Aldeliane Maria da Silva
Aplicações de nanofios semicondutores para a
investigação do efeito da N-acetilcisteína na
bactéria Xylella fastidiosa
CAMPINAS 2020
Aldeliane Maria da Silva
Aplicações de nanofios semicondutores para a
investigação do efeito da N-acetilcisteína na
bactéria Xylella fastidiosa
Tese apresentada ao Instituto de Física Gleb Wataghin da Universidade Estadual de Cam-pinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, na área de Física Aplicada.
Orientadora: Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Aldeliane Ma-ria da Silva, e orientada pela Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta.
Campinas 2020
SilOrientador: Mônica Alonso Cotta.
SilTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin.
Sil1. Nanofios. 2. Sensor. 3. Adesão. 4. Xylella fastidiosa. 5. N-acetilcisteína. I. Cotta, Mônica Alonso, 1963-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Física Gleb Wataghin. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Semiconductor nanowire application to the investigation of N-acetylcysteine effect on Xylella fastidiosa bacterium
Palavras-chave em inglês: Nanowires Sensor Adhesion Xylella fastidiosa N-acetylcysteine
Área de concentração: Física Aplicada Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Mônica Alonso Cotta [Orientador] Jean Rinkel
Hernandes Faustino de Carvalho Francisco Eduardo Gontijo Guimarães Gabriela Lorite Yrjänä
Data de defesa: 30-04-2020
Programa de Pós-Graduação: Física
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-1282-482X - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/2267463895049573
MEMBROS DA COMISSÃO JULGADORA DA TESE DE DOUTORADO DE ALDELIANE MARIA DA SILVA – RA 153904 APRESENTADA E
APROVADA AO INSTITUTO DE FÍSICA “GLEB WATAGHIN”, DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, EM 30 / 04 / 2020.
COMISSÃO JULGADORA:
- Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta – Orientadora – DFA/IFGW/UNICAMP - Prof. Dr. Jean Rinkel – DFA/IFGW/UNICAMP
- Prof. Dr. Hernandes Faustino de Carvalho – IB/UNICAMP - Prof. Dr. Francisco Eduardo Gontijo Guimarães - IFSC/USP - Profa. Dra. Gabriela Lorite Yrjänä (UPM/FTIEE/Universidade de Oulu
OBS.: Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
CAMPINAS 2020
Agradecimentos
Agradeço a Deus por todas as maravilhas da vida e pela oportunidade de realizar este trabalho.
À minha orientadora de mestrado e doutorado Profa. Mônica Cotta pela orientação, apoio, paciência e pelos ensinamentos que me ajudaram a crescer como profissional e como pessoa.
À Profa. Alessandra Alves de Souza do Centro de Citricultura Sylvio Moreira, do Instituto Agronômico de Campinas, pela colaboração e discussões sobre o trabalho.
À Mariana, Eduarda e Paula do CC/IAC pela preparação dos inóculos da Xylella
fasti-diosa.
Ao INFABIC pelo uso do microscópio confocal, e ao Prof. Hernandes Carvalho pelo apoio ao projeto. Agradeço à equipe do laboratório, Vitor e Mariana, pelo apoio técnico na utilização do equipamento.
Ao Prof. Carlos Lenz Cesar pela colaboração e discussões referentes à detecção ótica do sensor de força.
Ao Prof. Erik Bakkers, da Eindhoven University of Technology pelo fornecimento das amostras com nanofios de InP.
Ao Dr. Richard Janissen e ao Dr. Prasana Sahoo pelas discussões e colaborações.
Ao João Hermes e ao Hélio Obata pelo apoio com o uso dos equipamentos do LNB e pela convivência diária.
Ao Antonio von Zuben (Totó), Marcos Puydinger e Simbu pela limpeza das amostras com plasma de 𝑂2. Também agradeço ao Totó pelo incentivo desde o início do mestrado.
Aos colegas e amigos do laboratório Simbu, Duber, Moniellen, Mariana, Bruno, Jacobo, Lucas, João Carlos, Flávio, Aline pela convivência diária. Em especial ao Duber e à Moniellen pelo treinamento na manipulação das amostras biológicas.
Ao André e ao pessoal da oficina mecânica do IFGW pelo suporte na fabricação das células líquidas de Teflon.
À Alessandra e à Flávia da secretaria do DFA; à Márcia do setor financeiro; ao Armando, à Alessandra e à Luciana da secretaria da pós graduação, agradeço pelo apoio com os serviços administrativos.
do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Agradeço às agências de fomento FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro ao projeto, em especial à CAPES e ao CNPq pela concessão da bolsa de doutorado.
Agradeço aos meus pais pelos ensinamentos e por me ajudarem a ser persistente em busca dos meus objetivos. À minha mãe Ozilma pelo amor, carinho, pelo apoio em todas as minhas escolhas, por acreditar sempre em mim e por estar sempre presente nos momentos mais difíceis deste trabalho. Ao meu pai Aldo pelo amor, carinho, pelo apoio em todos os momentos e pelas discussões que me incentivaram durante a pesquisa.
À minha irmã Aldeline e aos meus irmãos Aldo e Aldonai pelo apoio e por acreditarem sempre em mim.
Ao meu querido Augusto pelo amor, pela companhia, pela paciência, por me apoiar em todas as escolhas da minha carreira e estar presente em todas as etapas deste traba-lho. Agradeço também pelo suporte psicológico e pelo apoio nos momentos em que mais precisei durante o doutorado.
À Sonia (sogrinha), Augusto, Antony e Afonso pelo acolhimento e moradia que me per-mitiram finalizar este trabalho. Em especial, à Sonia pelo apoio e pelos doces incríveis que animaram o período de escrita.
À Vanessa, Nilza e ao pequeno Théo pela convivência e apoio.
Aos amigos da sala 34 Mariana, Bruno, Adinei, Carol, Duber, Moniellen e Douglas pela convivência diária, pela amizade e por compartilhar experiências durante 6 anos de pós-graduação.
À Àurea e ao Sunichi Kato pelo apoio durante os 6 anos que passei em Campinas. Às amigas da república Laura, Rose, Marlene, Dani, Bárbara, Gabi, Renata, Mayara, Carol, Vanessa, Jociara, Evellyn, Karla, Ludmilla, Rudimylla, Kátia, Camilla, Amanda, Raquel, Fernanda, Juliana, Zhang Xiao Dan e Adriana pela convivência, pelo apoio e pelas conversas construtivas.
"I am among those who think that science has great beauty [...]"
Marie Curie
"We cannot fathom the marvelous complexity of an organic being [...]. Each living creature must be looked at as a microcosm- a little universe, formed of a host of self-propagating organisms, inconceivably minute and as numerous as the stars in
heaven."
Charles Darwin
"There is a plenty of room at the bottom"
em células individuais. As deflexões dos nanofios provocadas por bactérias aderidas foram medidas em tempo real através de microscopia confocal de varredura à laser (CLSM). Ini-cialmente, foi feito um estudo para a caracterização da técnica do sensor de força e dos limites de detecção. Mostramos, através de métodos de análise de microscopia de locali-zação, que podemos determinar o centro dos nanofios a partir de um ajuste gaussiano 2D, com precisão de localização de até 5 nm. Para investigar os níveis de ruído, foram feitas medidas de deslocamento dos nanofios, sem bactérias aderidas, em ar e em meio líquido. Utilizamos três taxas de varredura diferentes: 0,2, 0,8 e 2,5 MHz. Os resultados mostram que os deslocamentos medidos aumentam com a taxa de varredura e são isotrópicos em todos os casos, correspondendo a oscilações termicamente induzidas. Mostramos que, usando a menor taxa de varredura, podemos minimizar os efeitos das oscilações térmicas nas medidas realizadas com as bactérias. Dessa forma, a técnica permite detecção de deflexões acima de 25 nm, provocadas por forças devido à interação com células bacte-rianas. Aplicamos esse sistema para investigar o efeito do NAC (em concentrações entre 2 mg/ml e 20 mg/ml) em células individuais da Xylella fastidiosa aderidas no topo dos nanofios. Observamos em tempo real uma ação gradativa do NAC levando a um aumento na mobilidade das células e nas forças medidas e, eventualmente soltando as bactérias que estavam aderidas. Esses resultados também foram confirmados com experimentos in vitro realizados em substratos planos de InP, onde também observamos um efeito gradual do NAC em biofilmes. Para investigar o efeito do NAC no EPS (substâncias poliméricas extracelulares), utilizamos microscopia de fluorescência e microscopia de força atômica. Medidas de espectroscopia de força mostraram variações mais significativas em determi-nados tipos de EPS, sugerindo que há componentes específicos no EPS que estão sendo mais afetados pelo NAC. Os resultados obtidos neste trabalho permitem uma maior cla-reza sobre o mecanismo de ação do NAC em células aderidas e em biofilmes, podendo ser utilizados como ponto de partida para investigações futuras.
