4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.2. Estimativa da Concentração Letal 50 (CL 50 )
A toxicidade relativa da proteína Cry1Ac de B. thuringiensis apresentou ação diferente para as populações de P. xylostella utilizadas, sendo mais efetiva para as populações PA, PC, PX e SBT, o que é demonstrado pelos menores valores encontrados para CL50 (0,02; 0,04; 0,01 e 0,04 µg/mL, respectivamente)
(Tabela 4). A toxicidade para a população Bt foi significativamente diferente das demais, fato este indicado pela não sobreposição do limite de confiança a 95% dos parâmetros estimados. O valor estimado de CL50 para a população Bt foi 78
vezes maior do que a CL50 estimada para a população PX (Tabela 4).
Biologicamente, a razão de resistência tem que ser maior que 10 vezes em relação à população suscetível para que uma determinada população passe a manifestar a resistência, o que ocorreu com todas as populações brasileiras testadas. Outro ponto importante a ser destacado é que a mortalidade da testemunha foi inferior a 5% até o quinto dia de avaliação.
Quanto à resistência de insetos, a toxinas Bt tem sido observada, principalmente em laboratório, com várias espécies de insetos, como por exemplo: Plodia interpunctella (Hübner, 1813) (Lepidoptera: Pyralidae), H. virescens, Spodoptera littoralis Boisduval, 1833 (Lepidoptera: Noctuidae), Ostrinia nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera: Crambidae) e Culex quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera: Culicidae). Até recentemente, apenas com P. xylostella se tinha demonstrado resistência em campo, sendo os insetos resistentes coletados em vários estados americanos (por exemplo, Havaí, Flórida e Pensilvânia), na Indonésia, na Malásia, na América Central e nas Filipinas (SCHNEPF et al., 1998). O desenvolvimento da resistência parece envolver vários mecanismos e ser dependente do tipo de inseto, da toxina, e da estirpe do Bt. Redução na solubilização da pró-toxina, alteração no processamento proteolítico, a eliminação da toxina ativa pela precipitação e/ou degradação, a redução da ligação da toxina aos receptores da membrana do intestino dos insetos e mutações no gene ABBC2 têm sido relatados como mecanismos de resistência. As combinações destes mecanismos podem estar envolvidas na aquisição de resistência, no entanto, é possível que outros mecanismos possam ainda estar envolvidos.
4.1.3. Efeitos subletais
Das sete concentrações de proteina Cry1Ac testadas em lagartas da população Bt de P. xylostella, para estimativa da CL50, foram utilizadas 0,5; 0,25 e
Tabela 4. Respostas de concentração-mortalidade de lagartas de terceiro
ínstar de diferentes populações de Plutella xylostella em relação à proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Populações CL50 (95% I.C.) (µg/mL) angular ± EP Coeficiente 2 GLa P RRb Bt 0,78 (0,55-1,08) 1,38 ± 0.18 10,73 5 0,0571 PA 0,02 (0,014-0,025) 1,81 ± 0.10 9,23 5 0,1003 39 PC 0,04 (0,018-0,075) 1,32 ± 0.19 18,07 5 0,0029 19.5 PX 0,01 (0,004-0,025) 0,94 ± 0.13 6,58 3 0,0867 78 SBT 0,04 (0,022-0,068) 1,77 ± 0.22 18,32 5 0,0026 19.5 aGrau de liberdade; bRR (razão de resistência) = CL
50 população teste /CL50 população resistente.
