Estudo da expressão dos genes do metabolismo do ácido fólico e associação com o desenvolvimento de fendas orais

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. ESTUDO DA EXPRESSÃO DOS GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E ASSOCIAÇÃO COM O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS. Mestrando: Clélio Diogo Soares Orientador: Prof. Dra. Adriana Augusto de Rezende Co-orientador: Dr. André Ducati Luchessi. NATAL-RN 2012.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. ESTUDO DA EXPRESSÃO DOS GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E ASSOCIACÃO COM O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS. Dissertação apresentada à Coordenação do Programa. de. Pós-graduação. em. Ciências. Farmacêuticas, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.. Mestrando: Clélio Diogo Soares Orientador: prof. Dra. Adriana Augusto de Rezende Co-orientador: Dr. André Ducati Luchessi. NATAL-RN 2012.

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(5) Instituições envolvidas na Pesquisa Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PPgCF - UFRN Universidade de São Paulo, FCF - USP Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Ferreira Bezerra, HOSPED - UFRN Hospital Infantil Varela Santiago, Natal/RN Escola do IV Centenário, Natal/RN. Equipe de Pesquisa Prof. Dr. Mario Hiroyuki Hirata –USP/SP Profa. Dra. Maria das Graças Almeida -UFRN Profa. Dra. Rosário Dominguez Crespo Hirata - USP/SP Profa. Vivian Nogueira Silbiger -UFRN Dr. André Ducati Luchessi – Pós Doutorando - UFRN Maria Leila Cardoso, Doutoranda - PPgCSA/UFRN João Felipe Bezerra, Doutorando - PPgCSA/UFRN Gustavo Medeiros de Oliveira, Doutorando - PPgCSA/UFRN. Colaboradores, Doutorandos, Mestrandos e Iniciação Científica Dra. Águeda Maria Trindade, Médica - Hospital Infantil Varela Santiago Dra. Maria Edinilma Felinto Brito – Médica - HOSPED/UFRN Dra. Sandra Regina de Oliveira, Fonoaudióloga - HOSPED/UFRN Dra. Tânia Maria de Araújo, Nutricionista - HOSPED/UFRN Msc. Francisco Paulo Freire Neto – DBQ/UFRN Aglauciele Maria Lima de Oliveira, IC – Farmácia/UFRN Anne Caroline Barbosa, IC – Farmácia/UFRN Fabrício Melo dos Santos, IC – Farmácia/UFRN Leandro Vinícius de Morais, IC – Farmácia/UFRN.

(6) DEDICATÓRIA A Deus,. Ele é quem nos criou e sabe tudo ao nosso respeito, onde nem o mais sábio pesquisador não se compara a grandeza, sabedoria e poder desse Deus. Dedico a esse trabalho ao único que é digno de toda honra e glória, pois sem dúvida nenhuma, sem a direção dada por Ele eu não teria chegado a bela realização e importância desse trabalho.. A minha mãe Socorro, Pelo exemplo de dedicação, pessoa reta, íntegra e esforçada que ela é, e que nunca mediu esforços muitas vezes sem condições, para realizar meus sonhos profissionais e pessoais. Sem dúvida mãe, você é minha maior e verdadeira felicidade!. A minha esposa Aniely Que sempre esteve e está do meu lado nos momentos bons e difíceis da minha vida profissional e pessoal, me dando força e apoio sempre para que eu consiga crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor.. Ao meu filho Gabriel Você é uma benção de Deus na minha vida, mais uma razão de viver, pois mesmo o cansaço diário muitas vezes me desanimar sempre o seu sorriso me renova.. À minha família, Cledson, Carla e Teté Que são também razão da imensa felicidade de concluir esse trabalho porque cada um de vocês está estampado em todos os momentos de desenvolvimento da minha vida sempre se doaram para que eu pudesse crescer.. Aos meus verdadeiros amigos, Pelo companheirismo durante todos esses anos, que sempre estiveram comigo me dando ânimo e acreditando em mim independente dos meus defeitos e qualidades..

(7) AGRADECIMENTOS. À Minha orientadora Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende e ao meu CoOrientador Dr. André Ducati Luchessi, pelos ensinamentos passados, pela paciência, por sempre acreditar que podemos melhorar a cada dia e darmos o nosso melhor sempre.. À Profa. Dra. Maria das Graças Almeida por nos ensinar tanto como devemos ser e que condutas devemos ter para alcançarmos nossos objetivos.. Ao Prof. Tit. Mario Hiroyuki Hirata que confiou em nosso grupo de forma completa, confiando em nossa capacidade submeteu nosso Projeto a FAPESP, possibilitando dessa forma a realização do mesmo.. À Sandra Regina de Oliveira, Fonoaudióloga do HOSPED/UFRN que foi a idealizadora do Programa de Atendimento aos Pacientes Fissurados desse hospital e que sempre lutou para a realização do Projeto, incluindo todos os componentes do Programa.. À Dra. Águeda Maria Trindade Germano que nos abriu a possibilidade de agregarmos ao nosso trabalho os pacientes atendidos no Hospital Varela Santiago.. Ao Prof. Dr. José Brandão Neto (Depto. de Medicina Clínica - UFRN). Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela contribuição na minha formação profissional. Ao Laboratório de Análises Toxicológicas e Clínicas – LIATEC e seus funcionários pela disponibilidade e importante contribuição.. À equipe do Hospital de Pediatria, através das enfermeiras Telma e Jane pela disponibilidade e cooperação.. Aos indivíduos, casos e controles, que participaram desse estudo, pois eles são a razão do nosso esforço e dedicação para cumprir nossa meta de trazer elucidações sobre as causas genéticas das fendas orais..

(8) Aos funcionários Aureliana, Fábia e Washington, pela presença amiga, pelo carinho e ajuda.. À Cristina e toda equipe do LABMAD/USP pela ajuda, sempre que possível.. À equipe do LABMULT/LABIOMOL: Gustavo, Leila, Felipe, Heglayne, Karla, Yonara, Gabriel, Marcela, Freire, Brunno, Melina, Rand, Raul, Fabrício, Anne Caroline, Aglauciéle e Leandro que durante anos dedicam tempo, trabalho e talento em prol da pesquisa e do crescimento pessoal. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP por fomentar esse projeto científico. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pela bolsa de mestrado concedida..

