Estudo in vitro em bactérias crescidas em substratos planos de InP:

Inicialmente foram feitas medidas controles (sem tratamento com NAC), onde foi selecionada uma região na amostra e foram feitos Z-stacks em alguns biofilmes presentes nessa região. Após fazer o Z-stack, foram selecionados alguns planos focais (na base, no meio e no topo do biofilme) e foram adquiridos vídeos (time series) em cada plano focal, com o objetivo de analisar a evolução temporal do biofilme e o que ocorre, após a adição de NAC, em cada plano focal. Após as medidas controles, a lamínula de vidro que cobre a célula de teflon foi removida e a solução foi removida lentamente, deixando apenas uma pequena quantidade para a amostra não secar. Em seguida foi adicionada uma solução de PW contendo NAC na concentração de 2 mg/ml. As medidas foram realizadas na mesma região observada no caso controle. Após um período de aproximadamente 2h de medidas, o processo foi repetido com NAC na concentração de 10 mg/ml.

Foram feitas marcas nos substratos que serviram como referência para voltar para a mesma região da amostra após a troca de soluções. As marcas foram feitas pelo engenheiro do LNB Hélio Obata, utilizando uma ponta de carbeto de Si. As Figuras

4.12e4.13 apresentam regiões analisadas para as amostra com 12h e 36h de crescimento, respectivamente. Foram adquiridas imagens no modo reflexão, para localizar a referência,

Figura 4.12: Imagens da região analisada para a amostra com 12h de crescimento. (a) a (c): imagens obtidas no modo reflexão para localizar a região na amostra; (d)-(f) imagens de fluorescência nas regiões correspondentes.

De forma qualitativa, observa-se que no caso da amostra com 12h de cres- cimento (Figura 4.12), os biofilmes presentes na imagem controle saíram após a adição de NAC 2mg/ml, deixando apenas partes pequenas destes biofilmes ainda aderidas na superfície. Com o aumento da concentração de NAC para 10 mg/ml, observa-se que res- taram apenas poucas células aderidas na superfície, nas regiões onde haviam biofilmes, e também em regiões ao redor, sugerindo que estas podem ter sido liberadas dos biofilmes e posteriormente podem ter aderido à superfície. Esses efeitos não ocorrem de forma uniforme em toda a amostra; há outras regiões em que, após o aumento da concentração de NAC, ainda há presença de biofilmes e clusters, porém estes são menores e apresentam uma menor densidade espacial em relação ao controle, como foi observado nas medidas de AFM apresentadas na seção anterior.

Na amostra com 36h de crescimento (Figura 4.13), há biofilmes maiores em relação à amostra com 12h. Após a adição de NAC 2 mg/ml, os biofilmes ficaram menores e menos densos em relação ao caso controle e, após o aumento da concentração de NAC para 10 mg/ml, notamos que os biofilmes saíram da superfície, restando apenas clusters

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Figura 4.13: Imagens da região analisada para a amostra com 36h de crescimento. (a) a (c): imagens obtidas no modo reflexão para localizar a região na amostra; (d)-(f) imagens de fluorescência nas regiões correspondentes.

e células individuais. De forma qualitativa, os efeitos foram similares aos da amostra com 12h de crescimento, porém no caso com 12h a concentração de NAC 2 mg/ml foi suficiente para liberar a a maior parte dos biofilmes da superfície, já no caso com 36h o tamanho dos biofilmes foi reduzido com esta mesma concentração, o que ocorre provavelmente devido à maior quantidade de EPS.

A Figura 4.14 a seguir mostra renderizações 3D típicas de alguns biofilmes encontrados na região analisada da amostra com 36h, e os planos focais na base, no meio e no topo dos biofilmes, usados nas aquisições de vídeos. Nas imagens é indicada a altura a partir da base em que foram adquiridas; mostrando que há uma diminuição na altura dos biofilmes com o aumento da concentração de NAC. As setas brancas na Figura 4.14 indicam células aderidas pelo polo que giram em torno do ponto de adesão. Este movimento ocorre tanto em células aderidas na superfície (na base do biofilme ou em regiões ao redor) quanto em células aderidas na matriz dos biofilmes (planos do meio e do topo dos biofilmes).