0,1 µg/mL nos estudos sobre os efeitos subletais subsequentes, uma vez que elas proporcionaram sobrevivência de indivíduos suficiente para as avaliações (Tabela 5). O tempo de desenvolvimento para o completer a fase larval (3o ínstar a pupa)
foi significativamente menor para o tratamento controle (4,7 dias), sendo aproximadamente dois dias mais curto que aqueles observados com as doses da proteína, que variou de 6,4 a 6,9 dias (F3,16=19,4; P<0,0001). O periodo pupal foi
semelhante para todos os tratamentos, estando entre 4,0 a 4,5 dias (F3,16=1,89;
P=0,172). O peso das pupas foi um parâmetro que também se mostrou semelhante entre as doses, apresentando variação de 4,6 a 4,9 dias (F3,16=1,13;
P=0,367), o mesmo ocorrendo para a razão sexual. A porcentagem de emergência de fêmeas foi afetada pela proteína, variando de 39 a 58% (F3,16=2,21; P=0,127), enquanto que para o controle ocorreu apenas 10% de
mortalidade. Por outro lado, a sobrevivência até a fase de pupa foi afetada significativamente apenas com as lagartas expostas a 0,5 µg/mL, apresentando sobrevivência de 54%, valor menor em relação ao grupo controle (90%) (F3,16=4,53; P=0,0175). O consumo foliar de lagartas de P. xylostella expostas à
proteína Cry1Ac também foi significativamente menor do que o grupo controle (F3,16=11,50; P<0,0003), sendo 2,80 cm2 no controle e de 1,26 a 1,83 cm2 com as
proteínas, destacando-se a dose de 0,5 com o menor valor de area foliar ingerida. A exposição das lagartas da população Bt à proteína Cry1Ac não afetou as características biológicas da fase adulta de P. xylostella, sendo a longevidade de machos (F3,16=0,33; P=0,801), longevidade de fêmeas (F3,16=0,99; P=0,42) e
número de ovos por fêmea (F3,16=1,53; P=0,246) semelhantes entre os
Tabela 5. Características biológicas de indivíduos da população Bt de Plutella
xylostella após a exposição de lagartas a diferentes concentrações da proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Concentrações (µg/mL)
0,0 (controle) 0,5 0,25 0,1
Período 3o ínstar –
pupa (dias) 4,7 ± 0,67 b
1 6,9 ± 0,22 a 6,5 ± 0,50 a 6,5 ± 0,50 a
Período pupal (dias) 4,0 ± 0,32 a 4,5 ± 0,50 a 4,1 ± 0,22 a 4,4 ± 0,55 a
Peso pupa (mg) 4,9 ± 0,39 a 4,6 ± 0,29 a 4,9 ± 0,11 a 4,7 ± 0,26 a Razão sexual 0,48 ± 0,11 a 0,43 ± 0,07 a 0,56 ± 0,21 a 0,35 ± 0,07 a Sobrevivência 3o ínstar - pupa (%) 90,0 ± 5,00 a 54,0 ± 30,29 b 65,0 ± 7,90 ab 79,0 ± 9,61 ab Sobrevivência 3o ínstar – adulto (%) 83,0 ± 8,37 a 39,0 ± 16,73 b 39,0 ± 9,62 b 58,0 ± 11,51 b Consumo foliar (cm2) 2,80 ± 0,29 a 1,26 ± 0,45 b 1,83 ± 0,65 b 1,67 ± 0,80 b Longevidade machos (dias) 18,7 ± 7,93 a 16,7 ± 7,04 a 18,1 ± 4,36 a 20,8 ± 6,50 a Longevidade fêmeas (dias) 11,9 ± 2,07 a 10,8 ± 1,95 a 9,2 ± 1,31 a 11,8 ± 2,19 a Ovos/fêmea 158,9 ± 59,06 a 130,1 ± 36,06 a 100,1 ± 56,17 a 146,0 ± 21,91 a
1Médias ± DP seguidas de letras diferentes na linha, diferem pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Das concentrações da proteina Cry1Ac testadas em lagartas da população PA de P. xylostella para estimativa da CL50, 0,05; 0,01; 0,005 e 0,001 µg/mL foram
utilizadas para os estudos dos efeitos subletais subsequentes, por elas terem proporcionado sobrevivência suficiente de indivíduos para as avaliações (Tabela 6). O tempo de desenvolvimento para completar a fase larval (3o ínstar a pupa) foi significativamente maior quando as lagartas foram expostas a concentração 0,05 µg/mL (6,9 dias), sendo prolongado por 2,5 dias em relação ao tratamento controle (F4,20 = 13,88; P < 0,0001). O período pupal foi semelhante entre os tratamentos,
com variação de 3,8 (controle) a 7,0 dias (dose de 0,001) (F4,20 = 0,61; P = 0,662).
O peso das pupas foi afetado significativamente pela concentração 0,05 µg/mL (3,9 µg, sendo 1,2 µg menor em relação ao controle (5,1 µg ) (F4,20 = 5,11; P =
0,0053), enquanto a razão sexual foi menor para a concentração 0,005 µg/mL, sendo 28% menor que com 0,001 µg/mL (F4,20 = 3,22; P = 0,0341). A
sobrevivência até a fase de pupa foi afetada pela ingestão das toxinas, com lagartas expostas a concentração 0,05 e 0,01 µg/mL apresentando redução na sobrevivência de 59 e 43% em relação ao grupo controle (F4,20 = 22,97; P <
0,0001). A sobrevivência até a fase adulta também foi bastante reduzida na concentração 0,05 µg/mL, sendo que apenas 12% dos indivíduos completaram a fase (F4,20 = 14,57; P < 0,0001). O consumo foliar de lagartas de P. xylostella
expostas a proteína Cry1Ac, de modo geral foi semelhante nos tratamentos, sendo que apenas na concentração de 0,01 µg/mL foi significativamente maior que no controle e 0,05 µg/mL (F4,20 = 3,61; P = 0,0227).
