Funções da Sinfilina-

Assim como ocorre com a α-Syn, as funções da Sinfilina-1 permanecem pouco claras. Foi demonstrado, in vitro, que a Sinfilina-1 é fosforilada pela glicogénio sintetase quinase-3-beta (GSK3B) sugerindo que a Sinfilina-1 pode estar envolvida nos mecanismos de transdução do sinal e/ou degradação proteica, visto que a fosforilação está envolvida em diversos mecanismos fisiológicos, incluindo os referidos anteriormente (Tanji et al., 2003).

Deste modo, especulou-se que a fosforilação da Sinfilina-1 poderia desencadear a ubiquitinação e degradação desta proteína (Tanji et al., 2003). A identificação da Sinfilina-1 como substrato da Parkina ubiquitina ligase E3 levou a que se estabelece- se a possibilidade da Sinfilina-1 estar envolvida na função proteassomal (Chung et al., 2001; Krüger, 2004). Para além disso, foi descoberto que a Sinfilina-1 também é ubiquitinada e degradada por outras ligases E3: Dorfina, SIAH-1 e SIAH-2. Que por sua vez estão todas presentes nos CL em cérebros de pacientes com DP estando, portanto, relacionadas com os mecanismos neurodegenerativos (Ito et al., 2003; Liani et al., 2004; Nagano et al., 2003).

A relação da Sinfilina-1 com o proteassoma foi comprovada aquando da descoberta da interacção da Sinfilina-1 com a proteína S6 ATPase, que actua como uma subunidade reguladora do proteassoma 19S com funções de degradação de proteínas ubiquinadas, esta interacção reforça a possibilidade da Sinfilina-1 exercer um papel fisiológico como moduladora do SUP (Krüger, 2004; F. Marx et al., 2007).

Como foi referido anteriormente, os níveis de Sinfilina-1, durante o desenvolvimento, estão elevados nos terminais pré-sinápticos, havendo uma co- imunoprecipitação da Sinfilina-1 com as vesículas sinápticas. Deste modo, foi proposta a possibilidade da Sinfilina-1 exercer funções sinápticas em associação com a α-Syn, do mesmo modo, o facto da Sinfilina-1 aparentar uma forte interacção com as vesículas sinápticas sugere que esta possa interferir com o processo de libertação da dopamina, contudo, o papel exacto da Sinfilina-1 na libertação da dopamina permanece pouco claro (Büttner et al., 2010; Krüger, 2004; Nagano et al., 2003; Ribeiro et al., 2002).

A Sinfilina-1 localiza-se preferencialmente em torno de gotículas lipídicas e a sua sobre-expressão conduz a formação de inclusões membranares (Takahashi et al., 2006). Posteriormente, foi confirmada a sua localização preferencial em torno de

gotículas lipídicas num estudo em que se constatou que a Sinfilina-1 forma inclusões em células de levedura que aparecem, inicialmente, em focos distintos em endomembranas e gotículas lipídicas (Büttner et al., 2010). Desta forma, foi confirmada a localização desta proteína em torno de gotículas lipídicas o que comprova também a associação da Sinfilina-1 às vesículas sinápticas no cérebro. Foi corroborado, neste mesmo estudo, que a Sinfilina-1 interage com as jangadas lipídicas, tanto em dímero como em monómero, sendo que o dímero, no caso de ser uma proteína mutante, pode voltar a ser reduzido (Büttner et al., 2010).

3.2.3 Envolvimento na doença de Parkinson

A hipótese da Sinfilina-1 estar envolvida na fisiopatologia da DP surgiu após a

descoberta da interacção desta proteína com α-Syn. Comprovou-se que a co-expressão da Sinfilina-1 e da α-Syn, em culturas celulares, leva à formação de

agregados citoplasmáticos semelhantes aos CL (Engelender et al., 1999). Assim como acontece com a α-Syn, diversos estudos revelaram que a Sinfilina-1 é uma das proteínas constituintes dos CL em indivíduos com DP e encontra-se em corpos de inclusão presentes em diversas doenças pertencentes ao grupo das sinucleinopatias (Bandopadhyay et al., 2005; Murray et al., 2003; Wakabayashi et al., 2002, 2000).