(9) RESUMO Introdução: Há evidencias consideráveis sugerindo que genes relacionados ao metabolismo do folato possuem um papel importante na etiologia das fendas orofaciais. A expressão de genes que possam estar ligados às fendas orais requer a presença de apropriadas causas ambientais em combinação com fatores genéticos que culminam com a falha na fusão dos processos faciais. Objetivo: Realizar estudo de associação da expressão dos genes da via do metabolismo do acido fólico - MTHFR, MTR, RFC1, MTRR, com a ocorrência das fendas orais. Metodologia: Foram estudados 50 filhos casos e suas respectivas mães, e 50 indivíduos controles e suas respectivas mães. Inicialmente foram realizadas as análises bioquímicas (Glicose, ALT, AST, Creatinina, Folato, Vitamina B12, Homocisteína), hematológicas (hemoglobina, hematócrito, contagem de hemácias, os índices hematológicos, VCM, HCM e CHCM) e estudo de suas características clínicas. Para a realização do estudo de expressão gênica foi extraído o RNA total a partir das células do sangue periférico, o qual foi quantificado e analisado quanto a sua pureza e integridade e encaminhado para a obtenção do cDNA a ser utilizado para o estudo de expressão utilizando ensaios pré-desenhados. Finalmente foi avaliada a influência de determinados genótipos (MTRR A66G; MTHFR C677T; MTHFR A1298C; MTR A2756G; RFC1 A80G) sobre a expressão de RNAm dos respectivos genes estudados. A análise estatística dos dados foi realizada considerando o nível de significância de 95% (P<0,050) Resultados: Foi evidenciada a presença do consumo de álcool como fator de risco significativo presente para as mães caso (P=0,001). Em relação as dosagens bioquímicas não foram observadas diferenças significativas entre os casos e respectivos controles os quais apresentaram valores de AST, ALT e creatinina dentro dos valores de referência. A dosagem de ácido fólico apresentou-se reduzida significativamente para o grupo dos filhos caso (P=0,010) e para suas mães (P=0,001). Na análise hematólogica não foram observadas alterações em nenhum dos parâmetros avaliados como hemoglobina, hematócrito, contagem de hemácias, os índices hematológicos, VCM, HCM e CHCM dentre os grupos avaliados. A avaliação da expressão gênica para o grupo das mães caso mostrou uma redução significativa na expressão do RNAm em todos os genes avaliados: para o gene da metionina sintase (MTR, p=0,008), da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,015), do RFC1 (P=0,004) e da MTHFR (P=0,017) comparados com o grupo de mães controle. No grupo de filhos fissurados, houve uma redução significativa na expressão do RNAm para os genes da metionina sintase (MTR, p=0,010) e da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,034). Para a análise da influencia dos genótipos na expressão observou-se que o genótipo recessivo (CC) para o polimorfismo A1298C do gene MTHFR poderia estar associada a uma redução da expressão de seu RNAm. Conclusão: Genes do metabolismo de folato relacionados são reduzidamente expressos em ambos os grupos caso deste estudo, uma vez que todos os quatro genes (RFC1, MTHFR, MTR, MTR), estavam reduzidos nas mães e dois genes (MTR, MTRR) em seus filhos. A redução da expressão desses genes representa um aumento do risco associado com a presença de fendas orais nestes indivíduos. Palavras Chaves: Expressão gênica; Fendas Orais, Polimorfismos genéticos..

(10) ABSTRACT. Introduction: There is considerable evidence suggesting that folate-related genes play a role in the etiology of oral facial clefts. Clefts are known to have a strong genetic component. The expression profile of genes involved on the pathway and folic acid metabolism which is linked to oral clefts requires appropriate environmental causes in combination with genetic factors that culminate in the failure of fusion of facial processes. Objective: The objective is to perform the association of differential gene expression of folate metabolism genes (MTHFR, MTR, RFC1, MTRR) with the occurrence of oral clefts. Methods: We studied 50 subjects with oral clefts and their mothers, and 50 individuals absent of oral clefts and their mothers, totaling 100 individuals referred cases and 100 controls respectively. For gene expression study, total RNA was extracted from peripheral blood cells, then it was quantified and analyzed for purity by absorbance relation and integrity in MOPS gel. The mRNA samples with good purity and integrity were transcribed to cDNA using reverse transcription kit. The cDNA was used in pre-designed gene expression assays. In a previous study performed by our group were evaluated by PCR-RFLP the MTRR A66G, MTHFR C677T, MTHFR A1298G, MTR A2756G, RFC1 A80G polymorphisms, in this study we evaluated the influence of these polymorphisms on gene expression. It was also performed biochemical, hematological analyzes and a clinical characteristics study of these individuals. We performed statistical analysis considering the significance level of 95% (P <0.050) Results: The consumption of Alcohol was reported as a significant risk factor for the present case mothers (p = 0.001). Regarding the biochemical there were no significant differences between children cases group and their controls which had values of AST, ALT and creatinine within the reference values. The folic acid dosage presented significantly reduced in case mothers group (P = 0.011). In haematological analysis was not observed significant changes in any of the evaluated parameters such as hemoglobin, hematocrit, erythrocyte count, and hematological indices, MCV, MCH and MCHC among the groups. The assessment of gene expression for case mother group showed a significant reduction in mRNA expression in all evaluated genes; for the methionine synthase gene (MTR, p = 0.008), the methionine synthase reductase (MTRR, p = 0.015), the reduced folate carrier 1 (RFC1, P= 0.004) and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR, P= 0.017) compared with the control group mothers. In the case children group, similar results were obtained, with a significant reduction in mRNA expression of methionine synthase gene (MTR, p = 0.010) and methionine synthase reductase (MTRR, p = 0.034) analysis of genotypes in relation to expression was found that the recessive genotype (CC) for the MTHFR gene A1298C polymorphism is associated with reduced expression of its mRNA. Conclusion: Folate metabolism related genes are low expressed on both case groups of this study, since all four genes (RFC1,MTHFR, MTR, MTR,) were reduced on mothers and two genes (MTR, MTRR) in their children. These down regulated genes represent an increased risk associated with the presence of oral clefts in these individuals.. Keywords: Gene expression, oral clefts, genetic polymorphisms.

(11) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO............................................................................... 15. 1.1 1.2. Metabolismo do Ácido Fólico e Fendas Orais............................... Aspectos Genômicos: Expressão e Polimorfismos nos Genes Candidatos para o Desenvolvimento de Fendas Orais................. 20. 2. OBJETIVOS................................................................................... 27. 2.1. Objetivo Geral................................................................................. 27. 2.2. Objetivos Específicos..................................................................... 27. 3 3.1 3.2. METODOLOGIA........................................................................... Aspectos do Estudo....................................................................... Casuítica ........................................................................................ 28 28 28. 3.3 3.4. Determinações dos Parâmetros Bioquímicos e Hematológicos............................................................................... Estudo de Expressão Gênica......................................................... 29 30. 3.4.1 3.4.2. Extração do RNA Total.................................................................. Análise da Integridade do RNA total ............................................. 30 30. 3.4.3 3.4.4 3.4.4.1. Síntese do cDNA .......................................................................... Escolha do Gene de Referência .................................................. Análises dos dados de amplificação e definição do gene de referência....................................................................................... Análise da Expressão Gênica por qPCR ...................................... Análise Estatística.......................................................................... 33 32. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................... Caracterização da Amostra........................................................... Avaliação dos Fatores de Risco Associados ao Desenvolvimento das Fendas Orais ............................................ Fatores de Risco Genômicos........................................................ Estudo da Expressão de RNAm dos Genes do Metabolismo do Ácido Fólico – MTHFR, MTR, MTRR, RFC1................................. Estudo da Relação dos Genótipos com a expressão De RNAm dos Genes do Metabolismo do Ácido Fólico................................ Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A80G do gene RFC1 em seu perfil de expressão de RNAm................................ Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A2756G do gene MTR em seu perfil de expressão de RNAm.................................. Relação entre os Genótipos do Polimorfismo C677T do gene MTHFR em seu perfil de expressão de RNAm............................. Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A1298C do gene MTHFR em seu perfil de expressão de RNAm ............................. 37 37. 3.5 3.6 4 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4 4.5.5 5 5. 23. 33 35 36. 39 44 44 55 56 58 61 64. Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A66G do gene MTRR em seu perfil de expressão de RNAm................................ 67. CONCLUSÕES............................................................................. REFERÊNCIAS ............................................................................ APÊNDICE A ............................................................................... APÊNDICE B................................................................................ APÊNDICE C................................................................................. 71 72 79 81 83.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS AAFLAP – Associação de Apoio aos Fissurados Labiopalatais ALT – Alanina aminotransferase AST – Aspartato aminotransferase CADEFI – Centro de Atenção aos Defeitos da Face CEFIL – Centro de Apoio e Reabilitação dos Indivíduos com Fissuras Lábio-palatinas de Londrina e região CHCM – Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média DNA – Ácido desoxirribonucleico RNA – Ácido ribonucléico ECLAMC – Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações Congênitas EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético FAPESP – Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo HCM – Hemoglobina Corpuscular Média HOSPED – Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Bezerra da UFRN HRAC – Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais IMIP – Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira LABIOMOL – Laboratório de Biologia Molecular da PPGCF/UFRN MS – Ministério da Saúde MTHFR – Metilenotetrahidrofolato Redutase MTR – Metionina Sintetase (Methionine Synthase) OMS – Organização Mundial de Saúde ONG – Organização Não-Governamental PCR – Reação em Cadeia pela Polimerase PPgCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN RFC1 – Transportador de folato reduzido 1 (Reduced Folate Carrier) RRTDCF – Rede de Referência no Tratamento de Deformidades Craniofaciais SAM – S-adenosilmetionina SIH – Sistema de Informações Hospitalares TBE – Tampão Tris Borato EDTA TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido tHcy – Concentração de homocisteína total UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte USP – Universidade de São Paulo VCM – Volume Corpuscular Médio.