Tabela 6. Características biológicas de indivíduos da população PA de Plutella
xylostella após a exposição de lagartas a diferentes concentrações da proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Concentrações (µg/mL)
0,0 (controle) 0,05 0,01 0,005 0,001
Período 3o ínstar –
pupa (dias) 4,4 ± 0,55 b
1 6,9 ± 0,34 a 4,8 ± 0,45 b 4,0 ± 0,38 b 4,2 ± 0,45 b
Período pupal (dias) 3,8 ± 0,45 a 3,9 ± 0,55 a 4,0 ± 0,30 a 4,0 ± 0,50 a 7,0 ± 0,45 a Peso pupa (mg) 5,1 ± 0,37 a 3,9 ± 0,36 b 5,2 ± 0,45 a 4,8 ± 0,84 ab 4,6 ± 40 ab Razão sexual 0,55 ± 0,09 ab 0,59 ± 0,06 ab 0,69 ± 0,22 a 0,41 ± 0,18 b 0,44 ± 0,07 ab Sobrevivência 3o ínstar - pupa (%) 93,0 ± 5,70 a 34,0 ± 12,94 b 50,0 ± 2,61 b 90,0 ± 10,61 a 84 ± 5,48 a Sobrevivência 3o ínstar – adulto (%) 68,0 ± 12,04 a 12,0 ± 8,34 c 43,0 ± 7,58 b 45,0 ± 16,58 ab 62,0 ± 16,43 ab Consumo foliar (cm3) 0,8 ± 0,14 b 0,7 ± 0,43 b 1,5 ± 0,63 a 0,9 ± 0,11 ab 1,1 ± 0,30 ab
1Médias ± DP seguidas de letras diferentes na linha, diferem pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Com relação aos efeitos subletais da proteína Cry1Ac na população PC de P. xylostella (Tabela 7), o tempo de desenvolvimento para completar a fase larval (3o ínstar a pupa) foi significativamente maior quando as lagartas foram expostas a
concentração 0,05 µg/mL, sendo prolongado 1,6 dia em relação ao tratamento controle (F4,20 = 5,63; P = 0,0033), sendo que neste tratamento não foram obtidos
indivíduos suficientes para verificação do período pupal e razão sexual. O período pupal foi semelhante entre os tratamentos e variou de 3,7 a 4,0 dias (F3,16 = 1,12;
P = 0,368), assim como a razão sexual que variou de 0,43 a 0,53 (F3,16 = 0,89; P =
0,468). O peso das pupas também foi influenciado pela ingetão da toxina na concentração de 0,05 µg/mL, sendo em média 1,4 mg menor em relação ao controle (F4,20 = 4,08; P = 0,014). A sobrevivência até a fase de pupa na
concentração 0,05 µg/mL foi reduzida em 51% quando comparada ao grupo controle (F4,20 = 5,29; P = 0,0045). A sobrevivência até a fase adulta também foi
bastante reduzida na concentração 0,05 µg/mL, sendo que apenas 15% dos indivíduos atingiram a fase adulta (F4,20 = 4,49; P = 0,0095). O consumo foliar de
lagartas de P. xylostella expostas à proteína Cry1Ac foi semelhante entre os tratamentos, variando de 1,1 a 1,9 cm2 (F4,20 = 0,91; P = 0,478).
