Estágio no Institut Nacional de la Transfusion Sanguine INTS, Paris, France.

(18/03 – 29/03/2019)

Durante o doutorado foi realizado um estágio no Biologie Intégrée du Globule Rouge, UMR_S 1134, INTS, Paris, France.

O objetivo deste estágio foi aprender e desenvolver a capacidade técnica e intelectual para empregar uma técnica microfluídica para investigar o papel das plaquetas nas interações de células de sangue total (neutrófilos e plaquetas) com camada de células endoteliais.

Material e métodos:

Preparo da célula endotelial: As células endoteliais (células endoteliais microvasculares humanas (hmec, ATCC)) foram preparadas e cultivadas diretamente no chip por 48h (1x10 7 _{anos de células/ml) de reperfusão com uma bomba Kima (cellix}

Ltd, Irlanda). 24h antes do experimento, essas células foram estimuladas com TNF-α (10 ng/ml).

Preparação de sangue total para ensaios de depleção de plaquetas: Amostras de sangue de periférico de indivíduos saudáveis foram coletadas em heparina e separadas em dois tubos, foram centrifugadas (120 g) para o isolamento do plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP de um dos tubos foi removido e submetido a uma centrifugação adicional de alta velocidade (1200 g) para a remoção do sedimento da plaqueta.

O plasma pobre em plaquetas (PPP) obtido a partir de um tubo foi então substituído no sangue de permanência (sangue empobrecido de plaquetas), enquanto o PRP do outro tubo foi cuidadosamente homogeneizado com as plaquetas peletizadas e esta mistura foi devolvida às células sanguíneas remanescentes (sangue rico em plaquetas). As amostras foram submetidas a contagem de células automatizadas (contador Coulter) para garantir depleção de plaquetas (ou não) sem depleção de leucócitos.

Após este procedimento as amostras foram incubadas com TNF-α (10 ng/ml), ou não, e marcadas com CD16 Alexa fluor 488-anticorpo monoclonal (para marcação de neutrófilos, Biolegend) por 1 hora.

As seguintes suspensões celulares foram aplicadas às camadas de células endoteliais utilizando a plataforma microfluídica.

- Sangue rico em plaquetas (PRP)

- Sangue rico em plaquetas + TNF-α (PRP + TNF-α)

-Sangue pobre de plaquetas (PPP)

- Sangue pobre em plaquetas + TNF-α (PPP+ TNF-α)

Protocolo de ensaio microfluídico: biochips (VENAEC, cellix Ltd) foram revestidos com uma monocamada de células endoteliais microvasculares humanas (HMEC, ATCC) e ativadas por TNFα (10 ng/ml), por 24 h antes do ensaio de adesão, conforme descrito anteriormente.

As amostras de sangue foram perfundidas com revestimento HMVEC nos canais a 1 dine/cm2 por 5 minutos na plataforma microfluídica (Cellix Ltd, Irlanda) usando a bomba exigo (Cellix Ltd, Irlanda). Após esse período, os canais foram fotografados em quatro campos representativos de adesão celular geral nos tempos de 20, 25 e 30 minutos após o início do experimento. No final do experimento, os canais foram lavados com PBS por 5 min e as células foram então fixadas com paraformaldeído a 1% e glutaraldeído a 0,025% durante a noite.

Análise de adesão celular

A adesão dos neutrófilos a HMEC foi determinada usando o software ImageJ e a área ocupada pela fluorescência dos neutrófilos foi quantificada. Onze fotos foram tiradas de cada canal em cada momento experimental. As áreas de fluorescência foram calculadas em cada foto e cada uma é apresentada no gráfico. Para microscopia

confocal, uma foto representativa por canal foi tirada com uma ampliação de 20x e a análise 3D foi realizada com uma ampliação de 40x para cada canal, para verificar a sobreposição das células no processo de adesão.

Resultados:

A presença de plaquetas aumenta significativamente a adesão de neutrófilos em comparação com as camadas celulares endoteliais, mesmo após a estimulação com TNF-α.

As fotos tiradas nos canais 20, 25 e 30 minutos após o início do experimento mostram que o sangue rico em plaquetas demonstrou uma quantidade significativamente maior de adesão de neutrófilos ao HMEC quando comparado ao sangue com redução de plaquetas. Essa diferença foi ainda maior após a estimulação do TNF-α, como mostra a Figura 5.