(13) LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Tipos de fendas orais. 16. FIGURA 2. Esquema da via metabólica do ácido fólico. 22. FIGURA 3. Gel de Integridade de RNAm – Amostra íntegras. 31. FIGURA 4. Gel de Integridade de RNAm – Amostra degradadas. 31. FIGURA 5: Curvas de amplificação dos genes de referência – Filhos. 32. FIGURA 6. Curvas de amplificação dos genes de referência – Mães. 33. FIGURA 7. Imagem da análise do gene de referência através do software geNorm.. 34. FIGURA 8. Distribuição dos casos analisados de acordo com o tipo de fenda.. 37. FIGURA 9. Distribuição dos casos analisados de acordo com o gênero.. 38. FIGURA 10. Distribuição dos casos analisados de acordo com o tipo de fenda subdivididos em função do gênero.. 38. FIGURA 11. Expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR em relação ao gene de referencia β-Actina nos grupos: mães caso e mães controles. 44. FIGURA 12. Expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR em relação ao gene de referencia β-Actina nos grupos: filhos casos e filhos controles.. 45. FIGURA 13: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo das mães.. 49. FIGURA 14: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo de Filhos. 50. FIGURA 15: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm dos genes, MTHFR e MTR em relação a concentração sérica de Homocisteína no grupo das mães. 51. FIGURA 16: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de RNAm do gene MTHFR em relação a concentração sérica de Homocisteína no grupo dos filhos. 52. FIGURA 17: Análise da expressão do RNAm do gene RFC1 em relação ao genótipos do polimorfismo A80G. A:. 56.

(14) FIGURA 18: Diagrama de caixas valores de expressão de RNAm do gene RFC1 divididos por genótipo do polimorfismo A80G.. 57. FIGURA 19: Análise da expressão do RNAm do gene da MTR versus genótipos do polimorfismo A2756G. A:. 59. FIGURA 20: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do gene MTR divididos por genótipo do polimorfismo A2756G. A:. 60. FIGURA 21: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus genótipos do polimorfismo C677T.. 62. FIGURA 22: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do gene MTHFR divididos por genótipo do polimorfismo C677T.. 63. FIGURA 23: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus genótipos do polimorfismo A1298C.. 65. FIGURA 24: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do gene MTHFR divididos por genótipo do polimorfismo A1298C.. 66. FIGURA 25: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus genótipos do polimorfismo A66G.. 68. FIGURA 26: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do gene MTRR divididos por genótipo do polimorfismo A66G. 68.

(15) LISTA DE TABELAS. TABELA 1. Análise dos valores de CT dos filhos realizada pelo. 34. Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência. TABELA 2.. Análise dos valores de CT das mães realizada pelo. 35. Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência ideal. TABELA 3. Ensaios de expressão gênica TaqMan® padronizados. 36. pela Applied Biosystems (Foster city, CA, EUA) TABELA 4. Fatores de risco associados ao desenvolvimento de. 40. fendas em mães e controles TABELA 5. Idade das mães ao nascimento dos filhos analisados. 41. TABELA 6. Dosagens bioquímicas. 44. estudados. e hematotólicas dos grupos.

(16) 16. 1. INTRODUÇÃO. As fendas orais são conhecidas por ter um forte componente genético, sendo sugerido que resultam de uma complexa interação de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. Em humanos, a expressão de genes finamente coreografada à migração celular, à transformação celular e apoptose entre 14º e 60º dias após a concepção origina os tecidos moles e duros da face a partir da membrana de origem orofaríngea (WEHBY; MURRAY, 2010, REITER et al., 2012). Distúrbios nesse processo de desenvolvimento embrionário podem culminar com a formação incompleta de estruturas nas cavidades nasal e oral, tais como lábios, alvéolos e palato. Outras regiões da face como orelhas e pálpebras também podem apresentar malformações e surgem com menor frequência, podendo estar parcial ou totalmente acometidas. (MARTELLI JÚNIOR et al., 2007). As fissuras de lábio e/ou palato são divididas em fissuras de palato isoladas (FPI) ou fissura labiopalatina (FL/P). Podem ser sindrômicas, quando ocorrem juntamente com outra malformação ou outras síndromes como exemplo a síndrome de Down e podem ser não sindrômicas (NS), quando ocorrem isoladamente. Aproximadamente 70% dos indivíduos com FL/P e 50% dos com FPI possuem essa malformação com origem não sindrômica ou associada a outros defeitos congênitos estruturais. Os 30% restantes das FL/P e 50% restantes das FPI estão relacionados com outras síndromes e agentes teratogênicos (MOORE; STANIER, 2004; REITER et al., 2012). Dispostos a descrever as fendas orais de maneira a facilitar os estudos e unificar a nomenclatura acerca dessas malformações craniofaciais, vários autores buscaram classificá-las de acordo com seu entendimento. Em 1942, FoghAndersen apresentou uma classificação baseada na embriologia e na genética envolvida na formação das fendas. Nessa, as fendas foram divididas em três principais grupos: I - Fenda labial (simples ou dupla), II - Fenda labiopalatina, que é o maior grupo (abrangendo fendas completas da narina até a úvula), III) Fenda de palato, sendo sempre mediana e nunca ultrapassando o forame incisivo. Já em 1972, Spina propôs uma nova classificação, sendo esta ainda hoje a mais utilizada pelas equipes multidisciplinares envolvidas no tratamento das crianças portadoras de fendas orais. É uma classificação clara e objetiva baseada.

(17) 17. no forame incisivo (Figura 1). O forame dos incisivos é o marco de separação embriológica e anatômica das fendas que acometem o palato primário e secundário. Esta classificação pode ser dividida em 4 grupos: I) Fendas Préforame incisivas, sendo do tipo unilaterais (direita ou esquerda, completa ou incompleta), bilaterais (completa ou incompleta) ou mediana (completa ou incompleta); II) Fendas Transforame incisivas, sendo do tipo unilaterais (direita ou esquerda), bilaterais e medianas; III) Fendas Pós-forame incisivas completas ou incompletas e IV) Fendas raras da face (SPINA; PSILLAKIS; LAPA, 1972.; NUNES, et al. 2007; CYMROT et al., 2010).. FIGURA 1. Classificação dos tipos de fendas orais. A: Representação esquemática em corte transversal do palato mostrando a posição do forame incisivo que divide as fendas em: Préforames, Transforames, Pós-forames. B: Corte transversal palato vista inferior mostrando os tipos de fenda oral. 1-fissura pré-forame unilateral incompleta; 2-fissura pré-forame bilateral incompleta; 3-fissura pré-forame unilateral completa 4-fissura pré-forame completa bilateral; 5-fissura transforame unilateral; 6-fissura transforame bilateral; 7-fissura pós-forame completa; 8-fissura pós-forame incompleta. C: Ilustrações dos tipos de fenda oral em modelo humano. 1- Visão frontal externa da fissura transforame unilateral; 2- visão transversal da fissura transforame unilateral; 3Visão frontal externa da fissura pré-forame unilateral incompleta; 4- Visão transversal inferior da fissura pós-forame completa. (CYMROT et al., 2010). As fendas orais geram no indivíduo problemas relacionados à fala, ao desenvolvimento dentário como também levam a danos psicológicos, sendo frequentemente necessárias cirurgias para correção funcional e estética em que.

