3.1.4 Estudo das Propriedades Físico-Químicas
3.1.4.2 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
O espalhamento de luz é uma das metodologias muito utilizada na caracterização de polímeros em solução. A técnica divide-se em espalhamento de luz estático (SLS – static light scattering) e dinâmico (DLS - dynamic light scattering), no SLS mede-se a intensidade média da luz espalhada por um conjunto de partículas para o espalhamento estático e no DLS mede- se as flutuações da intensidade do espalhamento em função do tempo. A técnica de espalhamento de luz dinâmico também é denominada por espectroscopia de correlação de fótons (PCS - photon correlation spectroscopy) e espalhamento de luz quase elástico (QELS - quasi-elastic light scattering).
2 2 ( ) . ( ) ( ) ( ) I t I t g t I t
Em espalhamento de luz, um feixe de luz monocromático (normalmente uma fonte de laser de He-Ne) incide sobre uma amostra e a onda eletromagnética original é espalhada para todas as direções. A intensidade de luz espalhada é detectada por uma fotomultiplicadora. O módulo do vetor de espalhamento (q) é definido pela Equação 3.11. O valor de q é a diferença vetorial entre o vetor de onda da radiação incidente (magnitude 2 / ) e o vetor de onda da luz espalhada (aproximadamente igual à radiação incidente).
(3.11) Em que: - ângulo de espalhamento; n - índice de refração do solvente onde as partículas 0
estão imersas e - comprimento de onda da luz incidente.
Nos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, a intensidade da luz espalhada, em curtos intervalos de tempo, é registrada como uma função do tempo e as flutuações nessa intensidade da luz espalhada são observadas como consequência das flutuações de concentração no volume de espalhamento. A origem das flutuações são as variações no índice de refração dentro do volume de espalhamento, devido ao movimento Browniano das partículas (Lucas, Soares et al., 2001). O sinal da radiação é transformado por meio de um correlator em função de correlação temporal.
(3.12) A função g2 (t) pode ser relacionada com a função de correlação do campo elétrico g1 (t) através da relação de Siegert.
(3.13) Em que: B é um parâmetro instrumental.
Para um conjunto de espalhadores monodispersos, g1 (t) está relacionada com a
frequência de relaxação das partículas:
1 exp g t (3.14) t 0 4 2 n q sen
2 21
1g
t
B g
t
Em que: = 1/ é a frequência de relaxação das partículas (Heineck, Cardoso et al., 2008). Enquanto que para um sistema polidisperso, g t1
Aexp(t).Através dos experimentos de espalhamento de luz dinâmico, é possível determinar o coeficiente de difusão (D) de macromoléculas em solução a partir do valor da freqüência de relaxação ( ) obtido da análise de uma função de correlação temporal, segundo a Equação 3.15, em que q é o vetor de onda da luz espalhada (Lucas, Soares et al., 2001).
(3.15) A partir do valor de D, é possível determinar o raio hidrodinâmico (RH) da partícula esférica espalhante através da equação de Stokes-Einstein, em que: é a viscosidade do solvente a uma dada temperatura (T) e é a constante de Boltzmann (Equação 3.16). B
(3.16)
Para um grande número de processos de relaxação independentes, g1(t) é a soma das contribuições dos processos individuais e g1(t) pode ser expressa através da distribuição contínua de relaxação, indicada na Equação 3.17. Em que A() é a distribuição da luz espalhada em função do tempo de relaxação.
0 1 exp d t A t g (3.17)Podemos também interpretar os dados de espalhamento de luz dinâmico através da função de correlação temporal, que é descrita por uma exponencial simples, seguida de tempos maiores através de uma extensão exponencial, em que Af + As = 1.
se s f f A t A t g1 exp 1 exp (3.18) 2.
D q
6 B H k T R D Os parâmetros Af e As correspondem às amplitudes dos modos de relaxação rápido (―fast‖) e lento (―slow‖), respectivamente. A variável le é o tempo de relaxação efetivo, e (0 1) é uma medida da distribuição dos tempos de relaxação.
Em geral, o modo de relaxação rápido reflete o movimento das cadeias de polímeros relativas ao solvente. O modo de relaxação lento está associado à relaxação de um conjunto de cadeias individuais ou agregado.
A Figura 3.21 ilustra flutuações temporais na intensidade de luz espalhada por dispersões de partículas grandes e dispersões de partículas pequenas. O movimento lento de partículas grandes causa lentas alterações na intensidade da luz espalhada. Enquanto que, a movimentação rápida de partículas pequenas provoca uma flutuação muito rápida na intensidade de luz espalhada. As flutuações de intensidade de luz espalhada ao longo do tempo são representadas através de uma função de correlação de tempo. Para partículas pequenas, a função de correlação entre as intensidades diminui mais rapidamente com o tempo, do que no caso de partículas grandes (Lim, Yeap et al. 2013).