A Figura 6 demonstra os agregados entre neutrófilos e plaquetas presentes nos 4 grupos diferentes. As imagens em 3D indicam que a redução na adesão de neutrófilos parece estar correlacionada com a redução de plaquetas (Figura 7), pois é possível observar que todos os neutrófilos aderidos a HMEC são aderidos primeiro e/ou juntamente com as plaquetas.

Figura 5: porcentagem de neutrófilos aderidos a HMEC após 60 min de incubação de amostras de sangue periférico de indivíduos saudáveis com TNF-α (ou não). Os neutrófilos foram marcados usando anticorpo anti-CD16 (n = 2). O TNF-α foi utilizado a 10ng / mL. Teste estatístico: Anova one-way seguido de Bonferroni (n=2).

Sangue rico em plaquetas (PRP) / Sangue rico em plaquetas + TNF-α (PRP + TNF-α) / Sangue sem plaquetas (PPP) / Sangue sem plaquetas + TNF-α (PPP + TNF-α)

PRP PRP + TNF- PPP PPP+TNF- 0 20 40 60 80 20 min p<0.001 p<0.05 p<0.0001 NS % á re a n e u tr ó fi lo s a d e re n te s PRP PRP + TNF- PPP PPP + TNF- 0 20 40 60 80 p<0.001 25 min % á re a n e u tr ó fi lo s a d e re n te s p<0.001 p<0.001 p<0.05 PRP PRP + TNF- PPP PPP + TNF- 0 20 40 60 80 30 min p<0.001 % á re a n e u tr ó fi lo s a d e re n te s p<0.001 p<0.0001 p<0.0001

Figura 6: Imagens representativas de plaquetas aderentes, neutrófilos e glóbulos vermelhos aderidos a HMEC 60 min após a incubação de amostras de sangue periférico com e sem TNF-α de indivíduos saudáveis. Os neutrófilos foram marcados usando o anticorpo anti-CD16 (verde); as plaquetas foram marcadas com anti-CD41b Brilliant Violet 421 (azul) e os glóbulos vermelhos foram marcados usando o anticorpo Glicoforina A Alexa Fluor® 647 (vermelho). As imagens foram obtidas 24 horas após a fixação das células aderentes usando um microscópio confocal (microscópio Zeiss Imager D2) 20x de ampliação.

Figura 7: Imagens 3D representativas de plaquetas aderentes, neutrófilos e glóbulos vermelhos aderidas a HMEC após 60 minutos de incubação com amostras de sangue periférico com e sem TNF-α: de indivíduos saudáveis. Os neutrófilos foram marcados usando o anticorpo anti-CD16 (verde). As plaquetas foram marcadas usando o anti-CD41b Brilliant Violet 421 (azul) e os glóbulos vermelhos foram marcados usando o Anticorpo Glicoforina A Alexa Fluor® 647 (vermelho). As imagens foram obtidas 24 horas após a fixação das células aderentes usando um microscópio confocal (microscópio Zeiss Imager D2), ampliação de 40x.

Conclusões Preliminares

Estes resultados preliminares indicam que as plaquetas influenciam significativamente na adesão de neutrófilos às camadas endoteliais. Com os dados (1,2) de modelos in vivo, podemos sugerir que as plaquetas podem ser precursoras dos processos vaso-oclusivos e inflamatórios, uma vez que a presença de plaquetas pode ser necessária para o recrutamento e adesão de outras células como neutrófilos.

Este estágio foi realizado a fim de adaptar e reproduzir a técnica aprendida no INSERM em nosso laboratório. Utilizando amostras de doadores saudáveis e pacientes do HEMOCENTRO-UNICAMP (n = 10 por grupo), a fim de confirmar esse achado em células de indivíduos com doença falciforme. Todos esses experimentos serão realizados em outro projeto com estreita colaboração e discussão com a equipe do INTS.

Referências:

1- Chweih H, Silva JAF, Gotardo EMF, Brito, PL, Barbosa GGO, Garcia F, Ferreira Jr. WA,

Leonardo FC, Franco-Penteado CF, Costa FF, Conran N. TNF-Induced Vaso-Occlusive and Inflammatory Processes in Mice with Sickle Cell Anemia Are Abrogated By the Platelet Activation Inhibitor, Prasugrel., San Diego, CA, Dec 1-4, 2018. Abstract.

2- Chweih C, Silva JAF, Ferreira Jr. WA, et al. Role for platelets in mediating neutrophil

recruitment in tnf-α induced vaso-occlusive processes in animals with sickle cell anemia. 59th Meeting of the American Society of Hematology. Blood. 2017; 130:540