(18) 18. na maioria das vezes o paciente precisa ser submetido a uma série de cirurgias a fim de que a malformação seja corrigida, e após a(s) cirurgias esse paciente precisa. ser. psicológico.. acompanhado. por. atendimento. fonoterápico,. ortodôntico. e. A realização do tratamento adequado desses pacientes é. fundamental para que o fissurado se adapte corretamente na sociedade, porém é extremamente complexo e de alto custo (BRUSTOLIN, 2009). Estima-se a existência de 1 caso para cada 650 nascidos vivos no Brasil, sendo que os poucos estudos disponíveis apresentam reduzida confiabilidade devido ao fato de utilizarem-se de amostras pequenas e, em sua maioria, relativas a estatísticas hospitalares de algumas localidades do País, onde a maioria dos estudos não envolve casos da região Norte e Nordeste (MONLLÉO, GIL-DASILVA-LOPES, 2006). Além disso, os dados disponíveis pelo Ministério da Saúde (MS) relacionam apenas os números de cirurgias realizadas para fendas labiais e/ou palatinas de acordo com o gênero, a faixa etária e nos Estados onde mais frequentemente se realizaram os procedimentos, não existindo estudos estatísticos oficiais que determinem a incidência das fendas labiais e/ou palatinas (NUNES et al., 2007). No Rio Grande do Norte, um levantamento realizado entre 2000 e 2005 utilizando as notificações feitas ao Ministério da Saúde, através do Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos (SINASC), revelou uma prevalência fendas orais na ordem de 0,49:1.000 nascidos vivos. Esse mesmo estudo aponta que nesse período ocorreram 318.667 partos com nascidos vivos no RN e 155 crianças apresentaram algum tipo de fenda oral. Nessa população, foram identificados 32 casos de fendas labiais (0,10:1000), 19 pacientes apresentaram fenda palatina isolada (0,06:1000) e 104 pacientes com fissuras labiopalatinas (0,33/ 1000 nascidos vivos) (FIGUEIRÊDO, et al., 2011). Figueiredo. e. colaboradores. (2011). mostraram. um. aumento. na incidência das fendas orais no Rio Grande do Norte ao longo período estudado e nos anos 2000 e 2001 foram observados os índices mais baixos (0,39 e 0.40:1000, respectivamente), um pico em 2002 com 0,55:1000 e uma leve redução em 2003 e 2005 (0,54:1000). Além disso, estima-se, em virtude da baixa notificação de casos e de um fator genético recorrente nas famílias, que a ocorrência desta malformação nos estados do Nordeste, especialmente no Rio Grande do Norte, é possivelmente superior do que na região Centro-Sul. Desta.

(19) 19. forma, torna-se imprescindivel a realização de estudos contínuos que possam estimar a prevalência e incidência deste defeito congênito no estado do RN para que o Programa de Atendimento aos pacientes com Fendas Orais, atualmente instalado no Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra HOSPED/UFRN,. se. consolide. como. centro. de. referência. do. Estado,. encaminhando assim para a efetiva inclusão da assistência aos indivíduos acometidos de defeitos congênitos craniofaciais no SUS. Deve ser ressaltado que a especialidade de genética clínica exigida na equipe complementar é contemplada na equipe do HOSPED, e que o Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL) do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas e em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi incorporado ao Serviço de alta complexidade para a realização dos estudos genéticos. Devido à alta incidência das fendas orais em diferentes populações, estudos realizados desde a década de 80 foram desenvolvidos a fim de melhor compreender o modelo de herança e os genes relacionados com a etiologia das fendas orofaciais em pacientes não sindrômicos, contudo os resultados ainda são inconclusivos e discreântes. A complexa interação entre fatores genéticos e ambientais também deve ser considerada na etiologia das fissuras labiopalatinas. O modelo de herança atualmente aceito é o multifatorial com limiar, apesar de inconclusivo em algumas populações (MELNICK et al., 1980; MARAZITA et al., 2004). Este modelo esclarece que a ocorrência das fissuras depende de múltiplas alterações genéticas com efeitos sinérgicos associados a fatores ambientais, e o acúmulo desses fatores de risco (genéticos e ambientais) podem levar ao desenvolvimento das fendas orofaciais. (GORLIN et al., 2000). Portanto as fendas orais mostram uma forte agregação familiar, o que denota a existência de um componente genético importante e podem ocorrer devido a mais de 450 causas incluindo alterações cromossômicas, a um gene isolado, exposição ambiental e/ou síndromes de causa desconhecida (BERTOJA, 2006. WEHBY; MURRAY, 2010). Estimativas do risco de recorrência para parentes de primeiro grau (definida como a prevalência de fissuras em parentes de primeiro grau em comparação com a prevalência da população) revela uma faixa de recorrência em 32 vezes na recorrência de fissura de lábio e de 56 vezes na recorrência para fissuras palatinas.

(20) 20. (SIVERTSEN, et al. 2008). Tais estimativas são úteis para a realização de um aconselhamento genético, pois podem fornecer evidências para inferências sobre a causalidade dessas malformações (HARPER, 1998; FIRTH, 2005). FoghAndersen (1942) mostrou que a fissura palatina pode possuir causas diferentes das relacionadas a fissuras labiais, essas com ou sem fenda palatina, mostrando que as famílias com alto risco para um tipo não estão em risco aumentado para o outro. Desse modo há um conjunto informações genéticas, ainda não conclusivas, porem. indicativas. de. forte. contribuição. e. predisposição. existentes. no. desenvolvimento das fendas orais. Elas podem ser causadas pelas múltiplas interações entre os genes e cada gene possui sua própria tendência variável de ser expresso. Somado a isso, a expressão dos genes candidatos requer a presença de apropriadas causas ambientais. Marcadores em mais de 16 regiões cromossomais têm demonstrado evidência de ligação às fendas orais e seus fenótipos relatados em muitos estudos de associação, sugerindo que estes loci genéticos podem conter muitos genes influenciando o desenvolvimento delas, incluindo não exclusivo ou limitadamente, genes que regulam fatores de transcrição, fatores de crescimento, sinalização celular, metabolismos de detoxificação (MURTHY; BHASKAR, 2009). A interação entre os genes, mutações, e polimorfismos pode estar alterando a expressão dos genes que regulam o metabolismo do folato. Genes que são responsáveis pela herança das fendas sindrômicas são fortes candidatos para as fendas nãosindrômicas, em que mutações com algum efeito ou polimorfismos podem ser fatores de risco (SCAPOLI et al., 2008). Atualmente, poucos são os estudos de expressão gênica envolvendo os genes do metabolismo do ácido fólico e associação dos mesmos ao surgimento das fendas orais. Portanto, a realização de um estudo de expressão com esses genes candidatos em indivíduos com fendas orais poderá trazer conhecimentos de como estes genes estão expressos e a sua relação com o desenvolvimento dessa malformação..