Abstract
This work presents applications of nanomaterials and microscopy techniques to study the effect of N-acetylcysteine (NAC) on adhered individual cells and biofilms of the phyto-pathogenic bacterium Xylella fastidiosa. The bacteria were grown on indium phosphide (InP) flat substrates and nanowires. We use arrays of vertical InP nanowires as cell adhe-sion force sensors to investigate and quantify the effect of NAC on individual cells. The nanowire deflections caused by adhered bacteria were measured in real-time using confocal laser scanning microscopy (CLSM). First, we have characterized the force sensor techni-que and detection limits. We show, using methods of localization microscopy analysis, that a 2D Gaussian fitting can determine the center of the nanowires, with accuracy up to 5 nm. To investigate noise levels, nanowire displacement measurements were carried out without attached bacteria, both in air and liquid media. We used three different scan rates: 0.2, 0.8 and 2.5 MHz. The results show that the measured displacements incre-ase with scan rate and are isotropic in all cincre-ases, corresponding to thermally induced oscillations. We demonstrate that the lowest scanning rate is able to minimize the effects of thermal fluctuations on measurements carried out with bacteria. Thus, the technique allows the detection of deflections above 25 nm, caused by bacterial-related forces. We applied this system to investigate the effect of NAC (in concentrations between 2 mg/ml and 20 mg/ml) on individual cells of Xylella fastidiosa adhered to the top of the na-nowires. We observed in real-time a gradual action of the NAC leading to an increase in the mobility of the cells and measured forces, with the eventual release of the previously attached bacteria. These results were also confirmed with in vitro experiments carried out on flat InP substrates, where we also observed a gradual effect of NAC on biofilms. To investigate the effect of NAC on EPS (extracellular polymeric substances), we used fluorescence microscopy and atomic force microscopy. Force spectroscopy measurements showed more significant variations in certain types of EPS, suggesting that there are spe-cific components in EPS that are being most affected by NAC. The results obtained in this work allow better understanding about the mechanism of action of NAC on adhered cells and biofilms, and can be used as a starting point for future investigations.
Resumo Abstract
1 Introdução 13
1.1 Xylella fastidiosa: . . . 17
1.2 N-Acetilcisteína:. . . 20
1.3 Força de adesão celular: . . . 25
1.4 Objetivos e estrutura da tese: . . . 29
2 Materiais e Métodos 31 2.1 Preparação das amostras . . . 31
2.1.1 Fabricação dos arrays de nanofios de InP: . . . 31
2.1.2 Cultivo das bactérias: . . . 32
2.1.3 Solução de N-Acetilcisteína: . . . 34
2.1.4 Marcação de EPS: . . . 34
2.2 Microscopia de Fluorescência. . . 35
2.2.1 Microscópio de fluorescência de campo amplo (WFM): . . . 37
2.2.2 Microscopia confocal de varredura à laser (CLSM): . . . 38
2.3 Microscopia de Força Atômica: . . . 41
2.4 Espectroscopia de Força: . . . 42
2.5 Análises estatísticas: . . . 45
2.5.1 ANOVA (Analysis of Variance): . . . 45
2.5.3 Variância de Allan: . . . 46
3 Estudo de sensores de força de adesão bacteriana baseados em nanofios de InP 47 3.1 Sensor de força: . . . 47
3.2 Caracterização da técnica: . . . 49
3.2.1 Métodos de processamento e análise das imagens: . . . 50
3.2.2 Limites da técnica: . . . 56
3.3 Aplicação do sensor de força para investigar o efeito da N-Acetilcisteína em bactérias aderidas: . . . 58
4 Estudo do efeito do NAC em células individuais e biofilmes da Xylel la fastidiosa 60 4.1 Experimentos preliminares:. . . 60
4.2 Estudo do efeito do NAC no EPS: . . . 65
4.2.1 Marcação de EPS com WGA-Texas Red: . . . 65
4.2.2 Espectroscopia de Força: . . . 69
4.3 Estudo do efeito do NAC em amostras in vitro: . . . 76
4.3.1 Estudo in vitro em bactérias crescidas em substratos planos de InP: 76 4.3.2 Estudo in vitro em bactérias crescidas sobre nanofios de InP: . . . . 87
5 Discussões e Conclusões 98
Referências 104
Introdução
Os microrganismos representam a maior diversidade de formas vivas do pla-neta, podendo ser encontrados até mesmo em ambientes hostis, como é o caso dos mi-crorganismos extremófilos abundantes em fontes vulcânicas, geleiras, em solos com pH extremamente ácidos ou básicos, ou em fundos oceânicos sob alta pressão. As células microbianas constituem a maior porção de biomassa da Terra; nos seres humanos, por exemplo, o número de células microbianas é aproximadamente 10 vezes maior que o nú-mero de células do nosso corpo [1, 2].
Estes seres apresentam papel fundamental no funcionamento dos ecossistemas e em atividades biológicas dos seres vivos. No meio ambiente, são necessários para os ciclos dos nutrientes essenciais, como carbono, nitrogênio e enxofre; bactérias presentes em nódulos de leguminosas, por exemplo, são responsáveis pela fixação de nitrogênio (transformação de nitrogênio atmosférico em amônia), fornecendo a fonte de nitrogênio que as plantas utilizam em seu crescimento. Assim, os microrganismos tem aplicações importantes em diferentes áreas, como agricultura, indústria alimentícia (na produção de alimentos fermentados), na produção de biocombustíveis, na indústria farmacêutica , na biorremediação (degradação de poluentes), entre outras [1].
Muitas espécies de microrganismos são, portanto, essenciais para os seres vivos e para a manutenção dos ecossistemas. No entanto, existem diversas espécies patogênicas que são altamente prejudiciais. Estas colonizam o hospedeiro e estabelecem infecções. Em geral as propriedades de virulência (capacidade de colonizar hospedeiros e provocar doenças) dos patógenos estão associadas a dois fatores principais: o primeiro é a capa-cidade do patógeno ligar-se e colonizar superfícies específicas do hospedeiro, o segundo é a capacidade do patógeno liberar moléculas e toxinas que causam danos ao hospedeiro [1]. Além disso, apesar da grande diversidade de microrganismos conhecidos, estima-se
1. Introdução 14
que apenas uma pequena fração dos microrganismos da Terra (menos que 1%) pode ser isolada e cultivada em laboratório [2]. Torna-se então essencial a investigação das espécies microbianas e das suas funções nos diferentes microbiomas, que consistem no conjunto de microrganismos que vivem num determinado ambiente [2, 3].
Em 2010 foi proposto, por pesquisadores da Universidade da Califórnia e do PNNL, o EMP (do inglês, Earth Microbiome Project), que é um projeto colaborativo destinado à identificação de espécies que constituem os diferentes microbiomas da Terra [4–6]. A complexidade das espécies microbianas é determinada pelo ambiente e pelo seu potencial genômico; assim estudos interdisciplinares são necessários para o entendimento da diversidade das espécies [7]. Um outro exemplo da importância de projetos colabo-rativos para o estudos dos microbiomas é a Iniciativa Nacional do Microbioma, NMI (do inglês, National Microbiome Initiative), proposta em 2016 pelo governo dos Estados Unidos [8]. O projeto tem como objetivos principais oferecer suporte a pesquisas inter-disciplinares, promover o desenvolvimento de plataformas tecnológicas, para aumentar o acesso e compartilhamento de dados dos microbiomas, e aumento da força de trabalho através da ciência, engajamento público e projetos educacionais [8].
As bactérias resistentes a antibióticos representam uma potencial ameaça em microbiomas disfuncionais, os quais são responsáveis por diversas infecções [9–11]. Assim, são necessárias investigações tanto em microbiomas sadios quanto em microbiomas disfun-cionais para o entendimento das interações dos microrganismos e para o desenvolvimento de métodos de controle antibacterianos. Os estudos interdisciplinares oferecem ferramen-tas que permitem um entendimento mais abrangente da interação dos microrganismos com o ambiente.
Técnicas de nanociência e nanotecnologia, por exemplo, permitem a investi-gação de processos biológicos em nanoescala , bem como aplicações biotecnológicas que envolvem fotossíntese artificial, produção de compostos químicos de interesse e células de combustível microbianas (MFCs, do inglês, Microbial fuel cells) [2,12–14]. Estes processo estão relacionados com a transferência extracelular de elétrons, que podem ocorrer atra-vés de proteínas de membrana ou atraatra-vés de filamentos proteicos (pili); no entanto esses processos ainda não são bem entendidos.
