Esse capítulo será submetido para publicação na revista Food and Chemical Toxicology, após sua versão para a língua inglesa.
120
Resumo
O objetivo desse estudo foi caracterizar as amostras da própolis (estação seca e chuvosa) e geoprópolis (estação seca e chuvosa) produzidas no município de Entre Rios, em uma área de Mata Atlântica, no estado da Bahia, Brasil. Através da análise palinológica foram identificados dois tipos polínicos (Schinus terebinthifolius e Cecropia) referente as duas principais espécies fornecedores da resina para as abelhas nessa região. Microbiologicamente, as amostras apresentaram problemas de qualidade sanitária, devido à presença de esporos de clostrídios sulfito redutores, havendo a necessidade de estabelecimento de uma coleta mais segura. Os dados físico-químicos (umidade, substância insolúveis, pH, condutividade, teor de cinzas, cera, teor de fenóis totais e teor de flavonoides) se enquadraram na legislação brasileira em vigor. Em relação ao teor de fenóis totais, o produto das Melipona scutellaris apresenta valores superiores ao da Apis mellifera, 25,13±0,14% (geoprópolis estação seca) e 19,30±0,15% (geoprópolis estação chuvosa), e 7,82±0,09% (própolis estação chuvosa e seca), respectivamente. Além disso, as amostras de geoprópolis também possuem maior atividade antioxidante, determinada pelos métodos do DPPH (IC50=0,064±0,004 e 0,058±0,005 mg/ml), do poder redutor (IC50= 0,389±0,008 e
0,220±0,001 mg/ml) e β- caroteno (89,520±0,570 e 75,540±1,100%). Por outro lado, as amostras de própolis revelaram atividade anti-inflamatória (69,110±2,400 e 55,550±1,710 mg/ml) e antimutagênica superior ao ser comparada à geoprópolis. Ambos produtos apresentaram excelente atividade antimicrobiana em relação à Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis e Candida albicans. A análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (HPLC/UV) e com detecção por espectrometria de massa (HPLC/MS) permitiu identificar vários compostos fenólicos, destacando-se: cianidina, ácido caféico, naringina, genisteína e quercetina-7-metil éter (quercetina-3-metil éter). O coeficiente de Pearson demonstrou uma correlação positiva entre os microrganismos analisados e as atividades antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória, inibição da acetilcolinesterase e a quantificação de teor de fenóis totais. Os dados aqui obtidos comprovaram a qualidade dos produtos da área em estudo.
Palavras-chaves: Atividade antimicrobiana, atividade anti-inflamatória, atividade antioxidante, compostos fenólicos, fenóis totais, flavonoides totais, qualidade sanitária.
Abstract
The objective of this study was to characterize samples of propolis and geopropolis produced during the dry and rainy seasons in an area of Atlantic Forest, in the municipality of Entre Rios, Bahia State, Brazil. A pollen analysis identified two principal types of pollen (Schinus terebinthifolius and Cecropia) in the bee resin from this region. Microbiologically, the samples had an unsanitary quality due to sulphite-reducing clostridia spores, which suggests there is a need to establish safer collecting procedures. The physicochemical data (moisture, insoluble substances, pH, conductivity, ash content, wax, total phenolic compounds and flavonoid content) were acceptable based on Brazilian legislation. Total phenol content was higher in the Melipona scutellaris product compared to the Apis mellifera product, 25.13±0.14% (geopropolis, dry season) and 19.30±0.15% (geopropolis, rainy season), and 7.82±0,09% (propolis, dry and rainy seasons), respectively. The samples of geopropolis also had higher antioxidant activity, which was determined by DPPH (IC50=0.064±0.004 and
0.058±0.005 mg/ml), reducing power (IC50= 0.389±0.008 and 0.220±0.001 mg/ml) and β-
carotene (89.520±0.570 and 75.540±1.100%). On the other hand, the propolis samples showed anti-inflammatory (69.110±2.400 and 55.550±1.710 mg/ml) and antimutagenic activities that were higher than the geopropolis. Both products had excellent antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis and Candida albicans. A high- performance liquid chromatography analysis with ultraviolet (HPLC/UV) and mass spectrometry detection (HPLC/MS) identified various phenolic compounds, including: cyanidin, caffeic acid, naringin, genistin, and quercetin-7-methyl ether (quercetin-3-methyl ether). Pearson's coefficient demonstrated a positive correlation between the microorganisms analyzed and the antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory activities, inhibition of acetylcholinesterase and quantification of total phenolic content. The data obtained here are important evidence of the quality of the products from the study area.
