a uma alterações das actividades enzimáticas, afinidade de ligação ou hidrofobicidade. Em suma, conduzem a uma alteração no funcionamento das proteínas (Beyer, 2006).

A fosforilação é provavelmente a modificação pós-traducional mais importante. A α-Syn pode sofrer fosforilação a nível do resíduos de serina 129 e 87 e nos resíduos 125, 133 e 136 localizados na região C-terminal. (Beyer, 2006). Porém, é a nível do resíduo de serina 129 que a α-Sinucleína se encontra extensivamente fosforilada em tecidos cerebrais de pacientes com DP e outras doença neurodegenerativas (Fujiwara et al., 2002).

Apesar da ideia inicial, comprovada por estudos em moscas transgénicas, que a fosforilação da α-Syn no resíduo de serina 129 leva a um aumento de olígomeros solúveis desta proteína e da neurotoxicidade, estudos subsequentes obtiveram resultados contraditórios (Leonidas Stefanis, 2012).

Lee et al. realizou um estudo que demonstra que o aumento da desfosforilação do resíduo 129 da α-Syn através da proteína fosfatase 2A (PP2A) provocava uma diminuição da fosforilação da serina 129 e da agregação da α-Syn no cérebro de ratinhos. Isto é, a PP2A é uma proteína que desfoforiliza o resíduo 129 e a actividade desta proteína é aumentada aquando da metilação desta. Assim, neste estudo foi demonstrado que ao aumentar a actividade da PP2A através da metilação, esta vai aumentar a desfosforilação do residuo serina 129 da α-Sinucleína o que leva a uma diminuição dos níveis de α-Syn fosforilada e a agregação desta no cérebro de ratinhos sugerindo um papel prejudicial da fosforilação no processo da doença (K.-W. Lee et al., 2011).

Contudo, investigadores da Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, em 2013, ao realizar um estudo em ratos sobre a fosforilação demonstraram que esta pode ter efeitos positivos. Neste estudo foi injectado no cérebro de ratos neurónios que se pensa que podem desencadear a doença através de uma expressão excessiva de α-Syn e a enzima responsável pela fosforilação da α- Syn (PLK2). Como resultado, observou-se que os ratos sujeitos a estes dois parâmetros – expressão excessiva de α- Syn e fosforilação – sofreram uma perda em cerca de 70% inferior de neurónios comparativamente ao grupo de ratos em que apenas estava sujeito a uma expressão excessiva de α-Syn, consequentemente estes ratinhos desenvolveram menos lesões e ostentaram menos sintomas parkinsonianos (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2013)

O resíduo de serina 87 é outro local de fosforilação da α-Syn, que também se encontra associado aos CL na sua forma fosforilada, contudo, a significância a nível patológico ainda não esta esclarecida (Leonidas Stefanis, 2012).

Assim, o papel patológico da fosforilação permanece pouco claro, pois se por um lado parece acrescer o risco de formação de agregados por outro, segundo descobertas recentes, pode desempenhar um papel a nível da neuroprotecção.

Tanto a nitração como a oxidação da Α-Syn foram propostas como responsáveis pela formação de olígomeros (Beyer, 2006). A α-Syn na sua forma nitrada, também foi detectada nos CL e aparenta promover a formação de agregados de fibrilas

(Leonidas Stefanis, 2012). A nitração da α-Syn ocorre nos resíduos de tirosina, particularmente nos resíduos 125 e 39. A nitração do resíduo 125 leva a uma dimerização da α-Syn, ao passo que a nitração do resíduo 39 reduz a capacidade de ligação as vesículas lipídicas, aumentando a capacidade de polimerização (Beyer, 2006). Hodara et al, demonstrou que a α-Syn nitrada não é processada de modo eficaz pelas protéases intracelulares conduzindo à acumulação desta proteína e a um aumento da taxa de formação de fibrilas (Hodara et al., 2004). Neste mesmo estudo, foi demonstrado que as forma monoméricas e diméricas nitradas de α-Syn promovem a formação de fibrilas, enquanto que, a forma oligomérica nitrada desta proteína estabiliza como olígomeros estáveis, sugerindo que a nitração tem efeitos complexos a nível da agregação da α-Syn (Hodara et al., 2004; Leonidas Stefanis, 2012). Numa analise colectiva, a nitração da α-Sinucleína aparenta reduzir a ligação desta proteína às vesículas lipídicas, prolongar a meia-vida intracelular e conduzir a formação de inclusões de α-Syn (Hodara et al., 2004).