Por outro lado, a descoberta de uma mutação pontual (R621C) no gene da Sinfilina-1, em dois pacientes germânicos com DP esporádica, veio comprovar o envolvimento desta proteína na DP (Marx et al., 2003). Para além disso, a Sinfilina-1 é um substrato da Parkina, uma proteína ubiquitina ligase E3, responsável pelas manifestações autossómicas recessivas de parkinsonismo juvenil e a co-expressão de ambas as proteínas leva ao aparecimento de inclusões intracelulares ubiquitinadas semelhantes aos CL (Chung et al., 2001).

Como já foi mencionado anteriormente, existem diversas evidências de disfunções do SUP na DP. Para além da função proteassomal se encontrar reduzida na SNpc na DP esporádica, também foram detectadas mutações relacionadas com a DP familiar, envolvendo proteínas relacionadas com o SUP como a Parkina e a UCL-L1 (Szargel, Rott, & Engelender, 2008). Apesar da Sinfilina-1 não estar localizada no SUP, possui a capacidade de interacção com diversas proteínas relacionadas como o SUP (Beyer et al., 2009) para além de que é ubiquitinada e degradada por este mesmo sistema (Szargel et al., 2008). A Sinfilina-1 interage com duas subunidades reguladoras do

SUP, S6 ATPase e a NUB1 (Beyer et al., 2009). A interacção com a S6 ATPase não só diminui a actividade proteassomal, como também a co-expressão destas proteínas, em simultâneo, leva ao aumento da formação de inclusões intracitoplasmáticas. Tanto a Sinfilina-1 como a S6 ATPase encontram-se presentes nos CL (Marx et al., 2007). A proteína NUB1 diminui os níveis de Sinfilina-1 em estado estacionário, o que pode ser indicativo que esta proteína pode estar envolvida na sinalização da Sinfilina-1 para posterior degradação pelo proteassoma, porém, o mecanismo exacto pelo qual a NUB1 acelera o processo de degradação da Sinfilina-1 e a identificação das ubiquinas ligases E3 envolvidas neste mecanismo permanece por investigar (R Szargel et al., 2008; Tanji et al., 2006).

A Sinfilina-1 interage e é ubiquitinada por diversas ubiquitinas Ligases E3: Parkina, Dorfina, SIAH-1 e SIAH-2 (Chung et al., 2001; Ito et al., 2003; Liani et al., 2004; Nagano et al., 2003). Relativamente à sua interacção com a Parkina, sabe-se que a co-expressão de ambas leva à formação de inclusões intracelulares ubiquitinadas que se assemelham aos CL, contudo, a Parkina não leva à degradação da Sinfilina-1 (Chung et al., 2001; Ross & Pickart, 2004; R Szargel et al., 2008)

Quanto à SIAH-1 e SIAH-2, ambas promovem a degradação da Sinfilina-1 (Liani et al., 2004). Contudo, a incapacidade do proteassoma de degradar a Sinfilina-1 ubiquitinada pela SIAH promove a formação de inclusões de Sinfilina-1. Tendo em conta que a ubiquitinação da Sinfilina-1 é essencial para a formação de inclusões, a forma mutada da Sinfilina-1, inábil de ser ubiquinada pela SIAH, não se agrega em corpos de inclusão (Liani et al., 2004). Este conjunto de informação, juntamente com o facto que a Sinfilina-1 isolada dos CL encontrar-se monoubiquitinada, sugerem que a ubiquinação pode representar um evento primário na formação de inclusões na DP (Szargel et al., 2008).