Keywords: Antimicrobial activity, anti-inflammatory activity, antioxidant activity, phenolic compounds, total phenols, total flavonoids, sanitary quality.
122
Introdução
A própolis é uma substância resinosa produzida, pelas abelhas da espécie Apis mellifera L., de diversas partes da planta, como brotos, botões florais e exsudatos resinosos que são misturados com a saliva que adiciona uma enzima denominada β-glicosidase, originando um material de coloração e consistência variada. Este material é usado para fechar pequenas frestas, embalsamar insetos mortos no interior da colmeia e proteger contra agentes externos como vento, temperatura e chuva (Ghisalberti, 1979; Silva et al., 2012; Matos et al., 2014). As abelhas sem ferrão, como Melipona scutellaris L. (Uruçu), também produzem uma substância semelhante a própolis. Esta substância é considerada um tipo diferente de própolis por apresentar uma mistura de resinas exsudados, originária de diversas fontes vegetais, misturadas com cera e partículas de terra e/ou barro o que lhe confere características únicas (Cunha et al., 2013). Este produto tem cor que vai do verde ao marrom escuro, aroma característico e propriedades adesivas (Souza et al., 2013). É usando para vedar, proteger e manter a temperatura interna da colmeia.
A composição química da própolis é bastante complexa e diversificada, e está diretamente relacionada com a biodiversidade da região visitada pelas abelhas (Freitas et al., 2010; Dias et al., 2012; Silva et al., 2012). De fato, a própolis possui mais de 300 compostos identificados, dentre os quais se destacam: resina (50-60%), cera (30-40%), óleos essenciais (5-10%), grãos de pólen (5%), microelementos (alumínio, cálcio, estrôncio, ferro, cobre, manganês) e vitaminas (B1, B2, B6, C e E) (Ghisalberti, 1979; Silva et al., 2012; Matos et al., 2014). Dentre os compostos presentes também podemos citar: flavonoides, ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas, terpenoides e fenilpropanoides, esteroides, aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e outras substâncias em quantidades vestigiais. De todos esses grupos de compostos, os mais importantes são os flavonoides por estarem diretamente relacionados com atividade biológica da própolis (Lustosa et al., 2008; Dias et al., 2012).
Dentre as propriedades biológicas referentes à própolis, salientam-se: antimicrobiana, anti-fúngica, antioxidante, anti-inflamatória, anti-viral imunomodulatória, cicatrizante, anestésica e anticariogênica. Além disso, estudos recentes mostraram que a própolis é capaz de inibir a ação da enzima hialuronidase, o que permite retardar o envelhecimento das células. Devido a estas propriedades, a própolis tem despertado o interesse das indústrias alimentícia e farmacêutica, principalmente em países asiáticos, fazendo parte da composição de diferentes
produtos para consumo humano como bebidas, alimentos e cosméticos (Ghisalberti, 1979; Teixeira et al., 2003; Park et al., 2005; Moreira et al., 2008; Matos et al., 2014).
A geoprópolis é um produto da colmeia pouco descrito na literatura e com estudos escassos acerca da sua composição química e atividades biológicas (Cunha et al., 2013). Bankova et al. (1998) em amostras de geoprópolis brasileiras identificaram, por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM), mais de 50 compostos químicos sugerindo que a sua composição pode ter influência geográfica e da espécie de abelha. Os principais compostos identificados por estes investigadores foram ácidos graxos, diterpenos e triterpenos. Além disso, os teores de flavonoides e ácidos fenólicos variam bastante entre amostra. Alguns autores (Velikova et al, 2000; Souza et al., 2013; Campos et al, 2014; Dutra et al., 2014) demonstraram que a geoprópolis apresentava uma intensa atividade antimicrobiana e citotóxica.
No Brasil, há grande variedade de tipos de própolis e geoprópolis devido à diversidade da flora brasileira e ao enorme número de espécies de abelhas sem-ferrão tornando-se necessário expandir o conhecimento científico acerca da origem botânica/ geográfica e das propriedades destes produtos (Matos et al., 2014; Cardozo et al., 2015). A caracterização e padronização destes produtos apícolas naturais é condição necessária para a sua aceitação oficial e utilização no sistema de saúde (Moreira et al., 2011).