Relativamente aos efeitos da oxidação na α-Syn, o stress oxidativo também parece ter um papel relevante na formação de agregados desta proteína e, talvez, na formação de olígomeros intermediários tóxicos (Cookson, 2009). Comprovando esta hipótese, um estudo realizado por Takahashi et al. demonstrou que a α-Syn exposta a FeCl2 têm

maior propensão à formação de olígomeros e espécies de elevado peso molecular, levando, também, a um aumento da actividade da proteína quinase CK2 (M. Takahashi et al., 2007). Um outro estudo, revelou que a expressão excessiva de α-Syn pode induzir uma agregação dependente do ferro (Recchia et al., 2004).

Assim, as modificações pós-traducionais e o stress oxidativo, apesar de serem mecanismos diferentes, aparentam estar inter-relacionados aquando da sua contribuição para a agregação da α-Syn (Perfeito & Rego, 2011).

Como foi referido anteriormente, diversos mecanismos induzem a agregação, a formação de fibrilas e a formação de depósitos da α-Syn, o que leva à questão sobre qual efeito destas alterações na neurodegeneração.

Toxicidade da alfa-Sinucleína

Diversos modelos foram realizados com o intuito de comprovar a toxicidade da α- Syn in vivo. Em culturas celulares, tanto em fase estacionária como em fase de crescimento, o aumento da expressão de α-Sinucleína limitou o crescimento celular. A toxicidade desta proteína também foi demonstrada na Drosophila, onde foi

reportado uma perda de neurónios, contudo, neste modelo os resultados são controversos e os efeitos obtidos foram modestos (L. Chen & Feany, 2005). Foi realizado outro estudo em minhocas C.elegans com o intuito de comprovar a toxicidade da α-Syn nos neurónios in vivo. Todos estes estudos demonstraram o efeito nocivo da α-Sinucleína em organismos que esta proteína não está presente em condições fisiológicas (Breyde et al., 2012)

Os níveis de α-Syn no cérebro depende de um equilíbrio entre as taxas de síntese, agregação e eliminação. Um desequilíbrio entre estes mecanismos, causado pela disfunção de uma destas vias, pode resultar em níveis anormais desta proteína que pode favorecer a formação e/ou acumulação de espécies fibrilares ou oligoméricas, as quais podem ser tóxicas (Lashuel, Overk, Oueslati, & Masliah, 2013).

Os mecanismos propostos para descrever a toxicidade da α-Syn são agrupados em três classes : (a) Deformação mecânicas dos compartimentos/mecanismos celulares; (b) Aumento de funções com efeitos tóxicos; (c) ou perda de funções com efeitos tóxicos. Não sendo estes mecanismos necessariamente exclusivos, podem actuar de modo sinérgico (M. C. Bennett, 2005).

O modelo mais aceite para descrever a toxicidade da α-Syn incide sobre a permeabilização das membranas das células pelos agregados amilóides. Os olígomeros de α-Syn podem ligar-se às membranas lipídicas e romper a bicamada lipídica (Auluck, Caraveo, & Lindquist, 2010; B. van Rooijen, 2010; B. D. van Rooijen, Claessens, & Subramaniam, 2010). Certas formas oligoméricas de α-Syn mostraram a capacidade de penetrar nas membranas e formar poros (Giehm, Svergun, Otzen, & Vestergaard, 2011; Volles & Lansbury, 2003). Também foi proposto a permeabilização da membrana sem a formação de poros (Kayed et al., 2004).

Por outro lado, a disfunção da degradação da α-Syn devido à inibição do proteassoma pelas espécies agregadas e a produção de ROS, também foi proposto como um mecanismo possível para a neurotoxicidade dos agregados de α-Syn (M. C. Bennett, 2005; Brown, 2010). É possível que múltiplas espécies tóxicas de α- Sinucleína agregada estejam presentes in vivo e que recorram a diferentes mecanismos de toxicidade. Para além disso, diversos estudos indicam que a toxicidade da α-Syn pode estar associada à perda de funções (M. C. Bennett, 2005).