As bactérias podem colonizar ambientes na forma planctônica (livre) ou na forma de biofilmes. Estes são comunidades bacterianas cobertas por uma matriz de
subs-O modelo mais aceito atualmente para descrever o processo de formação de biofilmes é o modelo de Stoodley et al. [17], o qual consiste em 5 etapas principais: a primeira é a adesão reversível de bactérias planctônicas em superfícies; a segunda é a adesão irreversível, mediada por EPS. A terceira etapa envolve a formação da matriz de EPS; em seguida ocorre a maturação do biofilme e por último sua dispersão, reiniciando o ciclo. As bactérias que formam biofilmes se apresentam mais resistentes ao tratamento com antibióticos e às variações no meio externo. A matriz de EPS que constitui e recobre o biofilme atua como uma barreira para a difusão das moléculas até a membrana das células [11,17].
Figura 1.1: Etapas de formação de um biofilme bacteriano de acordo com o modelo de Stoodley: 1- adesão reversível de células planctônicas; 2- adesão irreversível; 3- formação da matriz de EPS; 4- maturação do biofilme; 5- desestruturação [15].
A formação de biofilmes está associada à patogenicidade de várias espécies bac-terianas, como a Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, S. epidermidis,
Klebsi-ella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, entre outras. Os biofilmes
representam uma das principais causas de infecções nosocomiais, devido à contaminação de instrumentos hospitalares [19]. Em geral, cerca de 65% a 80% das infecções crônicas são relacionadas aos biofilmes [19, 20]. Para o entendimento de processos de formação de biofilmes, é necessário investigar os processos de adesão das bactérias nas superfícies (que
1. Introdução 16
podem ser bióticas ou abióticas) e suas interações com o meio externo.
A Mecanobiologia é uma área interdisciplinar emergente, na interface da Biolo-gia, Física e Bioengenharia, que investiga propriedades mecânicas de células e a influência de forças no comportamento das células eucarióticas e procarióticas [21–25]. Envolve processos de sensoriamento mecânico (no qual a célula detecta sinais mecânicos do ambi-ente) e mecanotransdução (conversão dos sinais mecânicos em processos celulares). Esses processos dependem de propriedades mecânicas da matriz extracelular (ECM, do inglês
Extracellular matrix) e influenciam processos celulares como crescimento, motilidade e
diferenciação [26, 27].
Em células eucarióticas, a resposta das células a propriedades e forças me-cânicas dependem de uma complexa organização que envolve o citoesqueleto de actina, integrinas de membrana e propriedades da ECM [28]. Em resposta ao meio externo são geradas forças de tração celular; a quantificação dessas forças são importantes no enten-dimento das células e na previsão de eventos fisiológicos e patológicos [28]. Em bactérias, estresses mecânicos influenciam em processos fisiológicos como divisão celular, adesão celular em superfícies, formação de biofilmes e resistência a toxinas e antibióticos [24]. Algumas técnicas para quantificar forças exercidas por células são microscopia de força de tração TFM (do inglês, Traction Force Microscopy) [29–31], aplicações de micropilares elásticos de PDMS ou nanofios que atuam como alavancas [23], microfluídica [32], pinças óticas [33–35] entre outras. Técnicas aplicadas para as medidas de forças de adesão de células serão discutidas posteriormente neste capítulo.
Nesta tese apresentamos resultados de um estudo interdisciplinar realizado com nanofios semicondutores de fosfeto de índio (InP) para medidas de forças exercidas pela bactéria Xylella fastidiosa. Utilizando técnicas de microscopia de fluorescência confocal e de varredura por sonda, acopladas ao uso de nanofios como sensores de força, pudemos obter informações sobre o efeito da molécula N-Acetilcisteína (NAC) na bactéria Xylella
fastidiosa tanto em células individuais quanto em biofilmes. A seguir serão discutidos
os principais tópicos apresentados neste trabalho, incluindo uma revisão da literatura e discussões das questões que motivaram este estudo.
(família Cicadellidae, Figura 1.2 (a)). Esta bactéria causa doenças em diversos tipos de plantas como citros, café, pêssego, uva, entre outras [38, 39], causando perdas econômicas significativas em diversos países. No Brasil, a X. fastidiosa afeta principalmente planta-ções de citros, causando a Clorose Variegada dos Citros (CVC), popularmente conhecida como "amarelinho", pois as plantas infectadas apresentam folhas secas e amareladas e os frutos são pequenos e desidratados (Figura 1.2 (b)-(d)) [40, 41]. Outra doença comum causada por esta bactéria é a doença de Pierce em videiras, caracterizada por folhas res-secadas nas bordas, como pode ser visualizado na Figura1.2 (e). A patogenicidade da X.
fastidiosa está associada à formação de biofilmes no xilema das plantas (Figura 1.2 (f)), provocando oclusão vascular e levando a planta à estresse hídrico.
As bactérias utilizam diferentes estratégias de adesão, que envolvem interações não específicas (eletrostáticas e hidrofóbicas) e específicas (mediadas por adesinas fimbriais e afimbriais) e a produção de EPS. Adesinas fimbriais, por exemplo os pili bacterianos, são filamentos proteicos que emergem da superfície da célula. A X. fastidiosa apresenta pili tipo I e tipo IV (predominantemente em um polo bacteriano) [43–45]. Os pili tipo I têm comprimentos entre 0.4 e 1.0 𝜇m e estão associados aos estágios iniciais de adesão. Os pili tipo IV são mais longos, com comprimentos típicos entre 1.0 e 6.0 𝜇m e são responsáveis pela motilidade das bactérias (twitching motility) [45–47]. As adesinas afimbriais são proteínas de adesão específicas presentes na membrana bacteriana, por exemplo, a XadA1 e a XadA2 no caso da X.fastidiosa [46]. Os pili tipo I e tipo IV, as adesinas afimbriais e certos compostos também têm papel na interação célula-célula e na formação de biofilmes [18, 44, 46].
Os mecanismos de adesão dependem, portanto, de propriedades da superfície bacteriana (carga elétrica, adesinas), propriedades da superfície de adesão (como rugo-∗As bactérias podem ser classificadas como gram-positivas ou gram-negativas dependendo da estrutura
da parede celular. As bactérias gram-positivas apresentam uma membrana citoplasmática e uma camada de peptideoglicano espessa, a qual é responsável por cerca de 80% da rigidez da parede celular. Já as bactérias gram-negativas apresentam uma membrana citoplasmática, uma camada de peptideoglicano e uma membrana externa (envelope celular) de lipopolissacarídeos (LPS) [1].
1. Introdução 18
Figura 1.2: (a) Imagem de um vetor típico da transmissão da bactéria; (b) comparação de frutos sadios (à direita) e frutos com CVC (à esquerda); (c) e (d) Plantações de laranjas infectadas com a X. fastidiosa, apresentando sintomas da CVC; (e) Folha de plantações de uvas apresentado sintomas da doença de Pierce causada pela X. fastidiosa; (f) imagem de microscopia eletrônica de varredura de uma cross section do xilema de plantas de café, apresentado oclusão vascular causada por biofilmes da X. fastidiosa. Imagens adaptadas de [39, 40,42].
sidade, hidrofobicidade, carga elétrica, potencial de superfície e grupos químicos) e con-dições do meio de cultura [48–50]. Estudos realizados por Lorite et al. para investigar adesão da X. fastidiosa e formação de biofilmes em diferentes superfícies bióticas e abió-ticas mostram que a adesão bacteriana é facilitada em superfícies mais hidrofílicas e com maiores potenciais de superfície, em contraste com outros estudos que reportam espécies bacterianas que aderem em superfícies mais hidrofóbicas. Além disso, componentes espe-cíficos presentes na superfícies e componentes depositados devido à formação de um filme condicionante proveniente do meio de cultura [49, 50] apresentam papel determinante na adesão bacteriana. Murillo et al. apresentam um extensivo estudo para investigar a dependência da adesão da X. fastidiosa com componentes específicos presentes no meio de cultura, pH e tipo de superfície e sugerem um modelo em que são necessários íons bivalentes específicos para a adesão bacteriana em determinadas faixas de pH [51].
O EPS pode ser classificado como EPS solúvel (S-EPS), EPS capsular (ou TB-EPS, do inglês tightly bound EPS) e EPS slime (ou LB-EPS, do inglês loosely bound
pode acontecer através de interações eletrostáticas não específicas e adesinas fimbriais e afimbriais, ocorre através da região polar e as células aderidas verticalmente através do polo realizam um movimento de precessão em torno de um eixo que passa pelo ponto de adesão.