A fosforilação é uma modificação pós-traducional com capacidade de modular a ubiquitinação de diversas proteínas (Hershko & Ciechanover, 1998). Como já foi mencionado anteriormente, a α-Syn presente nos CL encontra-se não só fosforilada como também monoubiquitinada sugerindo, não só um envolvimento de ambos os mecanismos na DP, como também uma possível co-relação entre ambos (Anderson et al., 2006; M. Hasegawa et al., 2002)

Diversas quinases fosforilam a Sinfinlina-1 in vivo e alteram a sua tendência a agregar. A caseína quinase II fosforiliza a Sinfilina-1 diminuindo a interacção desta com a α-Syn e a formação de inclusões. Contudo a ubiquitinação da Sinfilina-1 não

sofre alterações (Avraham, Szargel, Eyal, Rott, & Engelender, 2005; G. Lee et al., 2004). O que implica que a formação de inclusões de Sinfilina-1 possa depender de outros factores para além da ubiquitinação, como a fosforilação e a interacção com a α-Syn (Szargel et al., 2008).

Existem diversas evidências indicativas que certas proteínas quinases, como a GSK3B e a Cdk5, modulam a neurodegeneração de neurónios dopaminérgicos em modelos farmacológicos da DP (G. Chen et al., 2004; P. D. Smith et al., 2003). Foi demonstrado que a Sinfilina-1 endógena é fosforilada pela GSK3B levando a uma diminuição da ubiquitinação da Sinfilina-1 e da formação de inclusões. Ao passo que, ao inibir a fosforilação da Sinfilina-1 pela GSK3B, ocorre um aumento significativo de formação de inclusões de Sinfilina-1 (Avraham et al., 2005). Estes resultados reforçam a hipótese de a ubiquitinação da Sinfilina-1 ser importante para a agregação desta proteína, contudo, de um modo dependente da fosforilação (Szargel et al., 2008).

In vivo, a Parkina é fosforilada pela proteína Cdk5, levando a uma diminuição da autoubiquitinação e da capacidade de ubiquitinar a Sinfilina-1 (Avraham, Rott, Liani, Szargel, & Engelender, 2007). Por outro lado, a forma mutante da Parkina, S131A, é mais efectiva na ubiquitinação da Sinfilina-1 e promove uma maior formação de corpos de inclusão. Confirma-se, deste modo, o envolvimento da Parkina na formação de inclusões de Sinfilina-1 (Avraham et al., 2005; R Szargel et al., 2008).

Pode-se concluir que a ubiquitinação da Sinfilina-1 é modulada por diversas proteínas quinases, podendo contribuir fortemente para a formação dos CL na DP (R Szargel et al., 2008)

Inúmeros estudos evidenciam a ocorrência de elevados níveis de stress oxidativo na DP, podendo contribuir de forma significativa para a neurodegeneração ocorrente na DP (Dexter & Jenner, 2013; A. Xie, Yu, & Xu, 2010). Foi realizado um estudo para observar a influência da Sinfilina-1 na expressão da SOD. A SOD é uma enzima antioxidante de elevada importância, estudos in vitro e in vivo demonstraram os efeitos neuroprotectores da SOD e, para além disso, a expressão reduzida de SOD pode estar envolvida na patogénese da DP (Boll, Alcaraz-Zubeldia, Montes, & Rios, 2008; A. Xie et al., 2010). Os resultados obtidos demonstraram uma elevada expressão de Sinfilina-1 na SNpc e uma significativa diminuição da expressão de SOD, o que corrobora estudos realizados previamente (Krygowska-Wajs et al., 2008; A. Xie et al., 2010). Estes resultados são indicativos que a Sinfilina-1 pode influenciar

a patogénese da DP através da diminuição dos níveis de SOD que, consequentemente, leva a um aumento de ROS e dos níveis de stress oxidativo (A. Xie et al., 2010).

Um estudo realizado por Li et al., demonstrou que a superexpressão da Sinfilina-1 diminuiu o tempo de duplicação celular e aumentou o desenvolvimento de neuritos e, também, diminuiu significativamente a morte celular induzida pela rotenona. Estes resultados, indicam que a Sinfilina-1 apresenta efeitos neurotrófico, in vitro, e que pode desempenhar um papel protector na fisiopatologia da DP (X. Li et al., 2010).