Diversas linhas de evidência sugerem que os olígomeros de α-Syn apresentam a espécie tóxica (V. N. Uversky, 2007). A forma oligoméricas da α-Syn deposita-se no cérebro de pacientes que apresentam uma triplicação no gene da α-Syn (Miller et al.,

2004). Por outro lado, a forma mutante A30P acelera fortemente a oligomerização da α-Syn o que retarda significativamente a formação de fibrilas maduras (K. A. Conway et al., 2000; J. Li, Vn, & Al, 2001, 2002). Diversos factos suportam a hipótese da toxicidade dos olígomeros : (i) em modelos celulares, a toxicidade é geralmente observada sem que haja agregação da α-Syn, indicando que são as espécies solúveis que mediam a toxicidade (Xu et al., 2002); (ii) In vitro, a agregação da α-Syn e a formação de depósitos de fracções insolúveis só é detectada após a morte celular (Gosavi, Lee, Lee, Patel, & Lee, 2002); (iii) Ratinhos transgénicos que expressam a α- Syn WT humana desenvolveram inclusões intraneuronais não-fibrilares em diversas áreas do cérebro, incluindo na SNpc (Masliah et al., 2000); (iv) Ratinhos transgénicos a expressar a α-Syn WT e a A53T exibiram neurodegeneração fora do SN sem apresentar inclusões fibrilares (van der Putten et al., 2000); (v) A expressão de α-Syn no SN de ratos levou a uma toxicidade dopaminérgica selectiva com inclusões não- fibrilares (Lo Bianco, Schneider, Ridet, Déglon, & Aebischer, 2002); (vi) As inclusões de α-Syn, em alguns modelos animais, não contêm fibrilas e, para além disso, as inclusões fibrilares na mosca podem ocorrer sem que haja neurodegeneração (Auluck & Bonini, 2002; Auluck, Chan, Trojanowski, Lee, & Bonini, 2002); (vii) A perda de neurónios dopaminérgicos foi mais elevada em ratinhos transgénicos a expressar olígomeros formados pelas mutações E53K e E57K em comparação com os ratinhos a expressar fibrilas pela mutação A53T (Winner & Jappelli, 2011).

Com base nestas e outras observações, tem sido sugerido que a formação dos CL tem um efeito protector na neurodegeneração indicando fortemente que a morte dos neurónios deve-se à formação de espécies protofibrilares (V. N. Uversky, 2007)

Desta forma, a base molecular da DP aparenta estar fortemente associada à formação de agregados de α-Syn, esta proteína pode adoptar inúmeras conformações diferentes e diversos estados de agregação dependendo de vários factores e condições. Qualquer um dos estados de agregação pode ser tóxico, contudo, acredita-se que a maior neurotoxicidade deve-se aos olígomeros (Breydo et al., 2012).

É importante ter noção que, apesar da DP ser caracterizada pela acumulação de depósitos contendo α-Syn, esta doença é multifactorial e cuja patogenia não pode ser explicada apenas com base na agregação da α-Syn. De facto, a natureza da DP é bastante complexa e pode ser provocada por diversos factores (M. C. Bennett, 2005).

Contudo, muitos dos factores que promovem a doença estão, directamente ou indirectamente, relacionados com alterações da α-Syn, assim a analise detalhada das

funções alterações e agregação desta proteína podem fornecer uma base importante para um futuro desenvolvimento de terapêuticas eficazes (Breydo et al., 2012).