A Figura4.15 apresenta renderizações 3D para um mesmo biofilme geradas a partir de Z stacks obtidos em diferentes instantes após a adição de NAC 2 mg/ml. Na Figura 4.15, as imagens foram adquiridas 1h 10 min após a adição de NAC e, na Figura

Figura 4.14: Top view da renderização 3D e slices na base, no meio e no topo de biofilmes e clusters típicos para a amostra com 36h de crescimento antes e após a adição de NAC nas concentrações 2 mg/ml e 10 mg/ml. As imagens são frames representativos de vídeos adquiridos na base, no meio e no topo de cada Z stack. As setas brancas indicam células presas pelo polo que giram em torno de um eixo que passa pelo ponto de adesão. Em cada slice também é indicada a altura em que foi adquirido em relação à base. Nota-se que a altura dos biofilmes (ou clusters) diminui com o aumento da concentração de NAC.

4.15 (b), 1h 30 min após a adição de NAC. Observa-se que em (b) a densidade espacial do biofilme diminuiu, indicando que partes do biofilme se soltaram da matriz, enquanto as células da base permaneceram aderidas, mantendo o biofilme ancorado na superfície. Esse resultado, juntamente com os resultados observados com o AFM, indicam que o NAC pode degradar tipos específico de EPS, ao se difundir pela matriz do biofilme, e, quando destrói o EPS que mantém as células que ancoram o biofilme na superfície, este é liberado.

Um outro efeito observado é que, em alguns casos, as bactérias que estão ade- ridas pelo polo e giram em torno de um eixo que passa pelo ponto de adesão apresentam maior mobilidade nas medidas realizadas na presença de NAC e, eventualmente, estas bactérias soltam da superfície. Para comparar a mobilidade das células com e sem a

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Figura 4.15: Renderizações 3D obtidas para um mesmo biofilme na amostra com 36h de crescimento, após a adição de NAC 2 mg/ml. As imagens foram adquiridas: (a) 1h 10 min e (b) 1h 30 min após a adição de NAC.

presença de NAC, foram analisadas regiões em que as bactérias que apresentam esse tipo de movimento estão aderidas na superfície perto de clusters ou biofilmes. Este movi- mento não está restrito ao plano focal em que a medida foi realizada; as células "horizon- tais"realizam oscilações pequenas em torno de um eixo que passa pelo ponto de adesão e mudam de direção até completarem uma volta completa, em alguns casos. Além disso, em determinados frames dos vídeos adquiridos, elas podem apresentar configuração "ver- tical", sendo observado no vídeo apenas o polo que está fixo à superfície. Após a adição de NAC, algumas destas células começam a girar mais rápido e eventualmente soltam da superfície. Para analisar se há efeito do NAC na mobilidade destas células foi feito um rastreamento(tracking), usando o plugin Manual Tracking do software FIJI Image J. Foi selecionado em cada frame do vídeo um ponto na célula usado para o tracking. Para comparar a mobilidade de diferentes células e, portanto, diferentes comprimentos, o ponto usado no tracking foi selecionado no corpo da bactéria à 1, 5𝜇𝑚 do polo que está aderido à superfície e foram analisados apenas frames do vídeo em que o corpo da célula aparece no plano focal observado. O intervalo de tempo entre cada frame foi 𝑡 = 0, 97𝑠; assim, com as medidas de deslocamento do ponto usado no tracking, obtém-se a velocidade em função do tempo.

Há na mesma amostra células que giram com diferentes velocidades, assim os resultados apresentados correspondem a casos representativos, tanto no controle quanto na medida com NAC. Nas medidas controles, por exemplo, as bactérias 1 e 2 apresentaram valores significativamente mais altos que a bactéria 3. A Figura 4.16(c) mostra a distribuição estatística das velocidades apresentadas em (a) e (b). As bactérias 1 e 2 nas medidas com NAC não apresentaram aumento significativo na velocidade durante o tempo de obser- vação, com valores similares aos da bactéria 3 do controle, mas menores em relação às bactérias 1 e 2 do controle. Já a bactéria 3 nas medidas com NAC apresentou valores de velocidade mais altos e significativamente diferentes do caso controle e das bactérias 1 e 2. A Figura4.16 (d) apresenta a trajetória obtida no tracking (indicada pela linha azul) para as bactérias medidas em cada caso.