No Brasil, em geral, e na Bahia em particular existe pouca informação sobre as plantas de importância para a produção da própolis/geoprópolis, sobre a composição química e propriedades biológicas desses produtos (Matos et al., 2014). Sendo assim, este trabalho teve como objetivo estudar a composição química de amostras da própolis/geoprópolis produzidas numa região de Mata Atlântica no estado da Bahia, com o intuito de avaliar a sua segurança e a qualidade. Foram também quantificados os compostos bioativos e avaliadas as propriedades biológicas destes produtos.
124
Materiais e métodos
Área de estudo
As amostras em estudo foram coletadas em Entre Rios (11°56'31"S e 38°05'04"O), num município da Bahia pertencente à região de Mata Atlântica,localizado na BR-110 entre Salvador (BA) e Alagoinhas (BA) (IBGE, 2002) (Figura 1). A escolha da área foi definida de acordo com os critérios de disponibilidade e acessibilidade das colônias de Melipona scutellaris L. e de Apis mellifera L.
Amostras de própolis/geoprópolis
Para a realização deste trabalho, foram selecionadas duas colónias de abelhas Melipona scutellaris para produção de geoprópolis e duas colónias de Apis mellifera, para produção da própolis. As amostras foram obtidas mensalmente durante o período de um ano (abril 2014 a março de 2015). Estas foram acondicionadas em recipientes hermeticamente fechados e etiquetados. Posteriormente, as mesmas foram encaminhadas para armazenamento em freezer no Laboratório de Micromorfologia Vegetal (LAMIV). Para facilitar o estudo e porque em algumas coletas, particularmente nas amostras de geoprópolis, a quantidade de amostra era reduzida foram feitas duas amostras compostas para cada produto, uma correspondente à estação chuvosa e outra à seca. Isto porque segundo o IBGE (2002), a estação chuvosa compreenderia os meses entre abril e setembro, e a estação seca, entre os meses de outubro e março.
Reagentes
Metanol (CH3OH) e etanol (CH3CH2OH) obtidos do Pronolab (Lisboa, Portugal). Os meios de cultura da Himedia (India). Solução TTC (2,3,4-trifenil-2H-tetrazólio cloreto) da Fluka (Buchs, Switzerland). Água ultra pura (18MΩcm) da Mili- Q purification system (Millipore, Bedford, MA, USA). Folin-Ciocalteau, clorofórmio (CHCl3), carbonato de sódio (Na2CO3), quercetina, gentamicina, anfoterecina, ácido gálico e demais reagentes obtidos da
Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA).
O metanol utilizado nas análises de HPLC foi o HiPerSolv CHROMANORM, com pureza de 99,8% (VWR BDH Prolabo, Lutterworth, UK), e o ácido fórmico foi procedente da Merck (Darmstadt, Germany). Já os padrões para a análise de HPLC (ácido gálico (GA, ≥99%), ácido protocatecuico (99,63%), (+)-catequina (≥98%), (−)-epicatequina (≥97%), ácido
vanílico (≥97%), ≥-ácido resorcílico (≥97%), ácido clorogênico (>95%), ácido caféico(≥98%), ácido siríngico (≥98%), ácido p-cumárico (≥98%), ácido ferúlico (≥99%), ácido sinápico (≥99%), rutina hidratada (≥94%), quercetina (95%) kaempferol (≥98%), naringina (≥95%), naringenina (98%) e ácido cinâmico (≥99%)) foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany).
Análise palinológica
Essa análise foi realizada no Laboratório de Micromorfologia Vegetal (LAMIV), na Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), em Feira de Santana, Bahia, Brasil. As amostras foram processadas de acordo com a metodologia descrita por Matos et al. (2014). Os grãos de pólen foram identificados taxonomicamente com o auxílio das lâminas depositadas na palinoteca do Laboratório de Micromorfologia Vegetal (UEFS), na qual também foram depositadas todas as lâminas preparadas. Para auxiliar na identificação da origem botânica dos tipos polínicos utilizaram-se ainda catálogos e outros trabalhos.