Figura 9 – Proposta de Modelo da Toxicidade da α-Syn - Nas condições fisiológicas normais, a α-

Syn encontra-se num estado nativo unfolded. No entanto, em condições patológicas a α-Syn converte- se em espécies patogénicas misfolding (dímeros e olígomeros) com tendência a agregar e formar protofibrilas. Estas estruturas parecem estar relacionadas com a formação de inclusões de α-Syn semelhantes aos CL e neuritos de Lewy. As alterações genéticas podem acelerar este processo. Os sistemas celulares que previnem, revertem ou eliminam as proteínas misfolding (chaperonas, SUP, fagossoma, lisossoma) encontram-se sobrecarregados por estas espécies oligoméricas de α-Syn (indicado a tracejado). Dados recentes sugerem que a progressão da DP pode estar relacionada com a transmissão célula a célula das espécies patológicas de α-Syn. Pensa-se que a transmissão de α-Syn está associada a diversas consequências tóxicas inter-relacionadas. Permanece por esclarecer quais as espécies de α-Syn que são tóxicas para os neurónios. (Adaptado de Irwin, Lee, & Trojanowski, 2013)

Propagação da alfa-Sinucleína

Nas condições fisiológicas, a α-Syn tem sido considerada uma proteína sináptica exclusivamente intracelular que se associa às vesículas sinápticas (Iwai et al., 1995). Todavia, estudos recentes sugerem que os olígomeros da α-Syn podem ser eliminados dos neurónios através de mecanismos de secreção invulgares. A disseminação da α- Syn pode envolver diversos mecanismos tais como endocitose, transmissão transsináptica, penetração directa, através de receptores da membrana ou através exossomas. Estes agregados de α-Syn extracelular podem ser transferidos de um

neurónio para o outro assim como de um neurónio para uma célula da glia (Danzer et al., 2011; Emmanouilidou et al., 2010; Jao, Hegde, Chen, Haworth, & Langen, 2008; Tsigelny et al., 2012).

A propagação da α-Syn entre neurónios sugere que esta proteína tem propriedades similares às proteínas dos priões, as PrPsc _{(isoforma anormal da proteína do prião). As}

PrPsc _{provocam o enrolamento incorrecto da proteína do prião nativa e consequente}

agregação. Estes agregados disseminam-se no cérebro promovendo a neurodegeneração (Irwin et al., 2013).

Estudos realizados recentemente revelaram que, na autopsia de pacientes com DP que receberam implantes de tecido cerebral embrionário, os neurónios transplantados desenvolveram agregados similares aos CL uma década após o transplante, evidenciando a transmissão da α-Syn (Stefanova et al., 2009). Estas evidências foram confirmadas por um outro estudo, realizado em ratinhos transgénicos, que sugere que a ocorrência de transmissão da α-Syn das células neuronais do hospedeiro para as células neuronais percussoras transplantadas (Desplats et al., 2009). Este mesmo estudo demonstrou que a transmissão da α-Syn ocorre sem a necessidade de contacto directo entre as células, insinuando o envolvimento de vias específicas de secreção, exocitose ou endocitose (Desplats et al., 2009). Para além disso, a α-Syn foi detectada no líquido cefalorraquidiano, no plasma, na saliva e no parênquima cerebral o que suporta o envolvimento dos processos de secreção (Devic et al., 2011; El-Agnaf et al., 2003; Emmanouilidou et al., 2011; Tokuda et al., 2006). Além do mais, a distribuição dos CL descrita por Braak, pode ser interpretada como mais uma evidência da disseminação da α-Syn (Bellucci, Zaltieri, et al., 2012; Braak, Ghebremedhin, Rüb, Bratzke, & Del Tredici, 2004). Contudo são necessários mais estudos in vivo com o intuito de comprovar esta hipótese.

Também as proteínas misfolding podem favorecer a propagação da α-Syn através do aumento da associação desta proteína às vesículas (Jang et al., 2010). Foi demonstrado que a α-Syn WT e a forma mutada A53T ao serem libertadas pelos neurónios podem provocar uma resposta inflamatória em linhas celulares da microglia o que leva a sugerir que a α-Syn segregada pode contribuir fortemente para a neuroinflamação subjacente à DP, que por sua vez pode originar danos neuronais e sinápticos (Alvarez-Erviti, Couch, Richardson, Cooper, & Wood, 2011).

contribuindo, deste modo, para o início da disfunção sináptica na DP assim como, a disseminação da patologia pode estar na origem dos mecanismos tóxicos nas células receptoras (Bellucci, Zaltieri, et al., 2012). Foi provado recentemente, que as fibrilas