(21) 21. 1.1 METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E FENDAS ORAIS. Vários estudos mostram que a suplementação materna com ácido fólico no período pré-natal reduz a freqüência de neonatos com defeitos congênitos. Várias intervenções e estudos de caso-controle têm proposto que o uso pré-natal de multivitaminas contendo ácido fólico previne o aparecimento de fendas orais (BAILEY et al, 2003; JOHANNING et al 2005; BLIEK et al., 2009, PICKELL et al, 2009). Quando ingerido, o ácido fólico encontra-se geralmente na forma de poliglutamato, porém para que haja absorção nas células do jejuno proximal, através do carreador de folato reduzido 1 (RFC1) presente na membrana das células da mucosa intestinal, o ácido fólico precisa estar na forma de monoglutamato. Portanto, o RFC1 deve operar eficientemente para garantir adequada concentração intracelular de folato. Variações no transportador de folato reduzido são merecedoras de investigações como potenciais fatores de risco para distúrbios no tubo neural e nas fendas orais (SHAW et al., 2006). Na figura 2 podemos observar o ciclo metabólico do ácido fólico desde a sua absorção às reações que objetivam a biossíntese de ácidos nucléicos e formação da molécula doadora de radicais metis que regulam a expressão gênica. A enzima carboxi glutamato peptidase II é responsável pela desconjugação do folato da forma poli para monoglutamato no intestino, permitindo sua absorção (WINKELMAYER et al. 2003). Após a absorção no intestino o folato monoglutamato é reduzido e convertido a 5-metil-tetrahidrofolato monoglutamato e transportado para a corrente sanguínea. (BAILEY et al, 2003; JOHANNING et al 2005; BLIEK et al., 2009, PICKELL et al, 2009). O folato atua na principal via co-enzimática no metabolismo de doação de carbonos, via essa que está diretamente ligada à biossíntese de nucleotídeos e aminoácidos, como também na produção da principal molécula doadora de radicais metil que regulam a expressão gênica, a S-adenosilmetionina, assim esses são mecanismos importantes no processo de proliferação e desenvolvimento celular (KIM, 2009). A figura 2 representa esquematicamente os caminhos metabólicos do folato. Dentro da célula o folato, na forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-CH3THF), é um doador de carbono, estando envolvido na biossíntese das purinas e pirimidinas e na remetilação da homocisteína. A enzima metilenotetrahidrofolato.

(22) 22. redutase (MTHFR) é responsável pela conversão do 5,10-metilenotetrahidrofolato (5,10-CH2THF) a 5-metiltetrahidrofolato, que é utilizado pela metionina sintase (MTR) na conversão da homocisteína a metionina. A deficiência da atividade da enzima MTHFR no metabolismo do folato em neonatos, é considerada a principal causa genética de hiperhomocisteinemia (SCHNAKENBERG et al, 2005, PICKELL, et al., 2009). No que diz respeito a metilação da homocisteina em metionina, é essencial a presença de folato (5-CH3THF) e ainda da vitamina B12. Concentrações séricas de folato, e as de vitaminas B6 e B12, são portanto inversamente correlacionadas com as concentrações séricas de homocisteína. A metilação da homocisteína é reconhecida como um mecanismo relevante para a estrutura e função gênica, sendo a metionina o precursor da S-adenosilmetionina, um potente doador de grupos metil para os ácidos nucléicos, neurotransmissores, fosfolipideos e hormônios. Concomitantemente com a geração de metionina, o tetrahidrofolato formado é convertido a 5,10-metilenotetrahidrofolato, facilitado por um enzima dependente de vitamina B6. O 5,10-metilenotetrahidrofolato é requerido para a biossíntese de nucleotideos purínicos e timidilato necessários a síntese e reparo do DNA (HARTMAN et al, 2001, GUERRA-SHINOHARA et al., 2007). A homocisteína é biosintetizada apartir da metionina, estando relacionado a uma via metabólica entre folato e ciclos de remetilação, onde três principais eventos podem ocorrer com a homocisteína: a remetilação da metionina, a entrada na via biossintética da cisteína, ou a liberação para o meio extracelular. Claramente, este terceiro evento é a principal causa do aumento das concentrações da homocisteína na urina e no plasma. O acúmulo da homocisteína nos liquídos corporais leva a formação de compostos altamente reativos como a homocisteína tiolactona, que contém uma ligação tio-éster intramolecular de alta energia, que a deixa quimicamente reativa levando facilmente a acilação de grupos amino livres, principalmente na asparagina, glutamina, arginina e lisina, sendo esta alta reatividade implicada no envolvimento da homocisteína na fisiopatologia de diversas doenças (MEDINA et al, 2001; GILPRIETO et al., 2009)..

(23) 23. FIGURA 2. Representação esquemática da via metabólica do ácido fólico. MTHFR=metilenotetrahidrofolato redutase, MTR=metionina sintase, MTRR=metionina sintase redutase, THF=tetrahidrofolato, 5-MTHF=5-metiltetrahidrofolato, 5,10-MTHF= 5,10 dimetiltetrahidrofolato. Fonte: adaptado de Brandalize, et al., 2005. Uma análise dos dados do Programa de Monitoramento de Defeitos Congênitos da Califórnia revelou que o uso materno de multivitaminas está associado com uma significante redução na ocorrência das fendas orais. Neste estudo, uma redução de 50% na ocorrência de fendas lábio-palatinas e de 27% de fendas palatinas isoladas está associada com o uso materno de multivitaminas contendo ácido fólico. Um achado similar foi relatado por Itikala et al (2001), que estudou mulheres que utillizaram multivitaminas durante o período pré-natal ou que iniciaram o uso durante o primeiro mês de gestação. Por outro lado, nenhuma associação foi observada em um estudo de caso-controle hospitalar realizado em Boston, Philadelphia e Toronto. Entretanto uma investigação posterior na mesma área realizada por Werler et al (1999), encontrou diminuição significante para fenda palatina, mas não para fenda lábio-palatina entre mulheres que utilizaram multivitaminas contendo ácido fólico durante a gravidez (BAILEY et al, 2005)..

(24) 24. 1.2 ASPECTOS GENÔMICOS: EXPRESSÃO. E POLIMORFISMOS DOS. GENES CANDIDATOS PARA O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS. Até o presente momento poucos são os relatos de estudos de expressão gênica que relacionem a regulação de genes específicos com desenvolvimento de fendas orais. No entando, há uma representatividade de trabalhos relatando que os genes envolvidos no metabolismo do acido fólico, estão sob influencia de fatores regulatórios como a deficiência de folato (má ingestão ou má absorção), medicamentos e drogas, e outros fatores ambientais que regulam a expressão desses genes. Assim, estas alterações no metabolismo do folato o qual está diretamente ligado a sintese de ácido nucléicos e doador de radicais metil que regulam a expressão gênica podem estar indiretamente relacionadas com o aparecimento de malformações como exemplo as fendas orais (ROY, et al.. 2008., RANGANATHAN, et al.2008; LINHART, et al. 2009;) A deficiência de folato pode afetar a expressão gênica por perturbar os padrões de metilação do DNA, indução de substituições de bases, quebras de DNA, deleções e amplificações gênicas. Alterações na expressão poderiam explicar ainda a relação inversa observada entre os níveis de folato e risco de algumas doenças como câncer de cólon-retal (CROTT, et al. 2008). A baixa disponibilidade de folato no organismo resulta em níveis reduzidos de timina o que leva a inserção errada da uracila no DNA com efeito subsequente de quebra na fita simples ou dupla do DNA, resultado esse demonstrado em células de hamster ovariano chinês, células do epitélio intestinal de murinos, e linfócitos humanos (LINHART, et al. 2009). A depleção do folato também leva a instabilidade. cromossômica,. proliferações. celulares. desreguladas,. e. susceptibilidade aos danos no DNA de linfócitos humanos primários e células epiteliais do cólon (KATULA et al. 2007.). A hipometilação global in vivo e in vitro do DNA resultante dessa deficiência de folato leva alterações regulatórias epigenéticas e na regulação da expressão de genes metabólicos específicos (CROTT, et al. 2008). Estudos anteriores relataram que o receptor de folato (FOLR1) se apresentou mais expresso em uma situação de depleção de folato in vitro, enquanto o carreador de folato reduzido (RFC1) é mais expresso no intestino de ratos, enquanto o FOLR1 foi indetectável.. Esse aumento da expressão do.