As bactérias produzem S-EPS desde a etapa inicial e reversível de adesão for-mando discos de S-EPS em torno do ponto de adesão, que em geral ocorre pelos polos. A adesão irreversível ocorre mediante o acúmulo de S-EPS na região polar; posterior-mente ocorre um recobrimento gradual da célula por EPS capsular. Com maior tempo de crescimento, os discos de S-EPS ao redor das células aderidas crescem e se encontram, recobrindo a superfície e facilitando a adesão de novas células planctônicas. As células começam a se agregar e formar clusters que são conectados por células filamentadas (cu-jos tamanhos podem chegar a ser 10x maior que o tamanho típico das bactérias). Os
clusters são envolvidos por uma matriz de EPS slime e são ancorados na superfície por
poucas células. Por fim ocorre a maturação do biofilme que cresce verticalmente em uma arquitetura ancorada por algumas células. Durante a maturação do biofilme, também é produzido EPS solúvel, sob a forma de filamentos, que facilita a adesão de novas células e dá suporte mecânico ao biofilme [18].
Usualmente, o método de controle para as plantas infectadas pela X. fastidiosa consiste na poda de ramos e no replantio de mudas sadias. Muranaka et al. [41] repor-taram efeitos positivos do uso da N-Acetilcisteína (NAC) no tratamento da X. fastidiosa, sendo o primeiro trabalho a aplicar esta molécula para o tratamento de uma bactéria fitopatogênica. Foram observados efeitos na redução de biofilmes e remissão dos sintomas das plantas que apresentavam CVC. A próxima seção apresenta as principais propriedades do NAC e discute alguns resultados reportados na literatura sobre o efeito desta molécula em bactérias.
1. Introdução 20
1.2
N-Acetilcisteína:
O NAC é um derivado N-acetil do aminoácido L-cisteína que apresenta apli-cações clínicas em uma ampla variedade de doenças [54–56]. É utilizado como agente mucolítico desde a década de 1960 e, desde a década de 1980, é aplicado no tratamento de doenças que envolvem estresse oxidativo, por apresentar propriedades antioxidantes [57–60]. A molécula de NAC, cuja fórmula estrutural é mostrada na Figura 1.3 é um tiol, contendo um grupo sulfidrila que quebra ligações dissulfídicas presentes em muco, levando à sua desestruturação. Em humanos o NAC é usado por exemplo no tratamento de do-enças do trato respiratório [57,61,62], sendo também reportado o seu uso no tratamento de intoxicação por paracetamol.
Figura 1.3: Fórmula estrutural da molécula de N-Acetilcisteína. Adaptado de [57,63]. A atividade mucolítica do NAC é explicada pela sua propriedade de quebrar pontes dissulfídicas em glicoproteínas presentes em muco. Essas pontes dissulfídicas atuam como crosslinks e ao serem rompidas levam a uma redução da viscosidade do muco.
O NAC também atua como antioxidante prevenindo ou inibindo diretamente processos oxidativos in vitro. No entanto, em matriz biológica a atividade antioxidante depende de vários mecanismos e da taxa de reação dos antioxidantes endógenos com oxidantes enzimáticos e não enzimáticos e com substratos [58]. Para processos in vivo, o NAC apresenta atividade antioxidante direta ou indireta. Como antioxidante direto, o NAC apresenta, sob certas condições in vivo efeito direto em algumas espécies oxidantes como 𝑁𝑂2 [58]. O efeito antioxidante indireto está relacionado com a propriedade do
NAC atuar como precursor de cisteína, que é necessário na síntese de glutationa (GSH). A glutationa é um tripeptídeo endógeno que reage e neutraliza moléculas eletrofílicas
em proteínas tioladas, o NAC libera tióis e proteínas reduzidas que podem apresentar atividade antioxidante direta[58, 60].
A Figura 1.4 apresenta uma ilustração dos mecanismos de ação do NAC na quebra de ligações dissulfídicas (Figuras 1.4 (a) e (b)) e como precursor de cisteína, que juntamente com ácido glutâmico e glicina, atua na síntese de glutationa1.4(c) . A Figura
1.4 (b) apresenta o mecanismo de quebra de ligações dissulfídicas em proteínas (P) por um tiol (RSH) a partir de uma reação de troca tiol-dissulfeto que ocorre em duas etapas [60, 64].
Figura 1.4: Ilustração dos mecanismos de ação do NAC (a) como agente mucolítico que quebra ligações dissulfídicas de glicoproteínas presentes em muco, levando a uma redução da sua viscosidade (b) reação de troca típica que ocorre em duas etapas entre um tiol (RSH), neste caso o NAC, e uma proteína (P), onde ocorre quebra de ligações dissulfí-dicas; (c) representação do NAC como precursor de cisteína, que juntamente com ácido glutâmico e glicina, são necessários na síntese de glutationa. Adaptado de [57, 58] e [60]. O NAC apresenta também propriedades antibacterianas e potenciais aplicações no tratamento de infecções, para diferentes tipos de bactérias. Os efeitos antibacterianos
1. Introdução 22
do NAC mais comumente reportados na literatura envolvem a diminuição de EPS e, portanto, redução da quantidade de biofilmes, além de efeitos inibitórios na produção de EPS e na adesão bacteriana em superfícies, impedindo a formação de biofilmes; há também efeitos relacionados à morte celular, dependendo das concentrações de NAC utilizadas e das condições do meio de cultura [65, 66]. Esses efeitos são reportados para diversas espécies de bactérias, como a Pseudomonas aeruginosa [67, 68], Staphyllococcus
epidermidis [66, 69], Helicobacter pylori [70], Bacilus cereus, Escherichia coli [71], entre outras [59,72–75].
Por apresentar propriedade mucolítica e desestruturar a matriz de EPS, vários trabalhos, desde 1977, reportam o uso do NAC em combinação com antibióticos. Parry et al. apresentam efeitos do NAC na inibição do crescimento de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Também apontam efeitos aditivos e sinérgicos da combinação de NAC com carbenicilina ou ticarcilina, no entanto apresentam efeitos antagonizantes do uso desta molécula em combinação com gentamicina e tobramicina em estirpes da
Pseudo-monas aeruginosa. Leite et al. apontam a combinação de NAC com vancomicina como
potenciais candidatos no tratamento de infecções causadas por biofilmes da
Staphylococ-cus epidermidis e StaphylococStaphylococ-cus aureus [76]. Aslam et al. mostram efeitos positivos no uso do NAC em combinação com tigeciclina na redução de biofilmes da S.epidermidis e S.aureus e sugerem o uso desta combinação como solução de bloqueio para cateteres vasculares [77]. [71,76, 78–82].
Alguns trabalhos investigam o efeito do NAC isolado (sem combinação com antibióticos) em biofilmes bacterianos. Perez-Giraldo et al. apresentam redução da den-sidade de biofilmes da S. epidermidis com o aumento da concentração de NAC, com re-sultados estatisticamente significantes para concentrações a partir de 0,25 mg/ml. Foram utilizadas concentrações de NAC entre 0,003 e 8 mg/ml, com efeito inibitório em 2 mg/ml [66]. Ollofson et al. mostram que o NAC é um potencial candidato para reduzir e prevenir a formação de biofilmes em superfícies de aço inoxidável [59]. Foram analisadas diferentes estirpes de bactérias como Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacilus cereus,
Acine-tobacter lwoffi, AcineAcine-tobacter bawmannii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas mendocina e Staphylococcus warneri. Foram investigados efeitos do NAC
na produção e na degradação de EPS e na adesão de células na superfície. O trabalho propõe que o efeito do NAC nas estirpes analisadas é químico e biológico. Foi observada
competitivamente a utilização de cisteína, ou podem afetar mecanismos de sinalização envolvidos com a produção de EPS. Além disso o NAC também pode apresentar efeitos metabólicos devido às suas propriedades antioxidantes. O trabalho também mostra que a presença de solução com NAC 0,5 mg/ml aumenta a molhabilidade da superfície, indi-cando que moléculas de NAC foram adsorvidas [59]. Choi et al. apresentam efeitos do NAC em biofilmes endodônticos formados por bactérias Actinomyces naeslundii,
Lacto-bacilus salivarius, Streptococcus mutans e Enterococcus faecalis; as concentrações de NAC
foram variadas entre 25 mg/ml e 100 mg/ml, sendo que esta última rompeu totalmente biofilmes maduros [73].
