Identificação da porcentagem de Ly6G Low e Ly6G High na população neutrófilos no sangue periférico e na medula óssea de camundongos CON e AF

A partir das camadas de mononucleares e granulócitos obtidas na separação por gradiente de densidade e do isolamento pela medula óssea, as células obtidas foram avaliadas por citometria de fluxo. Foram analisados 10.000 eventos por amostra. a proporção de LDN circulante em pacientes e controles foi avaliada por citometria de fluxo. A população de neutrófilos foi demarcada e apenas as células positivas para Ly6G foram consideradas.

Não foi observada diferença significativa entre os grupos após o uso de TNF, entretanto, devido a amostra ter sido obtida após o termino do experimento para confocal é provável que a quantidade de células analisadas seja menor do que se obtida diretamente do sangue coletado pelo coração. Por isso novos experimentos deverão ser realizados afim de confirmar e diferenciar esta população celular.

CON salina CON TNF AF salina AF TNF

0 2 4 6 8 Ly6G Low A d e s ã o d e l e u c ó c it o s ( 1 0 0  m -1)

CON salina CON TNF AF salina AF TNF

0 2 4 6 8 CD192 A d e s ã o d e l e u c ó c it o s ( 1 0 0 m -1)

CON Salina CON TNF 0 20 40 60 80 % L y 6 G h ig h M O

CON Salina CON TNF

0 20 40 60 80 % L y 6 G h ig h s a n g u e p e ri fé ri c o AF SALINA AF TNF 0 20 40 60 80 % L y 6 G h ig h M O AF SALINA AF TNF 0 20 40 60 80 % L y 6 G h ig h s a n g u e p e ri fé ri c o

Figura 35: Porcentagem de neutrófilos positivos para Ly6G na medula óssea (MO) e sangue periférico de camundongos CON ou AF. Amostras de sangue periférico ou da medula óssea foram coletadas após o termino do experimento de microscopia confocal e sacrifício dos animais que estavam ou não sob estimulo de TFN (0.5μg) As amostras foram obtidas em camundongos CON(n=2 por grupo) e AF (n=2 por grupo)

7- DISCUSSÃO

O processo vaso-oclusivo é uma das manifestações características da anemia falciforme. Estudos in vivo sugerem que o recrutamento de leucócitos à parede vascular é uma etapa essencial neste processo [21, 26, 127], mas o papel das plaquetas na iniciação e propagação deste mecanismo não está claro. Sabe-se que as interações entre as plaquetas e leucócitos são importantes para a imunidade inata e que a desregulação destas torna-se relevante para diversas doenças, como por exemplo aterosclerose, infarto agudo do miocárdio e AVC [139, 140].

Dados crescentes sugerem que as plaquetas possuem papel importante na fisiopatologia da AF, devido ao fato dos trombos plaquetários serem altamente eficientes no recrutamento de leucócitos circulantes [141-143]. Quando o endotélio encontra-se inflamado, as plaquetas desempenham um papel crítico fornecendo uma superfície adesiva para o recrutamento secundário de leucócitos [144, 145]; nós encontramos evidências deste fenômeno em animais CON e AF onde, após estimulo por TNF, observamos aglomerados plaquetários e grande numero de plaquetas aderidas nas paredes vasculares, em associação com os leucócitos que expressavam Ly6G, quando comparados aos animais que receberam salina, além de uma diminuição da sobrevida dos animais AF após o estímulo de TNF em comparação com os animais CON.

A diminuição no fluxo de plaquetas na microcirculação dos animais AF após administração de TNF foi indicativa da participação de processos vaso-oclusivos na diminuição da sobrevida dos animais AF. A quantificação da velocidade da passagem das plaquetas nas vênulas de animais CON e AF, corroborou com a avaliação do efeito do TNF-α e da ativação plaquetária nestes animais, uma vez que após estimulo por TNF-α e consequente a formação de aglomerados de plaquetas, a velocidade de fluxo dos animais CON foi reduzida em mais de 50% quando comparado aos que receberam somente salina. Por outro lado, os animais AF sem estímulo por TNF tem uma velocidade de fluxo 80% menor em relação aos CON uma vez que já possuem processo inflamatório instalado e ainda menor após estímulo por TNF.