(25) 25. FOLR1 e RFC1 in vitro e in vivo respectivamente, reflete a abundância das formas disponíveis em um modelo específico e a afinidade de cada proteína à eles. O FOLR1 possui uma maior afinidade pelo ácido fólico do que o RFC1 em cultura de células, entretanto a forma predominante de folato no plasma é o 5metiltetrahidrofolato, pela qual o RFC1 exibe maior afinidade (SHANE, 1995. SAID, et al. 2000). No entanto, estas alterações parecem ser uma resposta adaptativa das células na tentativa de carrear mais folato. Alguns medicamentos como o ácido valpróico (AVP) e metotrexato exercem efeitos regulatórios sobre os genes do metabolismo do folato ( ROY, et. al. 2008., RANGANATHAN, et al.2008). O ácido valpróico ou valproato é uma droga mundialmente utilizada em vários tratamentos médicos incluindo casos de epilepsia e tem sido relatado que ele possui efeito teratogênico sobre o feto durante o período gestacional. Porém um estudo de expressão envolvendo a malformação no fechamento do tubo neural utilizando camundongos (MTHFR +/+ e MTHFR +/-) avaliou a expressão da MTHFR em células do tipo HepG2. Foi observado que o AVP aumentou a expressão de RNAm da MTHFR e também da proteína no grupo de células HepG2 que receberam a injeção do fármaco em relação ao mesmo grupo que foi administrado a solução salina, e também induziu uma baixa teratogenicidade na deficiência da MTHFR. Esse resultado sublinha a importância da interconversão do folato em uma teratogenicidade induzida pelo AVP, uma vez que esse aumenta na expressão da MTHFR e tem baixo potencial teratogênico na deficiência da mesma (ROY et al. 2008). A expressão da enzima MTHFR com atividade catalítica diminuida em conseqüência das mutações e/ou polimorfismos, pode resultar na diminuição dos produtos formados e uma elevação do seu substrato, nesse caso a homocisteína, causando a hiperhomocisteinemia e homocistinúria. A ocorrência destes distúrbios metabólicos tem sido relacionada com o aparecimento de doença coronária oclusiva, neuropatia periférica, retardo mental, assim como defeitos de fechamento do tubo neural e malformações congênitas (MEDINA et al, 2001). O polimorfismo A80G na RFC1 causa a substituição de histidina por arginina na posição 27 da proteína expressa. Altas concentrações de folato sérico foram encontradas em indivíduos com genótipos A80/A80 quando comparados com os indivíduos G80/G80 (CHANGO et al., 2000). Além disso, SHAW et al. (2006) observaram maior risco (4,2 vezes maior) de espinha bífida entre as.

(26) 26. crianças com genótipos G80/G80 cujas mães não fizeram uso de suplementos vitamínicos quando comparadas às crianças com genótipos A80/A80 e filhos de mulheres sem uso de suplementos vitamínicos durante a gravidez (BARBOSA et al., 2008). O polimorfismo genético MTHFR C677T é uma mutação missense que consiste na troca de uma citosina por uma timina na posição 677 no exon 4. Esta mutação causa a substituição de uma alanina por uma valina na região do domínio catalítico da enzima. O resultado desta substituição é uma enzima termolábil que possui atividade catalítica reduzida. Estudos in vitro indicaram que individuos com homozigose para esta mutação apresentam apenas cerca de 30% da atividade da enzima normal, enquanto que os heterozigotos apresentaram 60% da atividade catalítica (ROBIEN et al, 2003). Segundo Rosenberg et al (2002) os indíviduos com genótipo MTHFR 677TT apresentam menores concentrações de folato sérico e maiores concentrações de homocisteína total (tHcy) quando comparados aos indivíduos com genótipo CC (SOZEN et al., 2009; GIL-PRIETO et al., 2009). Um outro polimorfismo associado a MTHFR é o A1298C no exon 7, que resulta na substituição de um glutamato por alanina. Este polimorfismo encontrase no domínio regulatório de ligação da enzima MTHFR com a da Sadenosilmetionina (SAM). A ligação da SAM resulta em uma mudança conformacional da enzima MTHFR que inibe sua atividade enzimática (WEISBERG et al., 1998; ALESSIO et al., 2004, GUERRA-SHINOHARA et al, 2007). Em um estudo realizado, in vitro, com linfócitos de indivíduos com genótipo 1298AC, evidenciou-se que a atividade da enzima MTHFR correspondia a 60% da atividade da enzima nativa, e esta redução na atividade da enzima MTHFR foi também observada em individuos com genótipos heterozigotos para as duas mutações (MTHFR A1298C e MTHFR C677T) (ROBIEN et al, 2003). Outras enzimas, tais como a metionina sintase (MTR) e metionina sintase redutase (MTRR) são muito importantes no metabolismo da homocisteína. A metionina sintase realiza a conversão da homocisteína á metionina em presença de metilcobalamina (coenzima). Já a metionina sintase redutase é responsável pela regeneração da metilcobalamina cofator da MTR (JACQUES et al, 2003)..

(27) 27. Jacques et al (2003) identificaram uma mutação no gene da MTRR que corresponde a substituição de uma adenina por guanina na posição 66. A presença do alelo G resulta numa proteína variante que exibe uma atividade 4X menor comparada a enzima nativa , e foi associada ao aumento no risco de desenvolvimento de defeitos do fechamento do tubo neural. De particular importância é a associação que o genótipo (A66G) da MTRR possui com o genótipo 677 TT da MTHFR, que leva a um relevante aumento no risco de defeitos do fechamento tubo neural (VAUGHN et al, 2004, O’LEARY et al, 2005, WETTERGREN et al., 2010). Jacques et al (2003) analisou o cDNA humano da MTR e demonstrou um polimorfismo onde ocorre a transição de A por G na posição 2756, resultando na substituição de uma glicina por um ácido aspártico. Essa substituição ocorre na região de ligação da enzima, que induz a uma modesta redução de homocisteína (WETTERGREN, et al., 2010) A interação entre o alelo 66GG da MTRR e baixas concentrações de vitamina B12 foi associada a um aumento de cinco vezes no risco de mães terem filhos com espinha bífida, comparadas aquelas mãe que possuíam outros genótipos e concentrações de vitamina B12. O alelo 66G pode diminuir a disponibilidade de SAM por reduzir o nível de atividade da MTR (BARBOSA et al., 2008, WETTERGREN et al., 2010). Os conhecimentos sobre como estão expressos os genes dessa via e como a presença de polimorfismos genéticos podem influenciar essa expressão poderá contribuir para a identificação de indivíduos em risco bem como para a intervenção e diminuição da ocorrência das fendas orais na população..

(28) 28. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL • Realizar estudo de associação da expressão dos genes da via do metabolismo do ácido fólico - MTHFR, MTR, RFC1, MTRR, com a ocorrência das fendas orais.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Avaliar as características clínicas dos indivíduos caso e controles. • Realizar levantamento das exposições ambientais maternas quanto ao tabagismo, etilismo e histórico familiar. • Realizar a análise bioquímica dos indivíduos caso controle, e respectivas mães. • Determinar as concentrações séricas das vitaminas B12 e folato e da homocisteína total plasmática dos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. • Realizar as dosagens de glicose, AST, ALT e creatinina, além do hemograma nos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. • Realizar o estudo de expressão de RNAm dos genes MTHFR, MTR, MTRR, RFC1 nos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. • Avaliar a associação da expressão gênica com os genótipos dos polimorfismos A80G (RFC1); C677T (MTHFR); A1298C (MTHFR); A2756G (MTR), A66G (MTRR) nos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. • Relacionar os dados de expressão desses genes com os marcadores. bioquímicos. e. fatores. ambientais,. e. associação ao risco do desenvolvimento das fendas orais.. avaliar. a.