Sinfilina R621C

A mutação no gene da Sinfilina-1 foi identificada pela primeira vez em dois pacientes germânicos com DP esporádica e, aparentemente, não relacionados. Foi decifrada uma transição de Citosina para uma Tirosina na posição 1861 na sequência codificante, levando a uma substituição de uma Arginina por uma Cisteina na posição 621 da cadeia de aminoácidos (Marx et al., 2003).

Ao ser analisada, a mutação R621C revelou diminuir a viabilidade das células em comparação com a Sinfilina-1 WT, apresentando uma maior susceptibilidade a estímulos apoptóticos e ao stress oxidativo (X. Li et al., 2010; F. P. Marx et al., 2003). Num estudo realizado por Krenz et al. em ratinhos, ambas as formas mutadas e WT levaram à formação de inclusões e à degeneração de neurónios dopaminérgicos na SNpc , contudo, a Sinfilina R621C induziu uma maior formação de agregados do que a WT em ratinhos transgénicos A30P α-Syn, o que é consistente com o facto da mutação R621C ser um factor de susceptibilidade para a DP (Krenz, Falkenburger, Gerhardt, Drinkut, & Schulz, 2009).

Sinfilina-1A

A Sinfilina-1A é uma isoforma da Sinfilina-1 resultante do splicing alternativo, esta variante tem um codão inicial diferente da Sinfilina-1, não apresentando os primeiros 394 aminoácidos do codão inicial da Sinfilina-1 e contém 28 aminoácidos adicionais na região N-terminal e 51 aminoácidos adicionais na região C-terminal (Szargel et al., 2008).

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Figura 11 - Representação Esquemática da Sinfilina-1 e da Sinfilina-1A (Adaptado de R Szargel et

al., 2008)

A Sinfilina-1A apresenta elevada toxicidade celular e encontra-se presente nos CL na DP. Esta proteína mostra uma propensão para agregar espontaneamente nas células dopaminérgicas humanas, e tem a capacidade de agregação sem que haja inibição da actividade proteassomal, ao passo que a Sinfilina-1 apenas forma agregados quando há inibição do sistema proteassomal (Eyal & Engelender, 2006; Eyal et al., 2006).

Esta proteína interage tanto com a Sinfilina-1 como com a α-Syn, tendo a capacidade de recrutar ambas as proteínas para dentro de corpos de inclusão (Szargel et al., 2008). A capacidade da Sinfilina-1A de recrutar a α-Syn e a acumular dentro de inclusões sugere um função neuroprotectora dos corpos de inclusão contra a toxicidade da Sinflina-1A (Szargel et al., 2008). A percentagem exacta de Sinfilina- 1A nos CL não é conhecida, contudo, o facto de interagir tanto com a Sinfilina-1 como com a α-Syn sugere que esta proteína possa estar envolvida na formação dos CL (Eyal & Engelender, 2006; Szargel et al., 2008). Para além disso, devido à sua neurotoxicidade intrínseca, mudanças na força de interacção entre a Sinfilina-1A e a α-Syn podem não só influenciar a formação de CL como também a morte de neurónios dopaminérgicos (Beyer et al., 2009; Eyal et al., 2006).

A Sinfilina-1A actua, também, como reguladora da SIAH, diminuindo a actividade da ubiquitina ligase E3 SIAH. Esta proteína também diminui a monoubiquitinação da α-Syn promovida pela SIAH assim como a formação de inclusões de α-Syn. Por outro lado, a SIAH ubiquitina a Sinfilina-1A e aumenta a formação de inclusões mas não promove a sua degradação. Estes dados sugerem que a Sinfilina-1A tem a capacidade de regular a actividade da SIAH, com implicações na regulação da monoubiquitinação e agregação da α-Syn (Szargel et al., 2009).