Para nossa surpresa, constatamos uma grande parte das celulas recrutadas à região inflamada, não foram neutrófilos que expressavam Ly6G, porém sabemos que outras células também estão presentes na circulação de camundongos e participam de processos inflamatórios como, por exemplo, monócitos, linfócitos e eosinófilos [146- 148]. Constatamos também que os animais CON após estímulo inflamatório, apresentarem aumento no recrutamento de leucócitos Ly6G High e Low e, consequentemente, um aumento no número destas células aderidas/interagindo com as plaquetas. No entanto, em animais AF, houve um aumento somente no número de leucócitos Ly6G Low aderidos, e apesar de demonstrarmos o aumento no recrutamento de plaquetas após estímulo por TNF observamos diferença significativa na quantidade somente de Ly6G High aderidos e interagindo com plaquetas. Estes achados podem indicar que o mecanismo de adesão do neutrófilo à parede vascular pode ser importante para a adesão secundária da plaqueta ou vice-versa na AF após estímulo inflamatório.

Tentamos definir qual seria a população de Ly6G Low presente nos na microcirculação dos animais após estimulo com AF; tínhamos como hipótese de que esses leucócitos seriam monócitos, uma vez que estes estão presentes na circulação dos camundongos [148]. Porém verificamos por microscopia intravital confocal que essa população de Ly6G Low não era de monócitos; um artigo publicado por Hidalgo e colaboradores [46] mostrou que o neutrófilo possui fenótipos diferentes dependendo do tempo de maturação, devido a isso, sugerimos que a população Ly6G Low presente em número aumentado em camundongos CON e AF após estimulo por TNF, possa ser neutrófilos imaturos que foram mobilizados após o estimulo inflamatório [149].

A baixa ou alta expressão de Ly6G tem sido usado em alguns estudos que buscam marcar e diferenciar populações de neutrófilos [132, 150]; o estudo de Deniset et al. [149] verificou, no baço de camundongos, que a população de Ly6G High é correspondente a população de neutrófilos maduros e ativados e com alta capacidade de adesão. Por outro lado, os leucócitos Ly6G Low são correspondentes a população de neutrófilos imaturos e com maior mobilidade. Para confirmamos a maturidade das

neutrófilos observados em nosso estudo, talvez fosse necessário realizarmos marcação de CD11b juntamente com a marcação já realizada do Ly6G e posterior diferenciação por microscopia confocal e citometria da expressão de ambos os anticorpos [151].

Verificamos que o uso de anti-Ly6G em alta concentração foi capaz de abolir especificamente a presença dos leucócitos Ly6G High circulantes e aderidos ao vaso na microcirculação de animais CON e AF, não alterando a quantidade de Ly6G Low. Porém, tanto o anticorpo anti-Ly6G quanto o IgG2b não especifico diminuíram a adesão de plaquetas e aumentaram a velocidade do fluxo sanguíneo dos animais AF e CON. O uso do IgG tem sido utilizado para prevenir a vaso–oclusão em camundongos com anemia falciforme [152], e foi também utilizado em ensaios clínicos com o objetivo de estabilizar a ativação de neutrófilos em pacientes com doença falciforme em crise de dor [153].