Nas medidas com NAC 10 mg/ml, a bactéria 3 foi analisada através de vários vídeos adquiridos durante 30 min, de forma que o primeiro vídeo foi adquirido 50 min após a adição de NAC. Esta bactéria estava aderida na superfície próxima à um biofilme. O gráfico da Figura4.17(a) mostra a evolução temporal (durante os 30 min de observação) da velocidade da bactéria 3. Observa-se 3 comportamentos distintos, o primeiro, no início da medida, onde as velocidades apresentadas são baixas, o segundo, onde a velocidade aumenta significativamente e o terceiro, onde a velocidade diminui até que a célula adere ao biofilme. A Figura4.17(b) apresenta frames de vídeos correspondentes às 3 regiões do gráfico. A linha azul representa a trajetória obtida no tracking, onde é possível notar que na região II, onde ocorre aumento da velocidade, a célula gira, completando voltas em torno do ponto de adesão. Este resultado sugere que o aumento da velocidade ocorre por conta da ação do NAC ao diminuir gradativamente o EPS que mantém a célula aderida à superfície. Porém neste caso a célula aderiu ao biofilme e não foi liberada da superfície. Os resultados das bactérias 1 e 2 foram adquiridos 1h 20 min após a adição de NAC, mas neste caso não foi possível acompanhar a evolução temporal da mobilidade das células. No entanto, foi observado que após ≈ 2h 30 min, estas células soltaram da

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Figura 4.16: (a) e (b): Velocidade em função do tempo de 3 bactérias aderidas pelo polo nas medidas antes (controle) e após a adição de NAC 10 mg/ml, respectivamente, para a amostra com 12h de crescimento. Foram analisados 𝑛 = 100 frames para 3 células diferentes em cada caso. (c) Box plot mostrando a distribuição estatística dos valores apresentados em (a) e (b). Foi feita uma análise estatística one-way ANOVA com o teste Tukey post-hoc para comparação de médias. Os asteriscos (***) indicam valor de

𝑝 <0, 001 e (****) indicam p < 0, 0001. O n.s. (indicando que não há diferença estatística

significativa) e os asteriscos (***) nas distribuições das bactérias 2 e 3 com NAC se referem a resultados da comparação com cada um dos outros grupos. (d) Frames obtidos no final do vídeo para as 3 bactérias analisadas em cada caso. A linha azul indica a trajetória obtida no tracking e as setas brancas indicam o polo da bactéria que está aderido à superfície.

superfície. A Figura 4.18 apresenta frames de vídeos adquiridos em diferentes instantes após a adição de NAC. As bactérias estão indicadas como "1"e "2". A bactéria "1"apresenta um polo fixo na superfície e o o outro polo está ligado a uma outra bactéria. As setas brancas nas Figuras4.18 (b) e (c) indicam células que não estão aderidas à superfície e a seta azul na Figura4.18(c) indica uma célula que aderiu posteriormente à superfície. Esses resultados sugerem que o NAC degrada o EPS que mantém as células ligadas à superfície, liberando-as, mas não apresenta necessariamente efeito na interação célula-célula, a qual

Figura 4.17: (a) Velocidade em função do tempo para a "bactéria 3"apresentada nas medidas com NAC 10 mg/ml na Figura 4.16. Os dados foram obtidos a partir de vídeos adquiridos durante 30 min, sendo que o primeiro vídeo (t=0) foi adquirido 50 min após a adição de NAC. (b) Frames de vídeos correspondentes às 3 regiões do gráfico. A trajetória obtida no tracking é indicada pela linha azul. As setas brancas indicam o polo da bactéria que está fixo na superfície.

é mediada também por adesinas fimbriais e afimbriais. Além disso, o resultado também mostra que é possível haver adesão de células na superfície, mesmo após a adição de NAC.

Figura 4.18: Imagens representativas de vídeos adquiridos em diferentes instantes após a adição de NAC 10 mg/ml para as bactérias 1 e 2 apresentadas na Figura4.16. As setas brancas indicam células que não estão aderidas à superfície, e a seta azul indica uma célula que aderiu posteriormente. Nota-se que a bactéria 1, que está aderida pelo polo a uma outra bactéria, soltou da superfície, mas a interação célula-célula foi mantida.

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Figura 4.19: ((a) e (b): Velocidade em função do tempo de 3 bactérias aderidas pelo polo nas medidas antes (controle) e após a adição de NAC 10 mg/ml, respectivamente, para a amostra com 36h de crescimento. Foram analisados 𝑛 = 100 frames para 3 células diferentes em cada caso. (c) Box plot mostrando a distribuição estatística dos valores apresentados em (a) e (b). Foi feita uma análise estatística one-way ANOVA com o teste Tukey post-hoc para comparação de médias. Os asteriscos **** indicam níveis de significância 𝑝 < 0, 0001.(d) Frames obtidos no final do vídeo para as 3 bactérias analisadas em cada caso. A linha azul indica a trajetória obtida no tracking e as setas brancas indicam o polo da bactéria que está aderido à superfície.