(29) 29. 3. METODOLOGIA. 3.1 ASPECTOS DO ESTUDO. 3.1 ASPECTOS ÉTICOS E FINANCIAMENTO O estudo foi submetido no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes - UFRN, obedecendo às diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na Resolução do Conselho Nacional de Saúde nº. 196/96 e nº. 340/04, sendo aprovado para realização sob o nº. 458/10 (CAAE - 0032.0.294.000-10), avaliado e cadastrado pela Comissão de Pesquisa do Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra – UFRN, CP-HPHFB-PROJETO Nº 66/2009, para execução dentro da estrutura deste Hospital de Pediatria. Este Projeto foi aprovado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2008/05064-9) sob coordenação do Prof. Tit. Mario Hiroyuki Hirata colaborador do Projeto, através da colaboração entre Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN e a Universidade de São Paulo – USP. É um estudo transversal do tipo Caso-controle pareado visando avaliar a expressão dos genes da via de metabolismo do ácido fólico - MTHFR, MTR, RFC1, MTRR, e a associação da expressão dos mesmos com a ocorrência das fendas orais.. 3.2 CASUÍTICA E COLETA Para a realização deste projeto foram estudados 200 indivíduos, divididos em dois grupos, casos e controles. O grupo controle foi composto de 50 crianças sadias e pareados por faixa etária e suas respectivas mães (n=50). O grupo caso foi composto por 50 crianças com fenda orais com diagnóstico baseado em critérios clínicos e suas respectivas mães (n=50). Os casos foram atendidos e triados pelo Programa de Atendimento aos Fissurados do Hospital de Pediatria (HOSPED) - UFRN. A cada mãe caso e mãe controle foi explicado o objetivo desse estudo e solicitado que na concordância em participar assinassem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A). Os dados das mães e seus filhos foram obtidos e registrados através de um questionário (Apêndice C). Em seguida Foi realizada uma coleta a vácuo em que foi colhido um total de 14 mL de.

(30) 30. sangue, divididos em um tubo sem anticoagulante de 10 ml para as dosagens bioquímicas no soro e plasma e um tubo de 4 ml com EDTA para extração do RNA total. A coleta foi realizada após jejum mínimo de 4 horas, de todos os casos e controles para realização das dosagens bioquimicas, hematologica e extração do RNA total. A análise dos polimorfismos foi realizada com base no banco de dados de genotipagem do estudo previamente realizado por nosso grupo desenvolvido por Bezerra, J.F. (2010).. Critérios de Inclusão: - Individuos com fendas orais não-sindrômicas - Individuos com idade a partir de 2 anos. - Dosagens de AST e ALT dentro dos valores de referência (10 – 37U/L) - Dosagem de Creatinina dentro dos valores de referência (0,4 – 1,4mg/dL). Critérios de Não-inclusão: - Criança com fenda oral sindrômica - Criança com idade inferior a 2 anos - Dosagens de AST, ALT e Creatinina fora dos valores de referência - Parentesco com crianças já incluídas no estudo - Indivíduos acometidos de outros tipos de doença. 3.3 DETERMINAÇÕES. DOS. PARÂMETROS. BIOQUÍMICOS. E. HEMATOLÓGICOS. As concentrações séricas de glicose e creatinina foram determinadas utilizando o kit Biosystems® (Reagents & Instruments, Barcelona, Espanha) seguindo as orientações do fabricante. A atividade sérica das enzimas Aspartato aminotransferase (AST), Alanina aminotransferase (ALT) foi determinada utilizando os Kits Labtest (Minas Gerais, Brasil) seguindo as instruções do fabricante. Todas as medidas foram realizadas em triplicata, através do espectrofotômetro RA-50 (Bayer, Irlanda, 1998). A determinação de Homocisteína foi realizada utilizando 15µL de plasma por imunoensaio competitivo quimioluminescente. A determinação da Vitamina.

(31) 31. B12 e do ácido fólico foi realizada utilizando 250µL de soro por imunoensaio quimioluminescente polarizado. Estas dosagens foram realizadas utilizando kits Siemens (Los Angeles, CA, USA) no equipamento IMMULITE 1000 (Los Angeles, EUA). O hemograma foi realizado a partir de sangue total, onde foram avaliados a contagem de hemácias, determinação de hemoglobina, hematócrito, índice hematimétricos (V.C.M., H.C.M., C.H.C.M.), contagem de plaquetas e contagem global de leucócitos. Essas determinações foram realizadas em aparelho automatizado ABX micros 60 (ABX Diagnostics, França, 2004).. 3.4 ESTUDO DE EXPRESSAO GÊNICA. 3.4.1 Extração do RNA Total. O RNA total foi obtido a partir de células do sangue periférico (LTSP), colhido com EDTA utilizando o kit de extração QiaAmp RNA Blood Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Alemanha) imediatamente após a colheita do sangue. O RNA obtido foi armazenado no freezer - 80C até a sua análise. O RNA total extraído foi quantificado e teve seu grau de pureza avaliado através de espectrofotometria no ultravioleta utilizando espectrofotômetro ND-1000 (NANODROP,technologies Inc, Wilmington, DE, EUA), através das deteminações das absorbancias A260nm e A260/A280nm respectivamente (SAMBROOK et al, 2001).. 3.4.2 Análise da Integridade do RNA total. A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 2,0% em tampão MOPS [MOPS a 20 mmoles/L (pH 7,0), acetato de sódio a 8 mmoles/L e EDTA 1mmol/L pH8,0], em seguida corado e revelado sob a luz ultravioleta e fotodocumentados em sistema de captura de imagens Gel Logic 100 Imaging System (Carestream Health Inc. Rochester, NY, EUA) utilizando o software Molecular Imaging Kodak 4.5. Na imagem (Figura 3), observam-se as bandas dos RNAs ribossomais 28S e 18S. A presença dessas bandas com boa nitidez evidencia uma amostra com RNAribossomal não degradado..

(32) 32. A. B. FIGURA 3: Gel de Integridade de RNAs ribossomais desnaturante de agarose a 2% corado com GelRed e fotodocumentado com transiluminador de ultravioleta – UV. No gel foram aplicadas as amostras dos individuos participantes desse estudo, A- casos e B- controles.. Durante o processamento das análises que antepõem-se ao ensaio de expressão gênica as amostras de RNA de 10 duplas mãe/filho do grupo caso e 10 duplas mãe/filho controles precisaram ser excluídos desse estudo devido baixa qualidade do RNA total demonstrado pela análise de integridade em gel de MOPS a 1% que revelou que esses amostras apresentavam-se degradadas (Figura 4). Desse modo, foram avaliados o RNAm de 160 indivíduos ao total. Foram realizadas as análises de expressão gênica de RNAm de 80 indivíduos para o grupo caso, onde são 40 mães de filhos com fenda oral e seus respectivos filhos (40) e 80 indivíduos para o grupo controle, sendo 40 mães de indivíduos saudáveis sem doenças sindrômicas e seus filhos (40).. A. B. FIGURA 4: Gel de Integridade de RNAs ribossomais desnaturante de agarose a 1% corado com GelRed e fotodocumentado com transiluminador de ultravioleta – UV. No gel foram aplicadas as amostras dos individuos participantes desse estudo, na foto do gel observam-se amostras de indivíduos caso (A) e controles (B) apresentando RNA total com perfil de degradação.. 3.4.3 Síntese do cDNA A síntese do cDNA foi realizada a partir de 300ng do RNA total utilizando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA), de acordo com a metologia descrita pelo fabricante em.

(33) 33. termociclador MyCiclerTM Thermal Cycler (BIORAD, Philadelphia, PA, USA). O cDNA obtido em volume final de 60µL foi armazenado a –20°C sendo utilizado nos ensaios de expressão por RT-qPCR.. 3.4.4 Escolha do gene de referência A escolha do gene de referência a ser utilizado no estudo de expressão gênica do presente projeto foi realizada através da avaliação dos genes GAPDH, 18S, Ubiquitina C, β-Actina. As amostras de cDNA dos casos e seus respectivos controles, e ainda as amostras de cDNA das mães caso e mães controles foram estudados para os 4 genes de referência e os resultados obtidos através de RT-qPCR no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA) estão mostrados nas Figuras 5 e 6, respectivamente.. FIGURA 5: Curvas de amplificação dos genes de referência utilizando amostras de cDNA dos filhos fissurados e seus respectivos controles. Verde (18S); Roxo (β-Actina); Vermelho (GAPDH); Azul (Ubiquitina C). qPCR realizada no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA)..