Após depletarmos as plaquetas em camundongos que foram expostos ao estimulo inflamatório, verificamos uma redução no número de leucócitos (tanto de Ly6G High ou Low) aderidos ao endotélio, apesar de alguns autores mostrarem a importância da interação plaqueta-neutrófilo e seu papel na vaso oclusão [22, 52, 78, 154], sugerimos que a presença das plaquetas também é importante para a adesão dos leucócitos de Ly6G Low. No entanto, não é totalmente claro, quais são os receptores responsáveis pela adesão das plaquetas aos neutrófilos; em um trabalho realizado por Bennewitz e colaboradores [22] verificou-se que a inibição plaquetária através de P- selectina foi capaz de atenuar as consequências do processo vaso-oclusivo pulmonar em animais com anemia falciforme. Por outro lado, nós mostramos que o inibidor de CD42b desempenha um papel altamente significativo na inflamação vascular observado nos animais AF, uma vez que a depleção de plaquetas foi capaz de reduzir em aproximadamente 70% o número de leucócitos Ly6G High e Low aderidos em animais AF além abolir o efeito do TNF-α após 1 hora de estímulo em animais CON e AF. No entanto, devido ao efeito muito prejudicial do anticorpo anti-CD42b nos animais AF, é difícil tirar conclusões destes dados, pois a diminuição do recrutamento de leucócitos

observado pode ser resultado de outros mecanismos que participaram na morte destes animais.

As hemácias falcizadas são mais propensas à lise, e com isso liberam ADP, um agonista de plaquetas, e isso pode mediar a ativação local e a agregação plaquetária [155]. Adicionalmente, após administração de um estimulo inflamatório como TNF, ocorre uma ativação do endotélio [156]. Nós mostramos que o recrutamento de plaquetas à parede vascular e o recrutamento secundário de leucócitos Ly6G High e Low pode ser um gatilho para o início do processo vaso-oclusivo.

O prasugrel é um pró-fármaco oral da classe das tienopiridinas, que inibe o efeito purinérgico do receptor, P2Y12, causando a inibição da ativação e agregação plaquetária dependente de ADP [120]. Seu uso como terapia na AF tem sido discutido, uma vez que a ativação plaquetária é uma das caracteristicas da fisiopatologia da doença [157]. Ohno e colaboradores [158] mostraram que, em camundongos AF, o prasugrel foi capaz de inibir a ativação plaquetária por ADP e que estes camundongos possuem níveis elevados de ADP na circulação. Além disso, estudos clínicos para avaliar o uso do prasugrel em indivíduos com AF (fases 1, 2 e 3) têm sido realizados [85, 123, 124, 159], no entanto num ensaio clinico multinacional publicado em 2016 [124], não foi verificado um melhora significante na frequência de episódios de dor em pacientes após uso de prasugrel por 6 semanas. Neste estudo, usamos o prasugrel como uma ferramenta farmacológica para investigar o papel da ativação plaquetária especificamente no processo vaso-oclusivo.

Sendo assim nossos dados mostraram que o tratamento agudo (4h) com prasugrel foi capaz de inibir o processo inflamatório estimulado por TNF-α em camundongos CON e AF, além de aumentar a sobrevida dos animais AF. Portanto podemos considerar que a inibição da agregação e reatividade plaquetária pelo prasugrel [155, 157, 158] é capaz de diminuir a formação dos agregados plaquetas- leucócitos, contribuindo para a diminuição de eventos vaso-oclusivos em animais com AF [155]. No tratamento crônico (6 semanas) com o prasugrel obtivemos um resultado

semelhante ao tratamento agudo, uma inibição do processo inflamatório causado por TNF-α em animais CON e AF, além de uma melhora na sobrevida destes animais, reforçando mais uma vez a ideia de que as plaquetas possuem um papel essencial no processo vaso oclusivo, uma vez que inibindo a agregação plaquetária, não houve adesão celular e consequentemente vaso oclusão.