Figura 3.21 – Esquema da medida da intensidade de luz espalhada (a) e a sua correspondente função de correlação (b) obtida por espalhamento de luz dinâmico
Fonte: (Lim, Yeap et al., 2013)
As análises de DLS fornecem informações sobre a distribuição dos tamanhos das partículas poliméricas, sejam as macromoléculas livres em solução (individuais) ou
agregadas. Além disso, DLS é uma técnica muito sensível para investigar a presença de agregados, pois a intensidade do espalhamento de luz aumenta significativamente com o aumento do diâmetro da partícula (d). Mesmo uma população muito pequena de agregados resulta em uma alta intensidade de espalhamento de luz (I α d6). Por isso, DLS tem sido
extensivamente empregado para estudar o comportamento de agregação de diversos polímeros em meio aquoso, dentre eles, a quitosana (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013; Chen, Hsu et al., 2011; Philippova, Korchagina et al., 2012; Popa-Nita, Acouffe et al., 2010).
O fenômeno de agregação das cadeias de quitosana em meio aquoso ácido, estudado por DLS, tem sido atribuído principalmente a três efeitos: (a) os grupos acetamido residuais, (b) a desprotonação dos grupos amino e (c) a concentração polimérica. Mais recentemente, novos aspectos têm sido abordados, porém, o exato mecanismo de agregação em soluções de quitosana ainda não está totalmente compreendido (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013; Chen, Hsu et al., 2011, Philippova, Korchagina et al., 2012).
De acordo com os resultados de medidas de DLS de soluções de quitosana em regime diluído, na ausência de sal e com os grupos amino completamente protonados, obtém-se uma única distribuição de tamanho de partícula, com raio hidrodinâmico observado em torno de 25 nm para as amostras de quitosana com até 70 % de grau de desacetilação. Nesse caso, as cadeias encontram-se isoladas em solução e assumem uma condição de máxima hidratação e expansão das cadeias poliméricas. Conforme os grupos amino protonados sofrem neutralização, uma segunda população com raio hidrodinâmico médio de 250 nm é obtida. Essa nova distribuição foi atribuída à formação de nano-agregados de natureza hidrofóbica. O aumento do diâmetro das partículas de quitosana em solução em função do aumento do GA foi relacionado aos grupos acetamido, em razão do seu caráter hidrofóbico, que contribuem para as interações atrativas em solução aquosa. A formação dos agregados também foi favorecida com o aumento da concentração, especialmente acima da concentração crítica, c*. Nesse caso, os agregados são obtidos em solução com os grupos amino completamente desprotonados, e as associações foram atribuídas ao aumento das ligações de hidrogênio (Domard, 2011; Schatz, Pichot et al., 2003).
A Figura 3.22 apresenta dados de experimentos de DLS para quitosana em solução aquosa em regime diluído e em alta concentração salina. O aumento do grau de acetilação favorece a formação de agregados (RH ~ 300 nm) e a formação de aglomerados em escala
micrométrica. Segundo Popa-Nita e colaboradores (2010), o aumento da concentração favoreceu a população de maior tamanho de aglomerados. A Figura 3.22 também mostra que os agregados foram removidos em processos de filtração das soluções (0,45µm - Millipore), resultando em apenas um modo de relaxação atribuído às cadeias isoladas. Entretanto, os colaboradores verificaram que, com o aumento da concentração de polímero, não ocorre remoção completa dos agregados por filtração ou os agregados são regenerados em um tempo curto, existindo um equilíbrio dinâmico entre cadeias livres e agregadas. Esses resultados demonstram que os agregados não são originados da dissolução incompleta do polímero. As dimensões dos agregados e dos clusters dependem das características estruturais da quitosana e da constituição da solução (concentração, solvente, agente de neutralização, força iônica, temperatura, etc) (Popa-Nita, Acouffe et al., 2010).