Alguns estudos mostram que em certas condições nas quais o pH do meio é menor que o pKa do NAC, este pode provocar morte celular.†Kundukad et al. apresentam
resultados que indicam 100% de morte celular em biofilmes da Pseudomonas aeruginosa no caso em que o pH do meio é menor que o pKa do NAC (3,3) [67]. O trabalho propõe que o mecanismo de ação do NAC é o mesmo que o do ácido acético, que, como reportado em outros trabalhos, pode penetrar através da membrana por difusão passiva quando se apresenta na forma neutra; a forma ionizada, porém não se difunde através da membrana. O NAC apresenta um grupo -COOH cujo pKa é 3,3 e um grupo -SH cujo pKa é 9,8. Para pH menor que 3,3, a molécula de NAC se apresenta prioritariamente na forma neutra
𝑁 𝐴𝐶𝐻2. Para pH entre 3,3 e 9,8, predomina a forma desprotonada 𝑁𝐴𝐶𝐻− e para pH
>9,87 a forma 𝑁𝐴𝐶2− é predominante. Assim em pH < 3, o NAC penetra na matriz
de EPS e na parede celular. No interior da célula, o pH é mais alto (em torno de 7,6); dessa forma o NAC se dissocia, acidifica o citoplasma e desnatura proteínas levando à morte celular. O trabalho também mostra que o tamanho das colônias aumenta após a
†
O pH ou potencial hidrogeniônico corresponde ao logaritmo do inverso da concentração de íons [𝐻+]: 𝑝𝐻 = 𝑙𝑜𝑔 1
𝐻+. O pKa é o logaritmo do inverso da constante de acidez (ou constante de dissociação) 𝐾𝑎 =
[𝐻+][𝐴−]
[𝐻𝐴] . Assim 𝑝𝐾𝑎 = 𝑙𝑜𝑔 1
𝐾𝑎. O pH e o pKa se relacionam pela equação de Handerson-Hasselbach: 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔[𝐴
−]
[𝐻𝐴], assim quando o pH é igual ao pKa, metade das moléculas está ionizada e a outra metade está protonada. [83]
1. Introdução 24
adição de NAC em pH baixo; o mecanismo proposto para explicar este efeito é que ao causar morte das bactérias que atuam como crosslinks e estruturam a matriz do biofilme, as proteínas de membranas que ligam as células à matriz são degradadas , quebrando os
crosslinks e causando um aumento no tamanho das colônias [67].
Li et al. mostraram recentemente efeitos do NAC no metabolismo da bactéria
Pseudomonas aeruginosa em estirpes presentes em microbiotas de feridas crônicas. São
relatados efeitos do NAC em estados redox no interior da célula e no metabolismo da
Pseudomonas aeruginosa a partir do estudo da razão 𝑁𝐴𝐷+/NADH ; foi observado que
para pH menor que o pKa e com o aumento da concentração de NAC entre 5 mg/ml e 20 mg/ml a razão 𝑁𝐴𝐷+/NADH diminui significativamente, levando a um aumento
no estresse oxidativo. Além disso, na concentração 20 mg/ml também ocorre inibição de síntese proteica e morte celular [84].
Costa et al. reportam uma potencial aplicação do NAC para fabricação de superfícies antibacterianas. O trabalho mostra um método para a imobilização covalente do NAC (concentração 4 mg/ml) em filmes de quitosana. A funcionalização com NAC diminui a adsorção de proteínas nos filmes de quitosana e foi observado que este método impede a adesão de bactérias Staphylococcus aureus e consequentemente, evita a formação de biofilmes [85].
O trabalho apresentado por Muranaka et al. para uso do NAC no tratamento da Xylella fastidiosa mostra que a concentração inibitória mínima (MIC) do NAC neste caso é 6 mg/ml e investiga o efeito do NAC na formação de biofilmes e na viabilidade celular, na produção de EPS e em plantas que apresentam CVC. Os autores mostram que houve remissão dos sintomas e diminuição da população bacteriana em plantas tratadas com fertilizantes + NAC e que estas absorveram concentrações entre 0,48 e 2,4 mg/ml. Para experimentos in vitro houve redução da adesão bacteriana em superfícies de vidro e na produção de EPS, levando a uma redução na formação de biofilmes para concentrações de NAC acima de 1 mg/ml. Nesta concentração, a viabilidade de células também foi significativamente reduzida. O trabalho sugere o uso do NAC na agricultura para o controle de fitopatógenos.
Cattò et al. mostraram recentemente um estudo do efeito no NAC na Xylella
fastidiosa subespécie pauca, em estirpes De Donno (Xf-DD), isoladas de oliveiras do sul
concentração de NAC diversificou fenótipos no biofilme, levando à formação de biofilmes e desestimulando a liberação dos biofilmes da superfície. O aumento da biomassa dos biofilmes após a exposição ao NAC nas concentrações não letais pode ter ocorrido como forma adaptativa para proteção dos efeitos das ROS. [86].
Em resumo, os trabalhos reportados na literatura apresentam a aplicação do NAC em diferentes espécies de bactérias gram-positivas e gram-negativas, com concen-trações que variam desde 0,003 mg/ml até 100 mg/ml. Os efeitos observados dependem da concentração de NAC, das condições do meio e das estirpes bacterianas. Apesar dos trabalhos existentes na literatura apresentarem efeitos antibacterianos do NAC, seu me-canismo de ação nas células e biofilmes ainda não é bem entendido e são necessários mais estudos para investigar os mecanismos de ação desta molécula. É importante notar a com-plexidade dos efeitos que podem ocorrer, os quais podem ser de natureza físico-química ou biológica. Um dos objetivos do trabalho apresentado nesta tese é identificar mecanismos de ação do NAC em bactérias já aderidas na superfície e em biofilmes daX. fastidiosa. O foco do trabalho consiste em investigar o efeito do NAC no EPS, relacionado à adesão das células e à constituição da matriz dos biofilmes.
1.3
Força de adesão celular:
O estudo da adesão de células microbianas a superfícies e a outras células é importante para o entendimento dos mecanismos de interação das células com os hos-pedeiros e com o ambiente. Um dos métodos para estudar interações de células com superfícies é o estudo de forças de adesão. Como foi mencionado anteriormente, a ade-são de células individuais depende de várias propriedades da superfície (como rugosidade hidrofobicidade, grupos químicos e potencial de superfície)[87], propriedades da parede ce-lular (como proteínas de membrana, adesinas e carga elétrica), e condições do meio (como pH e componentes)[88–97]. A adesão bacteriana em superfícies interfere, por exemplo, na virulência da Pseudomonas aeruginosa, a qual responde a propriedades mecânicas da
1. Introdução 26
superfície e ativa mecanismos de quorum sensing [98].
Diferentes tipos de forças estão envolvidos no processo de adesão, como inte-rações eletrostáticas, van der Waals, inteinte-rações hidrofóbicas e inteinte-rações específicas entre proteínas de membrana e grupos químicos presentes na superfície [99, 100], além de in-terações mediadas por substâncias extracelulares secretadas pelas bactérias. Entender as forças de interação entre células e superfícies é essencial para a compreensão dos processos de colonização do hospedeiro, virulência e formação de biofilmes.
Alguns modelos teóricos são propostos para explicar as interações entre células e superfícies durante os estágios inicias de adesão irreversível e reversível, como a teoria DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) [101], a teoria DLVO estendida (XDLVO), e modelos termodinâmicos [102]. No entanto, os modelos propostos apresentam limitações, visto que os processos de adesão também dependem das propriedades e de processos biológicos específicos de cada célula, os quais não são considerados nos modelos [103]. As bactérias também podem apresentar mecanismos que atuam como sensores mecânicos (motores flagelares, motores de pili tipo IV) que respondem a propriedades mecânicas do meio [103,104]. Outro exemplo é que as proteínas de membrana que envolvem as bactérias esféricas Staphylococcus aureus e Staphylococcus carnosus são de fato mais determinantes na adesividade das células, do que a área de contato entre as células e a superfície [105]. Assim, técnicas de medidas que permitam o estudo de forças de adesão e interações das células com as superfícies são essenciais [102].
