4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3 Fatores de Risco Genômicos
4.3.1 Estudo da Expressão de RNAm dos Genes do Metabolismo do
A avaliação da expressão gênica para o grupo das mães mostrou uma redução significativa na expressão do RNAm para os 4 genes avaliados; gene da metionina sintase (MTR, p=0,008) da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,015); do carreador de folato reduzido (RFC-1, p=0,004); da metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR p=0,017).
A figura 11 mostra a variação da expressão do RNAm desses genes entre grupos estudados em relação ao gene de referência β-Actina.
FIGURA 11: Variação da expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR em relação ao
gene de referência β-Actina nos grupos: mães dos pacientes fissurados (caso) e mães de indivíduos saudáveis e sem malformações congênitas (controles). Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão, comparados pelo método de Kolmogorov Smirnov, bem como Teste t, sendo considerado p<0,05. P=0,008 * P=0,004* P=0,017* 33 P=0,015* MÃES CASO MÃES CONTROLES
GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO
RFC1 MTR MTHFR MTRR EX PRE SS Ã O R ELA TIV A
A figura 12 mostra a variação da expressão do RNAm desses genes entre o grupos de filhos em relação ao gene de referência β-Actina. Os resultados mostram uma redução significativa na expressão do RNAm para os genes da metionina sintase (MTR, p=0,01) e da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,03).
FIGURA 12: Variação da expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR em relação ao
gene de referencia β-Actina nos grupos: Filhos fissurados (caso) e Indivíduos saudáveis e sem malformações congênitas (controles). Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão, comparados pelo método de Kolmogorov Smirnov, bem como Teste t, sendo considerado p<0,05.
A regressão linear univariada demonstrou que tanto no grupo de Mães, casos e controles, (Figura 13) quanto no grupo de Filhos, casos e controles, (Figura 14) os quatro genes envolvidos no metabolismo do ácido fólico avaliados nesse estudo possuem correlação significante positiva onde o aumento da expressão de RNAm da variável dependente influencia o também aumento da expressão de RNAm da variável independente.
Para as mães (casos e controles) quando ajustado como variável dependente a expressão de RNAm da MTHFR em relação aos genes MTR, RFC1 e MTRR (variáveis independentes) foi observada uma correlação positiva significante, na qual a medida que a expressão de RNAm da MTHFR aumenta, ocorre um aumento linear
P=0,670 P=0,010 *
P=0,308
P=0,031*
FILHOS CASO
FILHOS CONTROLES
GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO
RFC1 MTR MTHFR MTRR EX PRE SS Ã O R ELA TIV A
da expressão de RNAm desses genes (MTR, P<0,001; RFC1, P<0,001; MTRR, P<0,001 ) sendo cada aumento de acordo com seus modelos de linearidade descritas na Tabela 7. O mesmo resultado foi observado no grupo de filhos onde o aumento da expressão da MTHFR (variável dependente) possui correlação positiva significante com a expressão dos outros genes (MTR, P<0,001; RFC1, P<0,001; MTRR, P=0,003). Em relação ás dosagens bioquímicas, para as mães foi observado que a concentração sérica de homocisteína (variável independente) está significantemente correlacionada de modo negativo com a expressão de RNAm da MTHFR e da MTR (ajustadas como variáveis dependentes) onde o aumento da expressão desses genes influencia em uma redução linear da concentração sérica da homocisteína (MTHFR, P=0,04; MTR, P=0,023). Para os filhos, a variação da concentração da homocisteína também se correlacionou de forma negativa, entretanto, somente com o gene da MTHFR (P=0,041) na qual o aumento da expressão de RNAm desse gene influencia em uma redução linear da concentração sérica da homocisteína. Em relação às outras dosagens (ácido fólico e vitamina B12) não foram observadas correlações significantes com a expressão de nenhum dos grupos para os genes avaliados nesse estudo.
Na tabela 7 respectivamente, mães e filhos, estão disponibilizados os dados de todas as relações significantes de regressão linear realizadas nesses grupos. O valor de R-quadrado ajustado representa em termos percentuais o quanto cada grupo está correlacionado em suas variáveis analisadas. A equação da reta indica a linearidade com que cada variável independente se comporta em relação à variável dependente.