Determinações microbiológicas
As análises microbiológicas foram efetuadas de acordo com o recomendado por Dias et al. (2012). Para as determinações microbianas, 25 g de amostra foram diluídas em 225 mL de água estéril peptonada tamponada (BPW, VWR Chemicals Prolabo, Portugal) e homogeneizados durante 2 minutos (Stomacher 400, Seward, UK). Foram avaliados os seguintes parâmetros: contagem total de aeróbios mesofilos, contagem de bolores e leveduras, quantificação de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de esporos de clostrídios sulfito redutores e pesquisa de Salmonella sp. Todas as análises foram realizadas de acordo com as Normas Europeias, ISO e Kits Simplate, desenvolvidos pela empresa Bio Control (métodos oficiais AOAC).
Análise físico-químicas
Foram avaliados umidade, pH, condutividade, teor de cinza, substâncias insolúveis e cera, de acordo com Dias et al. (2012). Todas as análises foram efetuadas em triplicatas.
Preparação dos extratos metanólicos
As amostras de própolis e geoprópolis forem pesadas e diluídas em metanol na proporção de 1:5 e colocadas em agitação por 24 horas. Após esse período foram filtradas (Whatman nº 4 papel de filtro). Os extratos metanólicos foram posteriormente colocados sob
126
refrigeração e, após 12 horas, efetuou-se nova filtração para remover a cera. Posteriormente, o solvente foi evaporado num evaporador rotativo (Rotavapor Buchi RE 111 com um Buchi 461 banho-maria, 2002). O resíduo foi colocado na estufa e pesado até peso constante (Silva et al., 2012).
Quantificação do teor de fenóis totais e flavonoides a) Preparação da solução
A solução mãe foi preparada diluindo-se 0,2 gramas do extrato da própolis/geoprópolis em balões volumétricos de 25 mL. Dessa solução retirou-se 1 ml para outro balão de 25 mL e aferiu-se com água deionizada (Silva et al., 2012).
b) Quantificação do teor de fenólicos totais
Os compostos fenóis totais foram determinados de acordo com o método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, descrito por Dias et al. (2012), utilizando ácido gálico como padrão. E os resultados foram expressos em equivalentes de ácido gálico (mg/g).
c) Quantificação de flavonoides
A avaliação dos flavonoides totais foi efetuada conforme descrito por Castro et al. (2007). O conteúdo em flavonoides expressou-se em equivalentes de quercetina (mg/g).
Atividade antioxidante
Devido à diversidade química de compostos antioxidantes presentes nos produtos naturais, torna-se muito difícil separar cada um deles e estudá-lo individualmente. Adicionalmente, compostos antioxidantes individuais não refletem necessariamente a capacidade antioxidante total, já que podem existir interações sinérgicas ou antagônicas entre os diferentes compostos presentes. Os métodos mais usuais para determinar a capacidade antioxidante in vitro podem ser genericamente divididos em duas categorias: ensaios baseados na reação de transferência de átomos de hidrogénio (HAT) e ensaios baseados na reação de transferência de elétrons (ET). No nosso trabalho utilizamos três métodos para avaliar a capacidade antioxidante dos extratos de própolis/geoprópolis, dois baseados em ET (ensaio da atividade captadora de radicais DPPH e Poder redutor) e um baseado em HAT (ensaio da inibição da descoloração do β-caroteno) (Morais et al., 2011; Silva et al., 2012).
a) Eliminação de radicais DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazila)
Nos ensaios da atividade captadora de radicais DPPH, seguiu-se a metodologia descrita por Moreira et al. (2008). A atividade captadora de radicais (ACR) foi calculada pela percentagem de descoloração da solução de DPPH, usando a equação:
% ACR = [(ADPPH - AS)/ADPPH] x 100
Na qual: AS corresponde à absorbância da solução de DPPH na presença de diferentes
concentrações de extrato, e ADPPH é a absorbância do branco (solução de DPPH mais o
solvente de extração (metanol) em vez da solução de extrato).
b) Poder redutor
Esta metodologia baseou-se no protocolo descrito por Moreira et al. (2008). A concentração de extrato que induziu uma inibição de 50% (EC50) foi calculada a partir do
gráfico da absorbância em função da concentração de extrato na solução.