Tabela 7. Características biológicas de indivíduos da população PC de
Plutella xylostella após a exposição de lagartas a diferentes concentrações da proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Concentrações (µg/mL)
0,0 (controle) 0,05 0,01 0,005 0,001
Período 3o ínstar –
pupa (dias) 4,8 ± 0,84 b
1 6,4 ± 0,65 a 4,8 ± 1,03 b 4,4 ± 0,55 b 4,8 ± 0,45 b
Período pupal (dias) 3,8 ± 0,45 a - 3,7 ± 0,45 a 4,0 ± 0,40 a 4,0 ± 0,40 a Peso pupa (mg) 5,2 ± 0,26 a 3,8 ± 0,66 b 4,8 ± 0,73 ab 4,8 ± 0,73 ab 4,8 ± 43 ab Razão sexual 0,50 ± 0,15 a - 0,46 ± 0,42 a 0,53 ± 0,08 a 0,43 ± 0,11 a Sobrevivência 3o ínstar - pupa (%) 85,0 ± 10,61 a 34,0 ± 22,19 b 61,0 ± 24,34 ab 60,0 ± 12,25 ab 65,0 ± 14,58 ab Sobrevivência 3o ínstar – adulto (%) 61,0 ± 12,04 a 15,0 ± 8,34 b 30,0 ± 7,58 ab 44,0 ± 16,58 ab 51,0 ± 16,43 ab Consumo foliar (cm3) 1,24 ± 0,41 a 1,66 ± 0,47 a 1,1 ± 0,53 a 1,6 ± 0,57 a 1,9 ± 0,23 a 1Médias ± DP seguidas de letras diferentes na linha, diferem pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Quanto aos efeitos subletais da proteína Cry1Ac na população SBT de P. xylostella (Tabela 8), o tempo de desenvolvimento para completar a fase larval (3o
ínstar a pupa) foi significativamente maior quando as lagartas foram expostas a concentração 0,05 µg/mL, sendo prolongado em 2,3 dias em relação ao tratamento controle (F4,20 = 15,24; P < 0,0001). O período pupal (F4,20 = 1,34; P =
0,289), peso das pupas (F4,20 = 2,51; P = 0,0742) e a razão sexual dos adultos
(F4,20 = 2,03; P = 0,128) foram semelhantes entre os tratamentos. A sobrevivência
até a fase de pupa foi afetada e lagartas que expostas às concentrações 0,005 e 0,001 µg/mL apresentaram redução na sobrevivência de 28 e 36% em relação ao grupo controle (F4,20 = 11,21; P < 0,0001). A sobrevivência até a fase adulta foi
semelhante entre os tratamentos, variando de 52 a 59% (F4,20 = 0,16; P = 0,956).
foi semelhante entre os tratamentos, com índices de consumo variando de 1,7 a 0,7 cm2 (F4,20 = 1,60; P = 0,212).
Tabela 8. Características biológicas de indivíduos da população SBT de Plutella
xylostella após a exposição de lagartas a diferentes concentrações da proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Concentrações (µg/mL)
0,0 (controle) 0,05 0,01 0,005 0,001
Período 3o ínstar –
pupa (dias) 4,4 ± 0,55 b
1 6,7 ± 0,67 a 4,4 ± 0,89 b 4,1 ± 0,22 b 4,8 ± 0,45 b
Período pupal (dias) 3,9 ± 0,22 a 3,8 ± 0,45 a 3,6 ± 0,55 a 4,0 ± 0,40 a 3,5 ± 0,50 a
Peso pupa (mg) 4,4 ± 0,60 a 4,9 ± 0,82 a 5,3 ± 0,58 a 4,4 ± 0,19 a 4,5 ± 30 a Razão sexual 0,46 ± 0,12 a 0,58 0,06 a 0,57 ± 0,04 a 0,41 ± 0,10 a 0,47 ± 0,18 a Sobrevivência 3o ínstar - pupa (%) 95,0 ± 6,12 a 95,0 ± 6,12 a 76,0 ± 12,94 ab 67,0 ± 7,58 b 59,0 ± 17,10 b Sobrevivência 3o ínstar – adulto (%) 56,0 ± 14,32 a 56,0 ± 14,32 a 59,0 ± 17,10 a 53,0 ± 11,51 a 52,0 ± 19,23 a Consumo foliar (cm3) 0,7 ± 0,16 a 1,6 ± 0,92 a 1,0 ± 0,24 a 1,7 ± 0,41 a 0,9 ± 0,26 a
1Médias ± DP seguidas de letras diferentes na linha, diferem pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Com relação aos efeitos subletais da proteína Cry1Ac na população PX de P. xylostella (Tabela 9), o tempo de desenvolvimento para completer a fase larval (3o ínstar a pupa) foi significativamente maior quando as lagartas foram expostas a concentração de 0,05 µg/mL, sendo prolongado em 1,1 dia em relação ao tratamento controle (F4,20 = 4,08; P = 0,014). O período pupal (F4,20 = 0,56; P =
0,697), peso das pupas (F4,20 = 1,23; P = 0,33) e a razão sexual dos adultos (F4,20
= 196; P = 0,14) foram semelhantes nos diferentes tratamentos. A sobrevivência até a fase de pupa foi significativamente menor para insetos cujas lagartas foram expostas a concentração /de 0,05 µg/mL, apresentando redução na sobrevivência de 52% em relação ao grupo controle (F4,20 = 11,27; P < 0,0001). O mesmo
ocorreu com a sobrevivência até a fase adulta, que também foi afetada significativamente pela concentração de 0,05 µg/mL, com redução de 40% em relação a testemunha (F4,20 = 8,03; P < 0,0001). O consumo foliar das lagartas
alimentadas com folhas tratadas com as diferentes concentrações de P. xylostella não diferiu nos tratamentos utilizados (F4,20 = 1,37; P = 0,28).