Grupo de Mães Grupo de Filhos
Modelos Variável
Dependente
Variável
Independente R2 R2 Ajustado E-Padrão Coeficientes P-Valor R2 R2 Ajustado E-Padrão Coeficientes P-Valor
A MTHFR MTR 0.735 0.732 0.0023 B0 0.001 1,10E-25 0.331 0.323 0.0008 B0 0.001 2,32E-08 B1 3.155 B1 2.737 B MTHFR RFC1 0.739 0.736 0.0022 B0 0.0005 5,76E-26 0.357 0.349 0.0007 B0 0.0008 4,79E-09 B1 0.374 B1 0.320 C MTHFR MTRR 0.752 0.749 0.0021 B0 0,0009 7,64E-27 0,105 0.094 0.0009 B0 0.0014 3.31E-03 B1 2.035 B1 0.744 D MTR MTRR 0.726 0.723 0.0006 B0 0.0002 4,65E-25 0.477 0.470 0.0001 B0 0.00008 1,37E-12 B1 0.544 B1 0.333 E MTR RFC1 0.620 0.615 0.0007 B0 0.0002 4,08E-19 0.304 0.295 0.0001 B0 0.0001 1,13E-07 B1 0.093 B1 0.062 F RFC1 MTRR 0.712 0.709 0.0052 B0 0.003 3,55E-24 0.294 0.284 0.0015 B0 0.002 2,09E-07 B1 4.560 B1 2.322
G MTHFR Hcy 0.075 0.059 0.0033 B0 0.008 3.90E-02 0.089 0.069 0.0007 B0 0.0022 4.10E-2
B1 -0.0003 B1 -0.00007
H MTR Hcy 0.092 0.075 0.0010 B0 0.002 2.30E-02
B1 -0.0001
* P-valor <0,05
** B0 = Coeficiente linear B1 = Coeficiente angular
Hcy – Homocisteína; MTHFR – Metileno tetraidrofolato redutase; MTR – Metionina Sintase; RFC1 – Carreador de Folato Reduzido 1; MTRR – Metionina Sintase Redutase
Nas figuras 13 e 14, respectivamente, grupo de mães e grupo de filhos, estão apresentados os gráficos das correlações significantes avaliadas e descritas pelas tabelas 7 e 8. Nos gráficos das mães, observa-se de um modo geral, um menor nível de dispersão em comparação aos dados de expressão gênica plotados nos gráficos do grupo de filhos (figura 14) onde esses valores de expressão das mães possuem tendência de se localizarem próximos à reta indicando a forte correlação entre as variáveis avaliadas. O valor de R-quadrado ajustado para o grupo das mães também representa essa forte correlação existente entre a expressão desses genes onde os valores desse dado estatístico são em média 0,700, representando assim que 70% em média dos valores plotados possuem correlação positiva onde o aumento da variável dependente (eixo X) influencia o aumento subsequente da variável independente (eixo Y). Para o grupo de filhos, apesar da maior dispersão dos dados, as correlações existentes entre os genes também são bastante significantes, com valores de R- quadrado ajustado em média de 0,300, indicando um valor de 30% de correlação positiva dentro dos dados plotados.
Esses dados de correlação mostram a forte interligação existente entre a expressão desses genes (MTHFR, MTR, MTRR e RFC1). Como eles participam de uma mesma via metabólica, para que haja o funcionamento correto do ciclo que tem como molécula chave o tetraidrofolato (THF) eles precisam ser expressos de forma integrada de modo que fatores genéticos e/ou epigenéticos ao afetar a expressão de RNAm de um desses genes pode influenciar a expressão dos demais. Ao analisar os dados de expressão gênica das mães caso em relação às mães controles (Figura 11), pode-se observar que as mães de filhos fissurados apresentam todos os genes com expressão reduzida de RNAm, fato esse que pode estar ligado a um só gene como que acaba por influenciar os demais, como também se todos possuírem alterações em nível genético que reduzam a expressão gênica de si próprio. Os filhos interessantemente apresentam apenas dois genes com expressão reduzida (MTR e MTRR), apesar de existir a correlação positiva entre a expressão desses genes com a MTHFR e RFC1, não houve diferenças significativas entre a expressão desses genes entre o grupo caso em relação ao grupo controle, fato ainda não bem elucidado pelos
FIGURA 13: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo das mães.
A: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e MTR. B: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e MTRR. C: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e RFC1. d: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTR e MTRR. E: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTR e RFC1. F: Relação positiva entre a expressão de RNAm da RFC1 e MTRR.
FIGURA 14: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo de Filhos. A: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e MTR. B: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e MTRR. C: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTHFR e RFC1. D: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTR e MTRR. E: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTR e RFC1. F: Relação positiva entre a expressão de RNAm da RFC1 e MTRR.