Além disso, quando utilizamos o prasugrel 1 hora após o estimulo inflamatório com TNF-α, verificamos que o mesmo foi capaz de reverter o processo inflamatório já instalado, além de diminuir a porcentagem de plaquetas aderidas a parede vascular. Este é um achado muito importante, pois há um grande número de drogas que conseguem impedir a iniciação do processo vaso-oclusivo [106, 160], no entanto há menos relatos de drogas que conseguem impedir o processo vaso-oclusivo uma vez instalado [99]; assim sendo o uso de prasugrel para o tratamento de pacientes hospitalizados para episódios de dor deve ser estudado. Hipotetizamos que nem todos os processos e crises vaso-oclusivas são causadas pelos mesmos mecanismos e por isso a dificuldade em encontrar uma única droga que possa ser útil para diminuir a frequência ou tratar as crises vaso-oclusivos. Com base em outros estudos [161] e agora nos nossos dados, onde foi visto a melhora significante nos processos vaso-oclusivos após uso de prasugrel, podemos sugerir que a ativação plaquetária tem um papel fundamental no processo vaso-oclusivo, quando induzido por estímulo inflamatório, e que o uso de prasugrel em pacientes AF deve ainda ser estudado tanto como terapia de uso contínuo com ou sem o uso de hidroxiureia quanto para uso após iniciação de crises dolorosas agudas nesta população de pacientes. A nossa hipótese referente o papel das plaquetas na iniciação do processo vaso-oclusivo e os efeitos do prasugrel neste processo são retratadas na (Figura 36).

A hidroxiureia é um medicamento quimioterápico oral, utilizada em pacientes com AF, a fim de diminuir e melhorar as crises de dor destes pacientes [111]. Em nosso trabalho com camundongos, vimos que a administração de hidroxiureia reduziu o recrutamento de Ly6G High e Low em ambos os grupos CON e AF. Interessantemente,

o fato de a hidroxiureia abolir a quantidade de Ly6G High agregados com plaquetas nos animais CON, e reduzir esses agregados em animais AF, indicou uma relação direta dessa população com a adesão plaquetária, porém a hidroxiureia foi capaz de diminuir a adesão de plaquetas apenas em animais AF. Nós supomos que esse efeito da hidroxiureia na redução da adesão plaquetária seja através da redução dos leucócitos Ly6G High, conforme demonstrado em trabalho anterior do grupo [99], além disso chamamos atenção mais uma vez para a estreita relação entre plaquetas e leucócitos para início da adesão na parede vascular e processo inflamatório.

O processo de hipóxia na AF é consequência do quadro inflamatório e da hipoxemia, característica da doença e que gera uma situação de baixa pressão parcial do oxigênio no sangue arterial [162]. A vaso-oclusão que ocorre na AF acentua o quadro hemolítico e resulta na isquemia e portanto hipóxia, além de causar danos ao endotélio vascular, o que adicionalmente contribui para a ocorrência de novos eventos de oclusão [162, 163]. Posteriormente, sabe-se que o retorno da reperfusão é altamente prejudicial, pois a restauração do fluxo sanguíneo e, consequentemente, a oxigenação pode acarretar em estresse oxidativo, adesão vascular e ativação da sistema de coagulação [163]. Além disso, o processo de isquemia pode levar a ativação das células endoteliais e consequentemente a geração de mediadores inflamatórios, contribuindo para a ocorrência da inflamação nesses indivíduos. Como a hipóxia/reperfusão (I/R) é um importante estimulo de processo vaso-oclusivo na AF, utilizamos a indução do processo I/R em camundongos, e verificamos que, em animais CON e AF, o processo de I/R é capaz de aumentar o recrutamento de leucócitos na microvasculatura destes animais quando comparado ao basal ou uso de TNF-α. Além disso, verificamos através da microscopia confocal que o processo de hipóxia não foi capaz de aumentar a quantidade de Ly6G High aderidos quando comparado com o TNF-α, entretanto o número de Ly6G Low aderidos é maior.

Uma comparação interessante entre os estímulos foi o fato da I/R não aumentar a adesão/interação de plaquetas com Ly6G High ou Low na parede vascular, além de

também não aumentar a porcentagem de plaquetas aderidas, fato esse muito presente no grupo TNF. Sendo assim, podemos afirmar que o papel das plaquetas não é o mesmo nos dois estímulos e, portanto, drogas que inibem a ativação plaquetária possam não ter sido eficazes em alguns pacientes, devido ao estimulo inflamatório ocorrido.