Tabela 9. Características biológicas de indivíduos da população PX de Plutella
xylostella após a exposição de lagartas a diferentes concentrações da proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis.
Concentrações (µg/mL)
0,0 (controle) 0,05 0,01 0,005 0,001
Período 3o ínstar –
pupa (dias) 4,7 ± 0,84 ab
1 5,8 ± 0,84 a 4,4 ± 0,55 b 4,2 ± 0,45 b 5,0 ± 0,71 ab
Período pupal (dias) 4,0 ± 0,22 a 3,9 ± 0,44 a 3,8 ± 0,22 a 4,0 ± 0,40 a 3,8 ± 0,44 a Peso pupa (µg) 5,3 ± 0,37 a 4,4 ± 0,56 a 4,8 ± 0,29 a 4,9 ± 0,39 a 4,7 ± 26 a Razão sexual 0,54 ± 0,12 a 0,46 0,12 a 0,46 ± 0,11 a 0,45 ± 0,09 a 0,63 ± 0,15 a Sobrevivência 3o instar - pupa (%) 88,0 ± 11,51 a 36,0 ± 10,84 b 71,0 ± 11,94 a 66,0 ± 8,21 a 75,0 ± 9,03 a Sobrevivência 3o instar – adulto (%) 63,0 ± 13,04 a 23,0 ± 9,75 b 55,0 ± 9,35 a 58,0 ± 11,51 a 55,0 ± 17,32 a Consumo foliar (cm3) 1,9 ± 0,12 a 1,0 ± 0,55 a 1,1 ± 0,26 a 1,4 ± 0,29 a 1,6 ± 0,36 a 1Médias ± DP seguidas de letras diferentes na linha, diferem pelo teste de Tukey (P < 0,05).
A proteína Cry1Ac tem mostrado bons resultados para o controle da fase larval de P. xylostella (GONZALEZ-CABRERA et al., 2001; SAYYED et al., 2005; MONNERAT et al., 2007; THULER et al., 2007). Entretanto, não existem avaliações somente desta proteína em populações brasileiras de P. xylostella, sendo que os estudos realizados até o momento verificaram os efeitos de produtos comerciais à base de B. thuringiensis ou isolados da bactéria sobre a traça-das-crucíferas (MEDEIROS et al., 2006; MONNERAT et al., 2007; MORAES; FOERSTER, 1012). Os bioensaios de alimentação conduzidos revelaram que a proteína Cry1Ac é altamente tóxica a lagartas de terceiro ínstar de P. xylostella, sugerindo que ela pode ser uma boa opção biotecnológica para a elaboração de plantas transgênicas, tecnologia esta que ainda não existe no Brasil para brassicáceas consumidas como hortaliças, visando o controle de populações brasileiras da traça-das-crucíferas, bem como formulação de bioinseticidas. Porém, em outros países, brassicáceas geneticamente modificadas, como brócolis e couve, são comercializadas contendo a proteína Cry1Ac e apresentam bons resultados de controle (CAO; SHELTON; EARLE, 2005; CHEN et al., 2008).
O risco de desenvolvimento de resistência é um dos problemas de plantas Bt. Áreas cultivadas com plantas Bt que contém genes de B. thuringiensis com limitadas áreas de refúgio é a principal razão para a evolução da resistência. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que a pressão de seleção em
laboratório ao isolado HD1 após 58 gerações fez com que indivíduos de P. xylostella apresentassem razão de resistência de 78 vezes. Devido a esses fatores, essa é uma tecnologia que deve ser utilizada respeitando-se sempre as indicações para o seu uso. Os resultados observados com relação às diferenças na suscetibilidade também refletem a variação natural da atividade da proteína Cry1Ac entre as populações de P. xylostella.
O desenvolvimento de novas tecnologias que possam diminuir o uso de inseticidas irá favorecer o manejo integrado de pragas em brassicáceas e trará impactos positivos para a produção agrícola, nutrição humana e para o ambiente.
4.2. Ensaios enzimáticos e moleculares