Na Figura15 estão representados os gráficos dos dados de expressão dos genes da MTHFR e MTR em relação à concentração sérica de homocisteína no grupo de mães. Apesar da dispersão dos dados, esses apresentaram uma tendência linear negativa indicando que o aumento da expressão desses genes aumenta o consumo da homocisteína dentro do ciclo de reações, uma vez que a MTHFR aumenta a quantidade de metil-tetraidrofolato que é utilizado pela MTR como doador do radical metil sobre a homocisteína transformando-a em metionina. Desse modo, é entendida a razão da existência de correlação entre o aumento da expressão desses genes e a redução da concentração sérica da homocisteína. Assim a relação inversa também é válida, apesar de não observarmos valores elevados nas mães caso desse estudo, a redução da expressão desses genes pode como foi demonstrado fazer com que os níveis de homocisteína se elevem. De modo semelhante no grupo de filhos (Figura 16) a homocisteína apresentou correlação negativa, entretanto somente em relação à expressão de RNAm da MTHFR. Não foram observadas também para esses indivíduos concentrações elevadas de homocisteína nesses indivíduos caso.
FIGURA 15: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes, MTHFR e MTR em relação a concentração sérica de Homocisteína no grupo das mães. A: Relação positiva
entre a expressão de RNAm da MTHFR e Homocisteína. B: Relação positiva entre a expressão de RNAm da MTR e Homocisteína. R Sq Linear 0,076 R Sq Linear 0,092 P=3.90E-02 A P=2.30E-02 B 12,50 10,00 7,50 5,00 2,00 H OM OCI STE ÍNA (µ M o l/ L) H OM OCI STE ÍNA (µ M o l/ L) 12,50 10,00 7,50 5,00 2,00 2x10-3 6x10-3 1x10-2 1,4x10-2 EXPRESSSÃO RNAm MTHFR 1x10-3 2x10-3 3x10-3 4x10-3 5x10-3 6x10-3 EXPRESSSÃO RNAm MTR
FIGURA 16: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm do gene MTHFR em
relação a concentração sérica de Homocisteína no grupo dos filhos. Os dados plotados revelam uma relação inversa entre essas duas variáveis, demonstrando que indivíduos com expressão aumentada de MTHFR possuem menores valores de concentração de homocisteína no soro.
A expressão do loci desses genes é afetada ou regulada de forma multifatorial, estando modulados por fatores ambientais, epigenéticos e genéticos (CROTT, 2008) Sugere-se que a redução da expressão desses genes poderia estar relacionada com a baixa disponibilidade de folato que também se mostrou reduzida no presente estudo, uma vez que a enzima metionina sintase (MTR) utiliza o 5-metiltetrahidrofolato (5-CH3THF), um produto da MTHFR, para fazer a conversão da homocisteína em metionina, após a metilação.
A enzima MTR catalisa a remetilação da homocisteína para metionina por reações em que a metilcobalamina-III atua como um doador intermediário de metil. Nessa reação, a transferência do grupo metil da metilcobalamina-III resulta na formação de cobalamina-I altamente reativa, a qual torna-se oxidada em cobalamina-II, resultando na inativação da enzima MTR (YAMADA et al., 2006). Assim, a metionina sintase redutase (MTRR) interliga-se à ação da MTR com a função de regeneração da metilcobalamina-III, o que a torna responsável pela
R2 0,090 12,50 10,00 7,50 5,00 2,00 H OM OCI STE ÍNA (µ M o l/ L) 15,00 1x10-3 2x10-3 3x10-3 4x10-3 5x10-3 6x10-3 EXPRESSSÃO RNAm MTHFR P=4.10E-2
manutenção do estado ativo da MTR e determina a quantidade de metionina disponível para as reações de metilação celulares.
Assim, o perfil de expressão da MTRR pode estar ligado a redução da expressão da MTR, fato esse que pode ser observado nos resultados obtidos desse estudo em que foi significantemente menor o perfil de expressão dessas duas enzimas comparados aos indivíduos controles. Esta redução foi encontrada tanto no grupo de mães como nos filhos, confirmando uma possivel interligação genômica e também de seus possíveis agentes reguladores. Sugere-se que a baixa disponibilidade de folato associada a uma redução da expressão dessas duas enzimas ao mesmo tempo poderia elevar os níveis de homocisteína em virtude de uma menor concentração e metabolismo enzimático trazendo como consequencias possiveis alterações no perfil de metilações dos genes desta via e de outras.
Neste sentido, a metilação da homocisteína é reconhecida como um mecanismo relevante para a estrutura e função gênica, sendo a metionina o precursor da S-adenosilmetionina, um potente doador de grupos metil para os ácidos nucléicos, neurotransmissores, fosfolipideos e hormônios. Desse modo, essas alterações ligadas ao metabolismo da homocisteína no momento de formação dos tecidos poderia afetar genes que regulam fatores de transcrição, fatores de crescimento, sinalização celular, metabolismos de detoxificação e como consequência induzir o surgimento de malformações como as fendas orais (MURTHY; BHASKAR, 2009).