Diferentes métodos foram desenvolvidos e aplicados para medidas de forças de adesão de células bacterianas e células eucarióticas em superfícies bióticas e abióticas. Algumas técnicas se baseiam em medir a força necessária para desprender células aderidas em superfícies. Por exemplo aparatos com discos rotativos onde forças de cisalhamento hidrodinâmicas são aplicadas em células aderidas numa superfície, ao girar o disco que contém as células até que elas se soltem [102]. No entanto, esta técnica permite apenas uma estimativa das forças e estas têm contribuições de um conjunto de células. Outra técnica semelhante é o uso de centrífuga, na qual o substrato contendo as células é centri-fugado para a aplicação de uma força perpendicular à área de adesão das células. Porém, a força aplicada é baixa (menor que 100 pN) permitindo apenas investigar eventos iniciais de adesão [102]. Outras técnicas são experimentos em microfluídica para medir forças de cisalhamento em células aderidas [32, 106–111] e medidas de sucção realizadas com
são imobilizadas na alavanca substituindo as pontas usualmente utilizadas e fazendo papel de "sondas"para medidas de força de interação com outras células e com o substrato [113–
116]; com isso é possível medir forças de interações no intervalo de pN a nN. A medida é feita a partir de deflexões na alavanca que são provocadas pelas forças de interação entre as superfícies da célula e do substrato e são medidas utilizando um sistema de detecção ótica.
Figura 1.5: Ilustração de algumas técnicas usadas nas medidas de forças de adesão de células: (a) disco rotativo para aplicação de forças de cisalhamento que levam ao despren-dimento da célula, adaptado de [102]; (b) pinça ótica para medir a força de adesão de uma bactéria a uma lamínula de vidro, adaptado de [89]; (C) microfluídica mostrando o desprendimento de células da X. fastidiosa em função do fluxo, adaptado de [89,107]; (d)
Single cell force spectroscopy mostrando a imobilização de uma bactéria individual numa
alavanca de AFM, para medidas de forças de interação com moléculas específicas da mem-brana bacteriana e moléculas presentes na superfície, adaptado de [113]; (e) deformação induzida em nanopilares devido à adesão de células, adaptado de [89].
Outra técnica é a aplicação de um método similar à medidas óticas de defle-xão da alavanca do AFM, porém a medida é feita em arrays de nanofios (ou nanopilares)
1. Introdução 28
onde a deflexão destes é medida por um sinal ótico [117–119]. Essa técnica tem vantagem em relação às medidas de SCFS, no sentido que permite a obtenção de forças em tempo real que podem ser obtidas em diferentes pontos no corpo da célula. Vários trabalhos na literatura mostram o uso de nanopilares poliméricos de PDMS ou nanofios semicon-dutores verticais para medidas de interação com diferentes células eucarióticas [117–124]. Hallstrom et al. mostram a aplicação de nanofios de fosfeto de gálio (GaP) para o estudo de forças de adesão de neurônios; as medidas fora feitas a partir da detecção ótica das deflexões dos nanofios provocadas pelas células e permitiram obtenção de forças na faixa de ≈ 15 pN. O intervalo de forças pode ser modulado pela geometria (diâmetro e compri-mento) dos nanofios [118]. A Figura 1.5 ilustra algumas técnicas aplicadas para medidas de força de adesão de células.
A topografia de superfícies com nanoestruturas também influencia na adesão de células. A estrutura dessas superfícies podem interferir, por exemplo, no crescimento de células neuronais [125]. Spengler et al. observaram em superfícies de silício nano-estruturadas que a força de adesão diminui com o tamanho das nanoestruturas [126]. Outros trabalhos na literatura mostram que a adesão bacteriana pode ser reduzida ou mesmo evitada para arquiteturas específicas, que podem ser controladas pela rugosidade da superfície, geometria e propriedades mecânicas (stiffness). Além disso, em superfícies nanoestruturadas, as células podem ter determinadas orientações: Pseudomonas
aerugi-nosa adere preferencialmente entre as nanoestruturas quando a periodicidade é maior que
o tamanho da bactéria; quando o espaço é menor que o tamanho das bactérias, elas se orientam perpendicularmente às nanoestruturas, para maximizar a superfície de contato [89].
Em nosso grupo o uso de nanofios como sensores de força foi aplicado pela primeira vez para o estudo de forças de adesão da bactéria Xylella fastidiosa, onde foram usados nanofios verticais de InP (Figura1.6). P. Sahoo et al. mostraram que é possível medir forças de adesão de até 45 nN. As forças de adesão medidas no polo das bactérias são maiores do que as forças medidas em outras regiões. O trabalho mostra medidas realizadas em amostras secas, a partir de imagens de microscopia eletrônica de varredura, e medidas in vitro, realizadas em tempo real com bactérias vivas, através de microscopia confocal de varredura à laser (CLSM). Também foi observado um aumento significativo da força para superfícies dos nanofios funcionalizadas com a adesina XadA1; neste caso
Figura 1.6: (a)Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando a deformação em nanofios verticais de InP provocada pela bactéria aderida. (b)Imagem FESEM top
view mostrando o deslocamento dos nanofios e gráfico polar mostrando as forças medidas
a partir dos deslocamentos. (c) Ilustração da funcionalização da superfície dos nanofios com a adesina XadA1. Adaptado de [117].
A descrição da técnica de medidas de forças com nanofios verticais será discu-tida com mais detalhes no capítulo 3 desta tese.
1.4
Objetivos e estrutura da tese:
O fato de já conhecermos os estágios de desenvolvimento dos biofilmes da
X.fastidiosa, desde as etapas iniciais da adesão de células planctônicas, torna esta bactéria
um modelo adequado para os estudos realizados nesta tese. Além disso a X. fastidiosa é uma bactéria que afeta plantas e sua transmissão depende de um vetor, assim pode ser cultivada no laboratório com técnicas de segurança simples, não necessitando de medidas de segurança mais complicadas usadas em microbiologia. Na seção 1.1 foram discutidos resultados obtidos previamente no nosso grupo em relação à adesão e à evolução temporal da X.fastidiosa, incluindo a presença de diferentes tipos de EPS durante o ciclo de vida bacteriano. Utilizaremos esses resultados juntamente com técnicas de microscopia de força atômica e microscopia de fluorescência para investigar o efeito do NAC na X.fastidiosa.
Neste trabalho, temos como objetivo principal investigar efeitos do NAC em células individuais e em biofilmes da X.fastidiosa. Uma estratégia que propomos para fazer um estudo quantitativo do efeito do NAC em células individuais é a utilização dos
arrays de nanofios de InP para medir a força de adesão da bactéria e avaliar o efeito da
1. Introdução 30
Para isso, primeiramente foi feita uma caracterização da técnica do sensor de força desenvolvido em nosso grupo. A caracterização foi feita para identificar limites de detecção da técnica, níveis de ruído e métodos de processamento de imagens para obtenção dos resultados.
A segunda parte do trabalho consiste na investigação dos efeitos do NAC. Com o objetivo de analisar os efeitos desta molécula em estados iniciais de adesão e em biofil-mes em estágios iniciais de formação, utilizamos tempos de crescimento que permitiram a observação de células aderidas na superfície e biofilmes. Usamos concentrações de NAC que permitiram a observação em tempo real de efeitos em células aderidas. Fizemos me-didas de microscopia de fluorescência e microscopia de força atômica em amostras secas e medidas de fluorescência in vitro, as quais permitiram obter resultados que sugerem mecanismos de ação do NAC predominantes no EPS. O próximo capítulo discute breve-mente estas técnicas, assim como a preparação de amostras e estatísticas utilizadas neste trabalho. Já os resultados obtidos nesta tese serão apresentados em duas partes: a pri-meira parte (capítulo 3) discute o método do sensor de força baseado em nanofios de InP e apresenta resultados do estudo para a caracterização e determinação do limites da técnica. Também é discutida a aplicação do sensor de força para a investigação do efeito do NAC na X. fastidiosa. Na segunda parte do trabalho (capítulo 4), são apresentados resultados da investigação do efeito do NAC em células individuais e biofilmes da X. fastidiosa em estágios iniciais de formação.
Materiais e Métodos
2.1
Preparação das amostras
2.1.1
Fabricação dos arrays de nanofios de InP:
Os arrays de nanofios de InP, utilizados como sensores de força neste traba-lho, foram fabricados e fornecidos através de colaboração com o Prof. Erik Bakkers da Eindhoven University of Technology (TUE). Obtivemos conjuntos de amostras fabricadas por dois métodos diferentes: o primeiro é o crescimento catalisado por nanodiscos de Au, formados a partir de padrões criados por nanoimprint; o segundo método é a epitaxia se-letiva (SAE, do inglês Selective Area Epitaxy). Os princípios básicos desses métodos serão explicados mais adiante. Os nanofios fabricados por essas técnicas possuem dimensões (diâmetro e comprimento) diferentes. No primeiro caso, obtivemos nanofios com aproxi-madamente 90 nm de diâmetro e 1,5 𝜇𝑚 de comprimento; no segundo caso os nanofios apresentaram aproximadamente 200 nm de diâmetro e 3,0 𝜇𝑚 de comprimento. Nos dois casos, a distância entre o centro dos nanofios é de aproximadamente 513 nm, definida pela distância entre os padrões criados no substrato onde os nanofios foram crescidos. O uso dos dois tipos de arrays estão relacionados com a disponibilidade das amostras, que não foram crescidas especificamente para este trabalho. Inicialmente, usamos os nanofios com a primeira geometria; no entanto os experimentos realizados para o estudo do efeito do NAC necessitaram de uma quantidade maior de amostras, o que levou ao uso das amostras fabricadas por SAE na TUE.