Figura 3.22 – Distribuição normalizada em função do tempo de relaxação () e RH ( = 90 °; concentração de quitosana 0,01 % (m/m); solução de ácido acético 0,2 M/acetato de amônio 0,15 M; pH 4,5)
Fonte: (Popa-Nita, Acouffe et al., 2010)
Blagodatskikh e colaboradores (2013) estudaram a influência de procedimentos de filtração das soluções diluídas de oligômeros de quitosana e o fenômeno de agregação das partículas através da técnica de DLS. Os colaboradores verificaram que o tamanho de poro (1,2; 0,45; 0,2 µm) e o material da membrana (éster de celulose ou fluoreto de polivinilideno –PVDF) utilizada na filtração das amostras afetam os resultados de agregação. Quanto maior a porosidade do filtro, maior é o tamanho do RH dos agregados. Considerando a mesma
porosidade e o tipo de material diferente das membranas, quando se utiliza filtro de celulose, os agregados em solução não são eliminados, porém, com o uso de filtro de PVDF, os agregados são desfeitos. Outro dado interessante é a regeneração dos agregados em solução após o procedimento de liofilização da solução previamente filtrada em PVDF, seguida de re-
dissolução e submissão à análise de DLS sem filtração adicional. Para o mesmo processo anterior, porém submetendo a uma nova filtração em PVDF antes do ensaio de DLS, novamente os agregados são desfeitos. Os estudos de espalhamento de luz mostraram que os oligômeros de quitosana, em soluções diluídas, se encontram parcialmente associados em toda faixa de pH abaixo do pH crítico, antes da separação de fase, em solventes de diferentes forças iônicas (ácido acético 0,1 M; ácido acético 0,1 M/acetato de sódio 0,3 M pH 5,4). No entanto, em análises de cromatografia de exclusão por tamanhos de alto desempenho e de viscosimetria, não se observa a influência da filtração. Esses resultados foram atribuídos à ação de cisalhamento (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013).
O comportamento de agregação da quitosana em solução tem sido reconhecido por muitos pesquisadores, especialmente, quando os grupos acetamido presentes na quitosana formam longas sequências ao longo das cadeias poliméricas. Sugere-se que estes grupos interagem entre si através de ligações de hidrogênio, além das interações hidrofóbicas devido aos grupos acetamido presentes na estrutura química do biopolímero. No que se refere à quitosana com distribuição aleatória das unidades acetiladas, os dados disponíveis sobre o efeito do GA no seu comportamento de agregação mostram contradições. As agregações são mais pronunciadas com valores de GA 50 – 60 %, atribuídas às interações hidrofóbicas pelos grupos acetamido. Entretanto, essas amostras apresentam maior solubilidade e menor cristalinidade, indicando interações intermoleculares mais fracas, devido aos impedimentos estéricos causados pelos grupos acetamido (Kubota, Tatsumoto et al., 2000; Philippova, Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Em geral, o comportamento de melhor solubilidade de quitosana com GA 50 % observa-se, principalmente, para as amostras obtidas por re-acetilação homogênea proveniente de quitina totalmente desacetilada. Por outro lado, o comportamento de agregação de quitosana com GA alto é frequentemente encontrado para as amostras preparadas por desacetilação parcial de quitina. Neste caso, espera-se que algumas zonas cristalinas permaneçam, como resultado de uma dissolução incompleta do polímero (Philippova, Korchagina et al., 2012).
De acordo com a Figura 3.23, as amostras de quitosana podem apresentar agregação em meio ácido, de forma independente da quantidade de grupos acetamido presentes na estrutura da quitosana. Os resultados de DLS para quitosana com GA = 0 mostram a formação
de agregados intermoleculares e cadeias livres com o raio hidrodinâmico de 145 nm e 17 nm, respectivamente, em condições de solvente-. Além disso, a fração da intensidade de espalhamento de luz para as cadeias isoladas da amostra completamente desacetilada é muito menor do que para a quitosana acetilada (GA 56 %). A quitosana GA = 56 % mostrou uma tendência menor para agregação. Estas observações demonstram que a agregação em soluções aquosas ácidas de quitosana não é principalmente devido às interações entre os grupos acetamido. Portanto, esses resultados contrariam a condição geralmente admitida de que as interações entre as unidades acetiladas são a principal causa da agregação (Philippova, Korchagina et al., 2012).
Figura 3.23 – Função de distribuição normalizada do raio hidrodinâmico a) GA 0 % e b) GA 56 % ( = 90°; concentração de quitosana 1,2 x 10-3 mol/L em 0,3 M de ácido acético/0,05 de acetato de sódio)
Fonte: (Philippova, Korchagina et al., 2012)
A agregação das amostras de quitosana desacetiladas pode ser explicada pela sua elevada capacidade de cristalização, em razão da estrutura ser mais regular com a ausência de grupos laterais volumosos, facilitando o empacotamento das macromoléculas. A cristalização é reforçada por numerosas ligações de hidrogênio intra e intermoleculares (Philippova, Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Philippova e colaboradores (2012) também verificaram o efeito da filtração de soluções de quitosana em função do fenômeno de agregação. Soluções de quitosana foram filtradas em filtro de acetato de celulose com poros de diâmetro menor do que o tamanho dos agregados obtidos em solução. Ainda assim, os agregados permaneceram em solução, indicando que os agregados estão em equilíbrio dinâmico com as macromoléculas individuais.