A MTHFR apresentou reduçao significante em seu perfil de expressão, que poderia sugerir como mecanismo regulatório em virtude da diminuição significativa na concentraçao de ácido fólico no grupo mães caso desse estudo o que pode teoricamente trazer um efeito inibidor da expressão devido a baixa disponibilidade de folato a ser metabolizado pela enzima expressa. Não só esse fato, mas também outros fatores não ligados ao ácido fólico como a presença de polimorfismos nas regiões promotoras dos genes dessas enzimas também podem estar promovendo um efeito regulatório sobre expressão desse gene.
Alguns estudos sugerem que uma deficiência na atividade da enzima MTHFR no metabolismo do folato em neonatos, é considerada a principal causa genética de hiperhomocisteinemia (GUENTHER et al, 1999, ROSENBERG et al,
2002, SCHNAKENBERG et al, 2005 LOPREATO ET AL., 2008). A ocorrência destes distúrbios metabólicos tem sido relacionado com o aparecimento de doença coronária oclusiva, neuropatia periférica, retardo mental, assim como defeitos de fechamento do tubo neural e malformações congênitas.(MEDINA et al, 2001; GIL-PRIETO et al., 2009). Por outro lado, níveis circulantes reduzidos de folato podem causar o acumulo de Homocisteina podendo diminuir a capacidade de metilação do DNA, processo este que regula a expressão de diversos genes durante a embriogênese (KIM, 2009).
Em relação ao carreador de folato reduzido RFC1 o mesmo atua junto com o FOLR1 que é o principal transportador do tetraidrofolato do lúmen intestinal para o interior das células (MATHERLY; GOLDMAN, 2003). A expressão do RFC1 é observada na borda dos cílios pequenos e grandes do epitélio intestinal, e na membrana basolateral do epitélio tubular renal, como também nos hepatócitos, plexo coróide e no epitélio pigmentar da retina (MADDOX et al, 2003). Assim, uma redução da expressão desse carreador nesses tipos celulares, principalmente, no epitélio intestinal pode reduzir a absorção do ácido fólico proveniente da dieta diminuindo sua disponibilidade no organismo.
Nesse estudo se analisou a expressão de células totais do sangue periférico que também expressam corretamente esse carreador, a fim de também
estar transportando o folato para o meio intracelular. Assim podemos observar
que mães de pacientes com fenda oral apresentam redução significante da expressão do RNAm desse carreador o que sugere algum nível importante de comprometimento com a absorção do folato do meio extracelular para o intracelular o que, consequentemente, pode afetar todas as reações em que o folato é participante, principalmente as de síntese de novas moléculas de ácidos nucléicos.
Recentemente, um estudo realizado por Waes e colaboradores (2008), caracterizou o papel do RFC1 durante o desenvolvimento embrionário em um modelo do rato em que o RFC1 foi inativado por recombinação homóloga. Sem a suplementação de folato materno, embriões RFC1 -/- morrem no útero logo após a
implantação. Embriões RFC1 -/- colhidos de mães que receberam suplementação com baixas concentrações de ácido fólico (25 mg / kg / dia), sobreviveram até a metade da gestação, mas com atraso de desenvolvimento e apresentavam
malformações múltiplas, incluindo a falha no fechamento do tubo neural, coração, craniofaciais, e anormalidades nos membros. O exame da placenta revelou que a letalidade embrionária ocorreu devido a uma falha da fusão das membranas corioalantóicas. A suplementação materna de folato com 50 mg/kg/dia resultou na sobrevivência de 22% dos fetos RFC1 mutantes, entretanto esses sobreviventes apresentaram malformações múltiplas craniofaciais, pulmonares, no coração e na pele.
Desse modo, a redução da expressão dos genes do metabolismo do ácido fólico aqui observada nas mães e de alguns genes nos filhos pode ser indicada como um fator de risco a essas mães durante um período gestacional onde se faz necessário o perfeito funcionamento a nível genético e epigenético desse ciclo metabólico a fim de que a biossíntese de DNA e o processo de metilação do genoma não sejam afetados. Essas alterações podem estar contribuindo durante o período de formação das estruturas da face, em problemas relacionados à fusão das membranas que fecham palato e lábio e dessa forma aumentar a incidência de fendas orais em nossa população.
4.5 ESTUDO DA RELAÇÃO DOS GENÓTIPOS COM A EXPRESSÃO DE RNAm