Com nosso trabalho, podemos concluir que a diminuição da presença e atividade plaquetária, indicam que as plaquetas possam ter um papel iniciante no processo vaso- oclusivo quando desencadeado por TNF. É provável que o recrutamento das plaquetas à parede vascular, por sua vez, leva a formação de agregados neutrófilos-plaquetas no endotélio e que a ativação do endotélio também resulta no recrutamento de leucócitos Ly6G Low. Podemos sugerir que o bloqueio da passagem das hemácias no vaso por conta destes aglomerados, por fim, acarreta na diminuição do fluxo sanguíneo. O uso do prasugrel, assim como outras drogas, vem sendo muito abordado e discutido como terapias com potencial para uso em combinação a hidroxiuréia no tratamento de pacientes com anemia falciforme. Nossos dados trouxeram uma nova perspectiva em relação ao uso do prasugrel, enfatizando seus efeitos benéficos e apoiando uma melhor explanação cientifica para essa droga.

Figura 36: Papel das plaquetas na iniciação do processo vaso-oclusivo e o efeito do prasugrel neste mecanismo na anemia falciforme: (1) Na anemia falciforme as plaquetas, neutrófilos e leucócitos Ly6G Low circulam num estado ativado; (2) na presença de um estimulo inflamatório, como TNF, ocorre o recrutamento rápido e extensivo das plaquetas ao endotélio, que contribui para a ativação do endotélio. As plaquetas aderidas recrutam neutrófilos e ocorre a adesão dos leucócitos Ly6G Low ao endotélio além da formação de agregados de plaquetas- Ly6G High e plaquetas- Ly6G Low na parede vascular. Como consequência, a passagem das hemácias pelo vaso é dificultada e a velocidade do fluxo sanguíneo diminui; (3) a inibição da ativação das plaquetas tem um efeito significante no vaso sanguíneo, mesmo após o estimulo inflamatório; o recrutamento de plaquetas ao endotélio é abolido que por sua vez diminui o recrutamento de Ly6G High e Low (indicando um papel das plaquetas em ativar o endotélio vascular. Adicionalmente há a diminuição do recrutamento de agregados plaquetas- Ly6G High e plaquetas- Ly6G Low, e, portanto, o aumento da velocidade do fluxo sanguíneo. Nossos dados sugerem um papel fundamental das plaquetas na iniciação do processo vaso-oclusivo quando desencadeado por um estímulo inflamatório.

8. CONCLUSÕES

✓ Processos inflamatórios induzidos em camundongos com anemia falciforme

desencadeiam um recrutamento exacerbado de plaquetas na microcirculação, em associação com o recrutamento de leucócitos à parede vascular;

✓ Este recrutamento é associado a uma diminuição de fluxo sanguíneo na

microvasculatura, além de diminuição da sobrevida dos animais, indicativo da ocorrência de vaso-oclusão;

✓ A depleção ou diminuição da atividade das plaquetas é capaz de inibir e até

reverter o processo inflamatório instalado, além de aumentar a velocidade de fluxo sanguíneo nos animais com anemia falciforme;

✓ O uso da hidroxiureia diminui a adesão dos leucócitos Ly6G High em associação

com uma diminuição da adesão plaquetária à parede vascular;

✓ O uso de I/R é capaz de promover o processo inflamatório, porém não com a

mesma participação plaquetária que o TNF.

✓ Nosso trabalho conclui que a plaqueta possuiu um papel importante no processo

vaso-oclusiva que caracteriza a anemia falciforme. Agentes antiplaquetárias devem

ser ainda estudadas como forma de terapia em combinação, ou não, com a hidroxiureia para diminuir a frequência das crises vaso-oclusivas ou até para uso em pacientes hospitalizados por este motivo.

9- REFERÊNCIAS

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