as macromoléculas dissolvidas e não devido às partículas insolúveis. A adição de ureia na solução de quitosana enfraqueceu a agregação, confirmando que ligação de hidrogênio e/ou interações hidrofóbicas são parcialmente responsáveis pelas agregações. Portanto, o efeito parcial da ureia na agregação da quitosana pode ser resultado da formação de domínios cristalinos, que tornam as ligações de hidrogênio inacessíveis e/ou mais estáveis à ureia (Philippova, Korchagina et al., 2012; Sogias, Khutoryanskiy et al., 2010).
Devido à existência de interações eletrostáticas em polieletrólitos, como a quitosana em solução aquosa ácida, geralmente, os estudos sobre as propriedades hidrodinâmicas de polieletrólitos têm sido realizados em soluções com adição de sal para blindar as cargas dos grupos iônicos ao longo das cadeias e, consequentemente, minimizar as repulsões eletrostáticas.
Chen e colaboradores (2011) estudaram o comportamento de agregação de amostras de quitosana (GA 30 % e 7,3 %) em soluções de diferentes concentrações de sal (0,01 - 0,5 M) através de DLS. O aumento da força iônica e um maior grau de acetilação favoreceram o aumento do raio hidrodinâmico da quitosana em solução diluída. Em solução com força iônica média (I = 0,1), para a amostra com grau de acetilação maior e através da diminuição do ângulo de espalhamento de luz de 90º para 30°, houve a identificação de agregados. Enquanto que a diminuição da força iônica (I = 0,01) contribuiu para a observação de agregados independente do grau de acetilação. A Figura 3.24 exibe uma representação das espécies de quitosana (GA 30 %) em solução aquosa ácida, em diferentes forças iônicas (I) (Chen, Hsu et al., 2011).
Em sistema de baixa força iônica (I = 0,01 M) (Figura 3.24 (a)), há dois modos de relaxação para as soluções. O modo de relaxação rápido pode ser resultado do acoplamento do movimento entre as cadeias de policátions e os contra íons do solvente, enquanto que o modo de relaxação lento pode ser atribuído à formação de estruturas agregadas em solução de força iônica baixa.
Em meios de força iônica média (I = 0,1 M) (Figura 3.24 (b)), as macromoléculas de quitosana encontram-se isoladas e em pequena quantidade de agregados em solução. A blindagem das cargas da quitosana (ou a diminuição da densidade de prótons da quitosana com a inibição da repulsão eletrostática) resultou na compactação das cadeias. Embora, o
solvente utilizado (ácido acético 0,2 M/ de acetato de sódio 0,1 M) seja considerado um bom solvente para a quitosana, provavelmente, para a amostra com GA mais elevado, possa proporcionar uma redução da qualidade do solvente, favorecendo as interações hidrofóbicas como também as ligações de hidrogênio, causando agregações entre as cadeias e, consequentemente, o aumento do raio hidrodinâmico. A compactação intra-cadeia gera a diminuição do volume hidrodinâmico da quitosana e a associação inter-cadeias causa a formação de agregados, aumentando o raio hidrodinâmico.
Em soluções de força iônica elevada (I ≥ 0,2 M) (Figura 3.24 (c)), o aumento de sal em solução diminui a hidratação da quitosana, favorecendo a formação de interações
hidrofóbicas e a associação entre as macromoléculas compactas, promovendo o aumento na
concentração deagregados.
Figura 3.24 – Modelo representativo de espécies de agregados de quitosana GA 30 % em solução com diferentes forças iônicas (concentração de polímero 0,40 mg/mL, solução aquosa de ácido acético 0,10 M)
Fonte: (Chen, Hsu et al., 2011)
Segundo Chen e colaboradores (2011), deve-se destacar que a intensidade de luz espalhada das soluções de quitosana diminui significativamente com a redução da força iônica do meio no intervalo estudado. Com a força iônica do meio suficientemente baixa, uma pequena quantidade de agregados foi exibida. Entretanto, em uma força iônica maior, os agregados poderiam estar ocultos devido a um sinal de espalhamento de luz intenso do polieletrólito em solução, sendo detectado apenas através da diminuição da intensidade de luz espalhada. Outra abordagem referente à agregação em soluções ácidas de baixa força iônica resulta da interação atrativa de variações dipolares em solução. O processo teria origem em
uma pequena quantidade de espécies comparadas à estrutura da quitina presentes em solução. Neste caso, as espécies e os grupos amino protonados da quitosana poderiam distribuir-se de forma assimétrica. Embora existam as repulsões eletrostáticas, as ligações de hidrogênio poderiam ser favorecidas entre as espécies comparadas à quitina e, assim, gerar uma distribuição assimétrica entre os grupos em solução, favorecendo interações atrativas resultantes de variação dipolar na solução. O resultado seria a agregação das moléculas com as espécies semelhantes à quitina e esse processo de agregação seria diferente daquele encontrado em soluções de elevada força iônica (Chen, Hsu et al., 2011).