c) Sistema β-caroteno/ácido linoléico
Este ensaio foi realizado seguindo o método descrito por Ahn et al. (2004) com algumas modificações. Foram pesados 5 mg do composto β-caroteno e diluído em 25 mL de clorofórmio. Transferiram-se 4 mL dessa solução para um balão piriforme e acrescentou-se 80 µL do ácido linoleico e 800 µL de Twen 20. Em seguida, removeu-se o clorofórmio a 40°C, sob vácuo (Rotavapor Buchi RE 111 com um Buchi 461 banho-maria, 2002). Posteriormente, adicionou-se 200 mL de H2O desionizada saturada com oxigênio (30min). Transferiram-se
alíquotas (4,8 mL) desta emulsão para tubos de ensaio contendo diferentes concentrações dos extratos (0,2 mL), agitou-se e determinou-se o tempo zero de absorbância a 470 nm (espectrofotômetro Geney).
Após esse tempo os tubos foram colocados em banho-maria a 55ºC por 120 minutos e determinou-se novamente a absorbância a 470 nm. Foi preparado um branco com o solvente de extração (metanol) em vez da solução de extrato. A inibição da descoloração do β-caroteno foi calculada utilizando-se a seguinte equação:
% Descoloração = [(A470 após 2h/A470 inicial) × 100]
Atividade anti-inflamatória
A atividade anti-inflamatória foi avaliada através da inibição da enzima hialuronidase, pelo método descrito por Sahasrabudhe & Deodhar (2010). Dissolveu-se em tampão de acetato (pH 3,6) 150 µL da enzima hialuronidase bovina (7900 unidades /mL).
128
Posteriormente, adicionou-se 25 mL de extratos de própolis e geoprópolis e incubou-se a mistura durante 30 min a 37ºC. Em seguida, adicionou-se 50 µL de cloreto de cálcio (12,5 mM) e incubou-se novamente nas mesmas condições. Após este período, adicionou-se 250 µL de hialuronato de sódio (1,2 mg/mL) e voltou a incubar-se a 37ºC durante 1h30 min. Após este período, adicionou 50 mL de hidróxido de sódio 0,4 M e 100 mL de borato de sódio 0,6 M, colocou-se em banho-maria por 3 minutos. Finalmente, arrefeceu-se em gelo e adicionou- se 1,5 mL de PDMAB (p-dimetilaminobenzaldeído) solução (4 g PDMAB dissolvido em 50 mL de 10M de HCl e 350 mL de ácido acético glacial). A absorbância foi medida a 585 nm. O ensaio foi feito em triplicado. A epigalocatequina foi utilizada como controle.
Atividade antimicrobiana
O material biológico utilizado neste trabalho foram estirpes de Staphylococcus aureus ATCC 43300 (bactéria gram-positiva), Proteus mirabilis ATCC 10231 (bactéria gram- negativa) e Candida albicans (levedura) ATCC 25933 da coleção (LGC Standards SLU, Barcelona) ATCC (American Type Culture Colection). Foram também utilizados isolados clínicos de pacientes hospitalizados que recorreram ao Centro Hospitalar do Nordeste (Portugal), S. aureus ESA 321 foi isolada de ferimentos exsudato, P. mirabilis ESA 229 foi isolada a partir de uma algalia (sonda de Foley) e C. albicans ESA 115 foi isolada de expectoração. Estes microrganismos foram identificados por técnicas de Biologia Molecular.
Caldo de Mueller Hinton (MHB) (Sigma) e Ágar dextrose Sabouraud (SDA) (Sigma) foram utilizados para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI, a mais baixa concentração do extrato da própolis/geoprópolis capaz de inibir o crescimento bacteriano), e concentração mínima bactericida (CMB, a menor concentração do extrato de própolis/geoprópolis à qual o crescimento bacteriano foi impedido, e a viabilidade inicial foi reduzida em, pelo menos, 99,9%). A determinação das CMI foi realizada por TTC (cloreto de trifenil tetrazólio), seguindo a metodologia do método colorimétrico sugerida por Morais et al. (2011), com algumas modificações.
As amostras de própolis e geoprópolis foram dissolvidas em meio Mueller-Hinton para bactérias e Ágar dextrose Sabouraud (SDA) para leveduras (concentração final 20mg/ml). Posteriormente colocaram-se 100 µL de diferentes concentrações em cada poço (/96 microplacas). Posteriormente a cada poço foram adicionados 100 µL de inóculo, 1x105 para as bactérias e 1x103 para a levedura. Dois negativo, (um com MHB ou SDA e outro com a própolis/geoprópolis extratos) e uma positiva (com controles MHB ou SDA e o inóculo)
foram realizadas. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 e 48 horas para bactérias e leveduras, respetivamente.