(34) 34. FIGURA 6: Curvas de amplificação dos genes de referência utilizando amostras de cDNA das mães dos caso e mães controles. Verde (18S); Roxo (β-Actina); Vermelho (GAPDH); Azul (Ubiquitina C).RT-qPCR realizada no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA).. 3.4.4.1 Análise dos dados de amplificação e definição do gene de referência. Os resultados obtidos a partir da RT-qPCR foram aplicados nos softwares GeNorm e Normfinder. Os dados dos ciclos de threshold (Ct) de cada amostra foram aplicados na equação 2-ct assumindo a eficiência como sendo 100%, uma vez que a eficiência dos ensaios tiveram índices entre 96% a 98% (Tabela 3). Tanto o geNorm (Figura 7) quanto o NormFinder (Tabelas 1 e 2) elegeram o gene da β-Actina como gene de referência uma vez que esse gene apresentou o menor nível de variação entre os Ct’s. Em vermelho está o gene da Ubiquitina C (UBC) que apresentou a maior variação..

(35) 35. FIGURA 7: Imagem da análise do gene de referência através do software geNorm na placa referente aos filhos caso e filhos controles destacando o gene da β-Actina (verde, menor variação) e o gene da UBC (vermelho, maior variação).. A Tabela 1 contém os dados gerados pelo software Normfinder (MDL, Aarhus, Denmark) indicando o gene da β-Actina como o gene escolhido para a realização desse estudo no grupo dos filhos (casos e controles) por possuir menor valor de variação e consequente maior estabilidade, quanto maior esse valor maís instável é o gene. Podemos observar também que pelo valor numérico da estabilidade, o gene da UBC é o menos indicado devida a alta variação entre os valores de CT’s.. Tabela 1. Análise dos valores de CT dos filhos realizada pelo Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência.. Gene GAPDH GAPDH 18S 18S UBC UBC B-Actina B-Actina Gene de Escolha. Valor da estabilidade 1,417 1,229 3,169 3,171 2,326 2,392 0,183 0,183 B-Actina.

(36) 36. A Tabela 2 apresenta os dados gerados pelo software Normfinder (MDL, Aarhus, Denmark) indicando o gene da β-Actina como o melhor gene para a realização desse estudo no grupo das mães (casos e controles) por possuir menor valor de variação e consequente marior estabilidade. Podemos observar também que pelo valor numérico da estabilidade o gene da UBC é o menos indicado devida a alta variação entre os valores de CT’s.. Tabela 2. Análise dos valores de CT das mães realizada pelo Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência ideal.. Gene GAPDH GAPDH 18S 18S UBC UBC B-Actina B-Actina Gene de Escolha. Valor de estabilidade 0,604 0,653 0,882 0,917 1,363 1,362 0,370 0,374 B-Actina. 3.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA PELA qPCR. Os cDNAs dos genes da MTHFR (número genbank de acesso NM_005957), MTR (número genbank de acesso NM_000254), RFC-1 (número genbank. de. acesso. NM_14255),. MTRR. (número. genbank. de. acesso. NM_002454.2 ), foram amplificados pela qPCR, no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). Para a amplificação pela qPCR dos genes em estudo e do gene de referência foram utilizados ensaios prédesenhados e pré-formulados de expressão gênica TaqMan padronizados pela Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA). A Tabela 3 apresenta os ensaios padronizados utilizados para análise da expressão dos genes MTHFR, MTR, MTRR, e RFC1. A quantidade de 300ng de cDNA utilizada nos ensaios foi otimizada a partir de uma curva padrão sendo realizada com diferentes concentrações de amostra cDNA. A curva padrão permite avaliar a linearidade da amplificação bem como a.

(37) 37. eficiência da mesma. Segundo Livak e Schmittgen (2001) para uma reação de PCR em tempo real ter eficiência de 100% a inclinação (slope) da curva padrão deve ser próximo de -3,3 a eficiência de cada ensaio foi considerada adequada para valores acima de 90%. As reações foram realizadas em triplicatas sendo aplicado 2µL de cDNA equivalentes a 10ng de RNAm por poço da placa de RTqPCR. Para calcular a expressão absoluta obtida por ensaio, os valores de Ct’s foram aplicados na fórmula 2-ΔCt, os resultados dessa equação serviram como dados para aplicação do teste-t. Para normalização dos dados em relação ao gene de referência, os valores de Delta Ct de cada amostra foram comparados com a média do Delta Ct basal (calibrador), sendo essa relação denominada Delta-Delta Ct (ΔΔCt). Os dados de ΔΔCt foram linearizados pela fórmula 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHIMITTGEN, 2001) para comparar os dados de expressão relativa entre os grupos. Foi aplicado o teste estatístico nos valores obtidos após essa transformação.. Tabela 3. Ensaios de expressão gênica TaqMan padronizados pela Applied Biosystems (Foster city, CA, EUA) e resultados da eficiência dos ensaios com nossas amostras. Inclinação (Slope). Eficiência (%). R2. MTHFR. -3,20. 96. 0,964. Hs00165188_m1. MTR. -3,38. 98. 0,986. Hs00985018_m1. MTRR. -3,40. 98. 0,979. Hs01099140_m1. RFC1. -3,29. 97. 0,969. Assay. Gene. Hs01114484_m1. 3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA. Foi elaborado um banco de dados para devidas correlações e tabulação das variáveis, utilizando o programa Microsoft Excel para Windows versão 7.0. Foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov, a fim de avaliar a distribuição dos dados. Para variáveis com distribuições normais, foi utilizado o teste-t não pareado. Para avaliar a correlação entre a expressão dos genes e análises bioquímicas foi utilizado a correlação de Pearson, sendo também realizadas as análises de regressão linear univariada e regressão logística univariada. Para.

(38) 38. todas estas análises foi utilizado o programa SPSS 15.01® (Lead Technologies, NC, USA e estabelecido o nível de significância de p<0,05.. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA. A casuística foi constituída de 50 indivíduos com fendas orais e suas mães, além de 50 indivíduos controles e suas respectivas mães. A Figura 8 mostra que a maioria dos filhos caso apresenta a fenda do tipo labiopalatina (56%), seguida da fenda palatina isolada (24%) e da fenda labial (20%). Em relação ao gênero, 62% dos filhos caso são do gênero masculino e 38% do gênero feminino, como mostrado na Figura 9. Quando subdividimos o tipo de fenda de acordo com o gênero constatou-se uma prevalência do gênero masculino nas fendas do tipo labiopalatina (69%) e labial (69,2%) e no caso das fendas palatinas isoladas houve uma predominância do gênero feminino (59%) (Figura 10).. FIGURA 8. Distribuição dos filhos casos analisados de acordo com o tipo de fenda.

(39) 39. FIGURA 9. Distribuição dos filhos casos analisados de acordo com o gênero.. FIGURA 10. Distribuição dos filhos caso analisados de acordo com o tipo de fenda subdivididos em função do gênero.. Esses resultados estão de acordo com Freitas-Silva e colaboradores, (2008) que encontraram resultados semelhantes em um estudo realizado no Estado de São Paulo com pacientes atendidos no Centro de Reabilitação das Deformidades Faciais de SP onde 62% desses apresentaram fenda lábiopalatina, seguida da fenda palatina isolada (20%) e por último a fenda labial (9%). Estudo realizado por Takano e colaboradores (2008) com pacientes do Centro de Atenção aos Defeitos da Face (CADEFI) do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP) de Recife – PE, também foi observada uma maior prevalência das fendas labiopalatinas (48,6%) seguida da fenda palatina isolada (24,6%). Concordam ainda com Jamillian e colaboradores (2007) que observaram.