De forma simplificada, a técnica de nanoimprint consiste na transferência me-cânica do padrão de interesse, através de um molde de Si, para o substrato de InP coberto por uma resina (como polimetil metacrilato, PMMA) [117, 127]. Após a transferência do
2. Materiais e Métodos 32
padrão, é depositada uma camada de Au (com 8 nm de espessura). A próxima etapa é a realização do lift-off para remover a resina e o excesso de Au, formando então padrões com discos de Au, que servem como catalisadores para o crescimento dos nanofios de InP, que ocorre através do mecanismo vapor-líquido-sólido (VLS). Os nanofios foram crescidos em um reator MOVPE (do inglês, Metalorganic Vapor Phase Epitaxy) usando trimetil-índio (TMI) como precursor de grupo III e, fosfina (𝑃 𝐻3) como precursor do grupo V. A
quantidade de Au determinará o diâmetro dos nanofios. Devido à orientação do substrato de InP utilizado, foram obtidos nanofios verticais de InP na fase wurtzita, com seção transversal hexagonal [117,127]. A Figura 2.1 apresenta uma ilustração esquemática dos processos realizados com esta técnica [127].
Figura 2.1: Ilustração esquemática das etapas de fabricação dos arrays de nanofios ver-ticais de InP pela técnica de nanoimprint, apresentando as etapas de transferência do padrão para uma resina, deposição de Au, lift-off e crescimento dos nanofios [127].
Diferentemente do crescimento VLS catalisado pelos nanodiscos de Au, a téc-nica de epitaxia seletiva não necessita de uma partícula catalisadora. Através do SAE, os nanofios são crescidos seletivamente em padrões definidos em uma camada dielétrica depositada sobre o substrato semicondutor [128, 129]. A Figura 2.2 a seguir mostra uma representação esquemática das principais etapas envolvidas nesta técnica.
2.1.2
Cultivo das bactérias:
Neste trabalho utilizamos a bactéria Xylella fastidiosa subespécie pauca da estirpe 11399, a qual é modificada para expressar a proteína fluorescente no verde GFP (do inglês, Green Fluorescent Protein). A modificação é feita pela inserção do plasmídeo pKLN59 através de eletroporação [130–132]. As células modificadas são ressuspendidas e cultivadas em meio de cultura PW (Periwinkle Wilt)[133] por 7 dias em um shaker
Figura 2.2: Ilustração esquemática das etapas de fabricação dos arrays de nanofios ver-ticais de InP pela técnica de epitaxia seletiva, apresentando as etapas de deposição da camada dielétrica, formação dos padrões por EBL (do inglês, Electron Beam Lithography) e crescimento dos nanofios [129].
rotativo. O inóculo com 7 dias de crescimento (com concentração de células de aproxi-madamente 2 · 107 CFU) foi cedido através de colaboração com a Dra. Alessandra Alves
de Souza, do Centro de Citricultura ’Sylvio Moreira’, Cordeirópolis, São Paulo.
Nos experimentos realizados neste trabalho, as bactérias fornecidas foram ino-culadas com o meio de cultura PW, usando 20% do inóculo fornecido e 80% de meio de cultura. A inoculação foi feita sobre diferentes superfícies de InP (substratos planos e nanofios) inseridos em placas de Petri ou em células líquidas de Teflon, fabricadas para medidas de fluorescência in vitro, como pode ser visualizado na Figura 2.3. No caso da célula líquida de Teflon, usamos uma lamínula de vidro com 0,16 mm de espessura para cobrir a amostra. As amostras permaneceram na estufa à 28 °C durante o tempo de crescimento determinado em cada experimento (12h ou 36h), sem reposição do meio de cultura. As condições de preparo serão explicadas em cada experimento no capítulo 4 desta tese.
Figura 2.3: Placas de Petri contendo substratos planos de InP e inóculo da X. fastidiosa para posterior análise de amostras secas. Célula líquida de teflon contendo nanofios de InP e inóculo da X. fastidiosa. Após a inoculação, a célula líquida foi coberta com uma lamínula de vidro com 0,16 mm de espessura.
2. Materiais e Métodos 34
passaram por um preocesso de limpeza em ultrassom, com acetona, isopropanol e água deionizada (DI) durante 15 min cada. Os substratos planos de InP utilizados e as células líquidas também passaram pelo mesmo processo de limpeza em ultrassom. Os nanofios de InP foram reutilizados em diferentes experimentos, então passaram por um processo de limpeza com álcool 70%, água DI e em seguida forma imersos numa solução de Tween 20 1:20 por 30 min; por fim foram lavados com água DI e passaram por limpeza com acetona (70 °C), isopropanol e água DI. Por fim, todos os substratos planos, nanofios, células líquidas e as lamínulas de vidro passaram por secagem em fluxo de 𝑁2 e por limpeza em
plasma de 𝑂2 (100 mTorr, 50 ssccm e 200W) durante 10 min. Antes da inoculação, todos
os componentes utilizados foram esterilizados em UV durante 30 min.
2.1.3
Solução de N-Acetilcisteína:
Foram preparadas soluções de NAC (Sigma-Aldrich, MW=163,19) em PW na concentração 20 mg/ml. O pH da solução foi ajustado para 6,8 com solução de NaOH 1M. Em seguida, a solução foi filtrada com filtro Milipore contendo poros com 0,22 𝜇𝑚 de diâmetro. Por fim, as soluções foram diluídas em concentrações menores (entre 2 mg/ml e 20 mg/ml). Após o cultivo das bactérias e o tempo de crescimento necessário para cada experimento, o meio líquido foi removido e foi adicionada a solução com NAC. Neste trabalho foram feitos experimentos com amostras in vitro, em meio líquido, para medidas em tempo real do efeito do NAC em bactérias cultivadas sobre nanofios e sobre substratos planos de InP), e com amostras secas, para medidas de microscopia de força atômica e medidas de microscopia de fluorescência (após marcação fluorescente do EPS, por exemplo). A adição de NAC e a preparação das amostras controles correspondentes serão explicados para cada experimento no capítulo 4 desta tese.
2.1.4
Marcação de EPS:
Foi feita marcação do carboidrato N-Acetilglucosamina (NAG), presente na camada de peptideoglicano das bactérias e no EPS, com a lectina específica aglutinina de germe de trigo (WGA, do inglês Wheat Germ Agglutinin), conjugada com o fluoróforo Texas Red. A marcação foi feita de acordo com o protocolo usado por Janissen et al.[18]. As amostras (substratos planos de InP contendo X. fastidiosa com e sem tratamento com NAC) foram passivadas com uma solução de BSA à 1% em tampão fosfato salino (PBS) durante 5 min, depois foram lavadas com PBS e foram incubadas durante 10 min em
DI autoclavada. O pH da solução foi ajustado para 7,4. Por fim, a solução foi filtrada com filtro Milipore 0,22 𝜇𝑚.
2.2
Microscopia de Fluorescência
O microscópio de fluorescência detecta a luz emitida por moléculas (fluorófo-ros) após serem excitadas por um determinado comprimento de onda. Quando uma mo-lécula fluorescente absorve um fóton, ocorre transição eletrônica do estado fundamental para um estado excitado. A emissão de luz ocorre quando os elétrons excitados retornam para o nível energético fundamental. Antes da emissão fluorescente ocorrem outros pro-cessos radiativos e não radiativos (como conversão interna e relaxação vibracional, onde há decaimento entre os estados vibracionais no nível eletrônico excitado) que levam à perda da energia absorvida. A luz emitida apresenta comprimento de onda maior que a luz incidente, e portanto menor energia. A diferença entre os comprimentos de onda da radiação incidente e da radiação emitida é conhecida como deslocamento de Stokes [134–136].