As CMI das amostras foram detectadas após a adição de TTC (20 µL) e incubação a 37°C durante 30 minutes ou 3 horas, para bactérias e leveduras, respectivamente. A viabilidade dos microrganismos reduziu das cores amarela para rosa. CMI foi definida como a concentração mais baixa que impedia o extrato sofrer essa mudança e exibiram uma inibição completa de crescimento bacteriano. Para a determinação da CMB, uma porção de líquido (20 µL) de cada poço sem alterações de cor, bem como o último poço onde se observou crescimento foram inoculados em placas (meio Mueller-Hinton para bactérias ou Ágar dextrose Sabouraud para leveduras) e incubou-se a 37°C durante 24 ou 48 h. A concentração mais baixa que não resultou em crescimento após esta subcultura foi considerada a CMB. Todos os ensaios foram realizados em duplicado.
Atividade antimutagênica
A determinação da atividade antimutagênica foi efetuada com base no descrito por Pascoal et al. (2014), utilizando-se células de levedura D7 estirpe diploide de Saccharomyces cerevisiae ATCC 20113.
Inibição da acetilcolinesterase
A enzima acetilcolinesterase degrada a acetilcolina em ácido acético e tiocolina, a qual interage com o ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB). A acumulação de 5-tio-2- nitrobenzóico foi medida a 405 nm. A metodologia aplicada foi a desenvolvida por Mata et al. (2007).
Identificação de compostos fenólicos
A caracterização do perfil fenólico dos extratos foi obtida por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção UV (HPLC/UV) e com detecção por espectrometria de massa (HPLC/MS).
A identificação e quantificação dos fenólicos por HPLC-UV foi realizada com base no procedimento descrito por Rubilar et al. (2007), com algumas modificações. O cromatógrafo utilizado foi um Shimadzu (Software LabSolutions) com forno para coluna (CTO-10AS vp), sistema de injeção (LC-20AD), auto sampler (SIL-20A ht) e detector de arranjo de fotodiodo (SPD-M20A), equipado com coluna de fase reversa Phenomenex Gemini C18 (250 x 4,6 mm;
5 μm). Os extratos foram filtrados com filtro de nylon 0,22 µm (Millipore) e o volume de 20 µl foi injetado. A fase móvel era composta por água (solvente A) e metanol (solvente B),
130
ambos acidificados com 0,1% de ácido fórmico, com um fluxo de 1,0 ml/min em modo gradiente, do seguinte modo: 0 min, 15% de B em A; 20 min, 30% de B em A; 40 min, 45% de B em A; 45 min, 50% de B em A; 50 min, 55% de B em A; 65 min, 70% de B em A; 75 min, 100% de B; manteve-se 100% de B em A (75-80 min); a composição da fase móvel regressou às condições iniciais nos dez minutos seguintes e foram mantidas durante mais 10 minutos para estabilização antes da injeção seguinte. Os eluentes foram filtrados com um filtro de nylon (porosidade 0,20 µm, Supelco, Bellefonte, PA, USA) e desgaseificados. Durante as análises, a temperatura da coluna foi mantida a 25ºC. A deteção dos compostos fenólicos foi efetuada por varrimento entre os 190 e 600 nm e a quantificação foi realizada a 280 nm para os flavan-3-óis monoméricos (catequina e epicatequina), para os ácidos hidroxibenzóicos (gálico, vanílico, protocatéquico, siríngico e β-resorcílico), naringina, naringenina e ácido cinâmico, a 320 nm para os ácidos hidroxicinâmicos (cafeico, clorogênico, p-cumárico, ferúlico e sinápico), e a 360 nm para a rutina, a quercetina e o kaempferol. Os analitos em cada extrato foram identificados por comparação dos seus tempos de retenção e espectros UV-Vis com os dos padrões. A pureza de cada pico foi verificada de forma a excluir qualquer contribuição de picos interferentes. A concentração de cada composto fenólico identificado nos extratos foi obtida pela curva de calibração que foi construída utilizando uma mistura dos padrões acima mencionados numa gama de