Uma análise similar também foi feita para a amostra com 36h de crescimento. A Figura 4.19 apresenta as velocidades obtidas para 3 bactérias, em diferentes regiões da amostra, antes e após a adição de NAC 10 mg/ml. De modo similar às análises apresentadas na Figura4.16 (para o caso com 12h de crescimento), as bactérias indicadas como "bactéria 1", "bactéria 2"e "bactéria 3"não são as mesmas células observadas antes e após a adição de NAC; no entanto são células representativas para cada caso. Os gráficos da velocidade em função do tempo para a medida controle e para a medida com NAC são apresentados nas Figuras4.19 (a) e (b), respectivamente. A Figura 4.19 (c) apresenta a distribuição estatística para as velocidades apresentadas em (a) e (b). A Figura4.19 (d)

são relativamente maiores, e a trajetória indicada pelo tracking mostra que essa célula apresenta mais mobilidade.

No gráfico da Figura 4.19(b), nota-se que a velocidade da bactéria 3 é menor no início do vídeo e aumenta, até que a célula solta da superfície, o que sugere que o efeito do NAC na liberação de células está relacionado a um aumento na mobilidade da célula e posterior liberação da superfície. Assim como foi observado para a bactéria 3 na amostra com 12h de crescimento, aqui o aumento da mobilidade pode ocorrer pelo fato de que o NAC está destruindo o EPS entre as células e a superfície, deixando-as mais livres. Comparando os dados da amostra controle (sem NAC) nas Figuras 4.16 e 4.19, nota-se também que as velocidades com 12h são maiores que as velocidades com 36h, reforçando o fato que um maior volume de EPS "prende"o movimento da célula.

O movimento da X. fastidiosa está associado aos pili tipo IV que contém pon- tes dissulfídicas que podem ser afetadas pelo NAC, porém não há trabalhos na literatura que apontem efeitos do NAC nos pili da X. fastidiosa. Para verificar se o aumento da mobilidade observado neste trabalho, para as células que estão presas por um dos polos à superfície, pode estar associado a algum efeito do NAC nos pili, foram analisadas as velocidades de algumas células livres (que estão se movendo próximas à superfície). A análise foi feita usando o plugin Track Mate do Fiji Image J. As velocidades foram cal- culadas para 4 células diferentes em cada caso para a amostra com 12h de crescimento. Os resultados mostraram que não há variação significativa entre os valores obtidos para o controle e a medida com NAC. Dessa forma atribuímos, a princípio, o aumento da mo- bilidade das células presas pelo polo à destruição do EPS, deixando as células mais livres e não a algum efeito nos pili.

Por fim, os principais resultados obtidos com o estudo in vitro em substratos planos de InP indicam que os biofilmes apresentaram uma densidade espacial menor com o aumento da concentração de NAC e eventualmente saíram da superfície, deixando células individuais e pequenos clusters aderidos. Este efeito foi mais pronunciado nas amostras

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Figura 4.20: (a) Box plot apresentando a distribuição estatística dos valores de velocidade obtidos para 4 células livres nas medidas controle e com NAC 10 mg/ml, para a amostra com 12h de crescimento. Foram analisados n= 80 frames em cada caso. A análise one-way ANOVA com o teste Tukey post-hoc mostrou que não há variação significativa entre os grupos.