Geralmente, a avaliação das propriedades hidrodinâmicas da quitosana, assim como para os polieletrólitos em solução em análises de DLS, é realizada em solução aquosa salina. No caso da quitosana, em presença de sal ocorre à blindagem dos grupos amino carregados positivamente pelos contra íons do sal e, consequentemente, as fortes interações eletrostáticas entre as cadeias poliméricas são reduzidas (Blagodatskikh, Bezrodnykh et al., 2013; Chen, et
al., 2011; Philippova e Korchagina, 2012; Philippova, Korchagina et al., 2012; Popa-Nita,
Acouffe et al., 2010). Embora o pH altere significativamente os sistemas constituídos por
cargas positivas e/ou negativas e, por conseguinte, as propriedades em solução de um polieletrólito, existem poucas publicações que relatam estudos sobre a quitosana e seus derivados em solução aquosa na ausência de sal (Liu, Xu et al., 2009; Pa e Yu, 2001, Schatz,
Pichot et al., 2003).
Os resultados de análises de DLS obtidos em ângulo de espalhamento de luz de 25º por Pa e Yu (2001) revelaram dois modos de relaxação com duas distribuições de tamanhos de partículas para as soluções aquosas de quitosana em ácido acético, na ausência de sal. O aparecimento do modo lento em soluções de quitosana em meio ácido foi atribuído ao conjunto de várias moléculas de quitosana, tendo o raio hidrodinâmico do agregado aumentado com a diminuição do valor de pH da solução. Segundo os colaboradores, a ligação entre os íons dos grupos aminos protonados pertencentes às moléculas da quitosana e os íons carregados negativamente (acetato) do solvente causaram a formação de agregados. A expansão da cadeia da quitosana e a interação com o contra íon podem reduzir a distância entre as moléculas de quitosana e favorecer a formação de aglomerados (Pa e Yu, 2001).
A agregação da quitosana pode ser facilmente afetada pelo pH da solução, já que o mesmo altera o grau de dissociação das cadeias poliméricas. Em alguns casos, agregados de
quitosana são formados em solução aquosa ácida com a diminuição do pH e distanciamento do pH crítico, quando as cadeias poliméricas estão completamente carregadas e em sua hidratação máxima. Nestas amostras, a atração entre os grupos associativos pode ser tão forte que supera tanto a repulsão eletrostática entre as cadeias quanto a perda da entropia derivada dos contra íons que estão localizados no interior dos agregados (Pa e Yu, 2001; Philippova e Korchagina, 2012).
De um modo geral, a tendência de agregação torna-se mais pronunciada com o aumento do pH para as proximidades do pH crítico da quitosana, antes de ocorrer a precipitação do polímero (Philippova e Korchagina, 2012). Esse fato é atribuído, em parte, à diminuição da quantidade das espécies protonadas (NH3+), que impedem a agregação das
macromoléculas através das repulsões eletrostáticas. Além disso, os grupos neutralizados (NH2) podem formar ligações de hidrogênio adicionais estabilizando o estado agregado. Esta
agregação, que antecede a precipitação do polímero, é reversível e pode ser comprovada por histerese (Schatz, Pichot et al., 2003).
Kulikov e colaboradores (2012) demonstraram que os oligômeros de quitosana também podem formar agregados em soluções diluídas. A Figura 3.25 apresenta a distribuição dos raios hidrodinâmicos de cadeias individuais e de agregados de tamanhos distintos para os oligômeros. Embora a quantidade de grupos amino protonados varie de acordo com o pH, os raios hidrodinâmicos dos agregados permaneceram com valores constantes em quase toda faixa de pH ácido. Este resultado pode ser atribuído à condensação iônica, os contra íons localizam-se perto dos sítios carregados das cadeias poliméricas e, consequentemente, a carga efetiva das macromoléculas torna-se praticamente a mesma. No entanto, próximo ao pKa, pH 6,42, além dos agregados menores, também foram observados
agregados com dimensões maiores. As amostras analisadas por DLS foram previamente