A Figura 2.4 (a) apresenta um diagrama de Jablonski indicando um exem-plo de transição entre os níveis eletrônicos de singleto 𝑆0 (nível fundamental) e 𝑆2 (nível
excitado), após a absorção de um fóton; incluindo processos de conversão interna, onde o elétron decai para o primeiro nível excitado 𝑆1 e processos de relaxação vibracional e
posterior emissão de fluorescência (a qual ocorre em escala de tempo de nano segundos). Além das transições indicadas, podem ocorrer cruzamento intersistema, quando os elé-trons passam para o estado tripleto e um elétron decai para o nível fundamental singleto, emitindo luz (fosforescência). No entanto, por ser uma transição proibida, esta ocorre em uma escala de tempo maior que a fluorescência (em geral > 𝜇𝑠). A emissão de fluores-cência e suas propriedades (como absorção, emissão, tempo de vida e eficiência quântica) dependem da estrutura molecular do fluoróforo [136].
2. Materiais e Métodos 36
autofluorescência, ou podem ser modificadas com fluoróforos extrínsecos. Existem diversos tipos de fluoróforos, que podem ser proteínas fluorescentes, quantum dots ou marcadores específicos (por exemplos compostos com anéis aromáticos) que são ligados quimicamente às moléculas de interesse [134]. A Figura 2.4 (b) apresenta os espectros de absorção e emissão normalizados do GFP, o qual tem um máximo de absorção em ≈ 488 nm e máximo de emissão em ≈ 510 nm, e do Texas Red (com máximo de absorção em 596 nm e máximo de emissão em 615 nm) [137], que foram utilizados neste trabalho.
Figura 2.4: (a) Diagrama de Jablonski apresentando um exemplo de transição entre ní-veis eletrônicos (do nível fundamental 𝑆0 para o nível excitado 𝑆2, com posterior perda
de energia e retorno do elétron para o nível fundamental, levando à emissão de luz (fluo-rescência). Modificado de [136]. (b) Espectros de absorção e emissão normalizados para o GFP e para o Texas Red. Dados obtidos em [137].
Em geral, o microscópio de fluorescência tem uma fonte de luz de excitação e métodos de detecção que permitem selecionar a faixa de comprimentos de ondas emitidos pelo fluoróforo. Existem diferentes configurações de microscópios de fluorescência, que dependem das propriedades que serão investigadas nas amostras. Essas configurações vão desde microscópios convencionais de campo amplo (WFM, do inglês wide field fluorescence
microscope) a microscópios confocais, como CLSM (do inglês Confocal Laser Scanning Microscope) e outros tipos de configurações como confocais spinning disk e microscópios
de super-resolução. Neste trabalho utilizamos WFM e CLSM, cujas características serão descritas a seguir. A Figura 2.5 apresenta os principais componentes dos 2 tipos de microscópios.
Figura 2.5: (a) Representação esquemática do microscópio WFM, indicando a fonte de luz (lâmpada), filtros de excitação e de emissão, objetiva e espelho dicróico; (b) representação esquemática do microscópio CLSM, indicando o laser (fonte de iluminação), scanner para varredura nas direções x e y, sistema de controle no eixo z, espelho dicróico, pinhole e fotomultiplicadora. Adaptado de [138].
2.2.1
Microscópio de fluorescência de campo amplo (WFM):
O WFM é formado por uma fonte de luz branca, um cubo de filtros, contendo um filtro de excitação, que seleciona uma faixa de comprimentos de onda específica para excitar o fluoróforo de interesse, um espelho dicroico (que permite a reflexão de luz com menores comprimentos de onda e transmissão para maiores comprimentos de onda), e um filtro de emissão para selecionar os comprimento de onda da fluorescência emitida pela amostra. Outros componentes como diafragma e filtros de densidade neutra são inseridos no caminho óptico da luz incidente.
A configuração mais comum é o microscópio de epifluorescência, onde a mesma objetiva é usada para iluminar a amostra e para a formação da imagem. Neste tipo de microscopia, a amostra é iluminada em todos os pontos de um determinado volume si-multaneamente. A resolução nas direções xy é determinada pelo limite de difração, que depende da abertura numérica da objetiva (NA) e do comprimento de onda de excitação (𝜆). Na direção z, o objeto estará em foco apenas se sua espessura (direção z) não ultra-passar a profundidade de foco da objetiva. Se essa condição não for satisfeita (em geral para componentes mais espessos da amostra), a imagem formada conterá informações da luz emitida por planos que estão fora do plano focal.
2. Materiais e Métodos 38
Usamos um microscópio de epifluorescência wide-field invertido, modelo Nikon, TE200U, USA. A fonte de excitação é uma lâmpada de mercúrio 150 W. Para uma detecção sensível, este microscópio é acoplado a uma câmera EMCCD IXON (Andor, Ireland) com 1024 x 1024 pixels. Usamos a objetiva de 60x com imersão em água. Para excitação do GFP da bactéria usamos um filtro de emissão na região azul e para as medidas de fluorescência, usamos o filtro de emissão na região verde.
2.2.2
Microscopia confocal de varredura à laser (CLSM):
No CLSM a amostra é iluminada por um feixe de laser focalizado em um determinado ponto da amostra. A imagem é adquirida em planos focais, através de seccionamento ótico, onde o feixe é focalizado em diferentes profundidades, com controle de posicionamento na direção z. O elemento fundamental no microscópio confocal é o
pinhole, que é uma abertura que impede, no sistema de detecção, a passagem de luz
emitida por pontos da amostra fora do plano focal que está sendo medido. A formação da imagem a partir de um slice ótico é feita em 3 etapas principais: 1- varredura pixel por pixel com o feixe de laser focalizado, que é defletido nas direções x e y por scanners, diferentemente da microscopia convencional, onde um volume da amostra é iluminado e a fluorescência emitida por todo o volume é medida; 2- detecção da fluorescência emitida pela amostra pixel por pixel, com o auxílio do pinhole; este processo de detecção é feito por uma fotomultiplicadora; 3- digitalização dos sinais recebidos da fotomultiplicadora e formação da imagem. Assim, a qualidade da imagem formada não depende apenas dos componentes óticos do microscópio, mas também do tamanho da abertura (pinhole), da digitalização do sinal (determinando o tamanho do pixel) e do ruído [138, 139]. A resolução espacial do microscópio depende do comprimento de onda de excitação (𝜆) e da abertura numérica da objetiva (NA), que depende do índice de refração do meio (𝑛) e do seno do ângulo de abertura (𝜃). Pelo limite de difração de Abbe, 𝑑𝑥,𝑦 =
𝜆
2𝑁𝐴 e
𝑑𝑧 = 2𝜆
𝑁 𝐴2. Assim quanto maior a abertura numérica da objetiva, maior a resolução.
Para evitar a perda de informação nas imagens adquiridas, a conversão do sinal obtido na fotomultiplicadora deve estar de acordo com o teorema de Nyquist, que estabelece que a frequência de amostragem deve ser maior que o dobro da frequência do sinal original. Isto implica que o intervalo de varredura de um sinal periódico é metade do período do espaçamento das estruturas a serem resolvidas [138]. Em outras palavras, no
𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙𝑠
𝑛𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙𝑠 é o número de pixels, 𝑧𝑓 é o zoom factor e M é a magnificação da objetiva. A
amostragem correta deve ser utilizada para evitar oversampling e undersampling, levando à perda de informação, como é ilustrado na Figura2.6 [138].
Figura 2.6: Ilustração das condições de amostragem: oversampling, amostragem correta e undersampling [138].
Outro ponto importante na microscopia confocal é que como a imagem é ad-quirida em planos focais determinados no seccionamento óptico do objeto, é possível a obtenção de imagens 3D a partir da aquisição de diferentes planos na direção z. Essa aquisição é feita em z-stacks que depois são renderizados para formação da imagem 3D. O tamanho da abertura do pinhole determinará a espessura do slice ótico; quanto menor a abertura, menor a espessura do seccionamento ótico e maior é o grau de confocalidade da amostra. Além disso, no CLSM temos resolução espectral tanto na excitação como
∗𝐹 𝑊 𝐻𝑀
𝑙𝑎𝑡 (do inglês, Full Width of Half Maximum) corresponde à largura na metade da altura
máxima da intensidade da PSF (do inglês, Point Spread Function) que corresponde ao padrão de difração de um objeto pontual. A imagem formada corresponde à convolução do objeto e da PSF associada. O padrão de difração é formado por um disco com maior intensidade (disco de Airy) e anéis concêntricos com menor intensidade. A largura do disco de Airy está associada à resolução lateral, de acordo com o critério de resolução de Rayleigh em que a distância mínima na qual dois objetos podem ser resolvíveis ocorre quando o máximo do disco de Airy de um dos objetos coincide com o primeiro mínimo do padrão de difração do segundo objeto. [140]