com 12h de crescimento em relação às amostras com 36h de crescimento, o que é esperado já que os biofilmes nas amostras com 12h de crescimento apresentam menos EPS e são, portanto, mais fáceis de serem removidos da superfície. Por outro lado, as medidas de fluorescência realizadas em amostras secas, que foram apresentadas na seção anterior, mostram que há mais EPS presente na superfície nas amostras com 12h de crescimento em relação às amostras com 36h. Isto indica que nas amostras com 12h de crescimento o NAC pode estar atuando no EPS que liga as células da base do biofilme à superfície, liberando-os e deixando EPS residual na superfície. Nas renderizações 3D feitas ao longo do tempo para um mesmo biofilme na amostra com 36h de crescimento, após a adição de NAC 2 mg/ml), partes do biofilme saíram enquanto as células da base permaneceram na superfície, mantendo a estrutura que sobrou do biofilme ancorada. As células individuais soltam da superfície após exibirem aumento na velocidade de movimento. Este aumento pode estar associado à destruição, pela ação do NAC, do EPS que mantém as células ligadas à superfície, deixando-as mais livres para se moverem. Não observamos diferença significativa na mobilidade das células livres com e sem a presença de NAC, indicando que o aumento de velocidade observado antes das células soltarem da superfície ocorreu mais provavelmente por uma diminuição da quantidade de EPS e não por efeitos biológicos que levassem ao aumento da mobilidade. Além disso, o NAC afeta o EPS que liga as bactérias à superfície, mas não afeta necessariamente a interação célula-célula, visto que

lulas individuais aderidas em nanofios de InP. Estes foram usados como sensores de força para quantificar a força de adesão bacteriana antes e após a adição de NAC, seguindo o método discutido no capítulo anterior. Aqui, os nanofios utilizados foram crescidos por epitaxia seletiva (SAE, do inglês Selective Area Epitaxy), assim não apresentam nanopar- tícula de Au no topo dos nanofios. O diâmetro é de 200 nm e o comprimento ≈ 3000 nm, com constante elástica 𝑘 = 0, 64 N/m. Este valor foi calculado de acordo com o a equação (3.1.1) com 𝐸 = 106, 4 GPa para o InP (111) [159], como foi indicado no capítulo 3.

A preparação das amostras foi similar à utilizada no estudo in vitro sobre substratos planos de InP: as bactérias foram crescidas sobre os arrays de nanofios inseridos em uma célula líquida de Teflon e cobertas com uma lamínula de 0,16 mm de espessura, para viabilizar as medidas em meio líquido no microscópio confocal. Após o tempo de crescimento (utilizamos aqui amostras com 12h e 36h de crescimento), a amostra foi levada ao CLSM e foram feitas medidas controles (sem adição de NAC) em algumas regiões da amostra. Em seguida, o meio líquido foi retirado lentamente, deixando apenas uma pequena quantidade sobre a superfície, e foi adicionada solução com NAC. Em alguns casos foi possível medir a mesma região da amostra que foi analisada na medida controle; identificamos no texto explicitamente os casos em que isso ocorreu. Após a adição de NAC foram feitas medidas por aproximadamente duas horas para cada concentração, que foram variadas entre 2 𝑚𝑔/𝑚𝑙 e 20 𝑚𝑔/𝑚𝑙. É importante mencionar que o crescimento da Xylella

fastidiosa é relativamente lento (cerca de 10 h para ocorrer divisão celular), então não

esperamos alterações significativas em relação ao crescimento bacteriano durante o tempo total das medidas (entre 8 e 10h). A Figura 4.21 apresenta uma ilustração esquemática das etapas de preparação e da adição da solução contendo NAC.

Vale ressaltar que foi utilizada a mesma taxa de varredura no microscópio confocal para todas as medidas de força apresentadas nesta seção. A taxa de varredura utilizada foi 0,2 MHz, pois, como foi discutido no capítulo anterior, nesta frequência é possível minimizar as medidas de deflexões provenientes das oscilações térmicas dos na-

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Figura 4.21: Ilustração esquemática das etapas para medidas de forças no CLSM: inicial- mente as bactérias são cultivadas sobre os nanofios de InP; após o tempo de crescimento (12h ou 36h) são realizadas as medidas controles (sem adição de NAC); em seguida, a solução é removida, deixando uma pequena quantidade do meio líquido para não secar a amostra e é adicionada a solução contendo NAC; em seguida são realizadas medidas de forças. Para o aumento da concentração de NAC, o mesmo procedimento de troca de soluções é realizado.

nofios. Embora a calibração apresentada no capítulo anterior tenha sido realizada com

arrays de nanofios possuindo geometria diferente (90 nm de diâmetro e 1500 nm de com-

primento) em relação aos nanofios utilizados nesta seção, e, portanto, constante elástica diferente (0,2 N/m), as medidas realizadas com os nanofios controles (sem bactérias ade- ridas) apresentaram deflexões < 10 nm para as duas geometrias, ou seja os níveis de ruído das medidas de força não variam significativamente para as duas geometrias de nanofios. Assim, estendemos as conclusões obtidas no capítulo anterior para os arrays de nanofios