Métodos de processamento e análise das imagens:

Como foi discutido anteriormente, o centro (x,y) dos nanofios deve ser locali- zado em cada frame para o cálculo dos deslocamentos. Usamos dois métodos diferentes para a localização do centro nas análises dos vídeos adquiridos: o primeiro método usa a determinação geométrica do centro e o segundo método é através de um ajuste gaussiano 2D ao perfil de intensidade de reflexão do laser medido em cada frame.

No primeiro método, foi usado o software Fiji Image J. As etapas de processa- mento das imagens são ilustradas na Figura3.3. Primeiramente é feito um ajuste de brilho e contraste, seguido por um processamento smooth, que consiste num filtro que substitui cada pixel por uma média calculada nos pixels vizinhos numa matriz 3x3. Em seguida a imagem é transformada em uma imagem binária (usando o método de segmentação de Otsu, por exemplo) [160]. Em alguns casos é necessário usar o processamento watershed, que é um método de segmentação para separar regiões que permaneceram unidas após a formação da imagem binária. Por fim é selecionado um ROI (do inglês, region of interest) contendo cada nanofio que será analisado. Então, a localização do centro de cada nanofio

Figura 3.3: Etapas de processamento e análise das imagens efetuadas no software Fiji Image J, mostrando a imagem original sem processamento, a imagem smoothed e a imagem binária correspondente. Na etapa final é feita seleção de ROI e análise com o plugin

Analyze particles.

A Figura 3.4 a seguir apresenta os resultados obtidos para os deslocamentos de nanofios em vídeos adquiridos com as três taxas de varredura: 0,2, 0,8 e 2,5 MHz. A Figura3.4 (a) mostra os valores de deslocamento obtidos para 100 frames de uma nanofio analisado para cada taxa de varredura. A Figura 3.4 (b) apresenta as distribuições dos valores obtidos em 100 frames para 4 nanofios em cada taxa de varredura. Nota-se que o primeiro grupo de dados (para a taxa de varredura 0,2 MHz) apresentou variação significativa em relação aos outros grupos com ‘p-value menor que 0,0001. No entanto, não há variação significativa entre os grupos com 0,8 e 2,5 MHz.

O segundo método utilizado para a localização do centro dos nanofios foi a aplicação de um ajuste gaussiano 2D ao perfil de intensidade de reflexão do laser em cada nanofio. O ajuste foi feito a partir de um script feito em Python para as análises dos vídeos, obtenção dos valores do centro dos nanofios e cálculos dos deslocamento e ângulos correspondentes. A Figura 3.5 apresenta ajustes gaussianos 1D e 2D realizados no perfil de intensidade dos nanofios. A Figura3.5 (a) apresenta uma imagem de reflexão obtida no CLSM com seleção de ROI para o fitting gaussiano. (b) A Figura3.5 (b) mostra um

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Figura 3.4: (a) Valores dos deslocamentos do topo dos nanofios obtidos a partir da locali- zação geométrica do centro para frames sequenciais, realizada com o software Image J. Os dados obtidos correspondem a vídeos adquiridos com três taxas de varredura diferentes (0,2, 0,8 e 2,5 MHz).(b) Box plots comparando as distribuições estatísticas dos valores de deslocamentos obtidos para 4 nanofios, a partir da análise de 100 frames para cada um, nas três taxas de varredura analisadas. Para comparação dos resultados foi feita uma análise estatística one-way ANOVA com subsequente teste Tukey post hoc. Os asteriscos (****) indicam que o grupo com taxa de varredura 0.2 MHz apresentou valores significa- tivamente diferentes dos outros grupos, com p<0,0001. Já os grupos com taxas 0,8 MHz e 2,5 MHz não apresentaram variação significativa entre si.

pode ser ajustados por uma distribuição gaussiana. A Figura 3.5 (c) apresenta os dados de intensidade obtidos pela cross section apresentada em (a), com ajuste gaussiano 1D. O ajuste gaussiano 2D realizado para os valores de intensidade é apresentado em (d).

A análise com o ajuste gaussiano 2D foi feita para os mesmos nanofios ana- lisados anteriormente com o Image J. Os resultados obtidos para os deslocamentos são apresentados na Figura 3.6. Neste caso, os dados obtidos para as três taxas de varredura são significativamente diferentes, ou seja, a análise com ajuste gaussiano possibilita a lo- calização do centro com maior precisão em relação à análise geométrica feita no Image J.

Os deslocamentos medidos aumentam com o aumento da taxa de varredura. Para os nanofios usados neste trabalho, a constante elástica k é ≈ 0, 2𝑁𝑚−_{1 e a frequência}

de ressonância no ar pode ser estimada em ≈ 10 MHz [127]. Para oscilações em meio líquido, a frequência de ressonância cai por um fator de 3-5 [161]. Assim com o aumento da frequência de varredura, nos aproximamos da frequência de ressonância (que pode ser excitada termicamente) dos nanofios e maiores amplitudes são medidas. Dessa forma, atribuímos o aumento medido para os deslocamentos à vibração térmica dos nanofios.

Figura 3.5: (a) Imagem de reflexão do laser no topo dos nanofios obtida no CLSM. (b)

Plot 3D do perfil de intensidade para um spot correspondente a um nanofio na imagem

sem processamento. (c) Ajuste gaussiano 1D para o perfil de intensidade obtido pela

cross section indicada em (a). (d) Plot 3D do ajuste gaussiano 2D feito para o perfil de

intensidade apresentado em (b). O ajuste foi feito a partir de um script em Python.

Figura 3.6: (a) Valores dos deslocamentos do topo dos nanofios obtidos a partir da locali- zação do centro para frames sequenciais, usando o ajuste gaussiano 2D. Os dados obtidos correspondem a vídeos adquiridos com três taxas de varredura diferentes (0,2, 0,8 e 2,5 MHz).(b) Box plots comparando as distribuições estatísticas dos valores de deslocamentos obtidos para 4 nanofios, a partir da análise de 100 frames para cada um, nas três taxas de varredura analisadas. Para comparação dos resultados foi feita uma análise estatística

one-way ANOVA com subsequente teste Tukey post hoc. Os asteriscos (****) indicam que

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Para as medidas com menor pixel dwell time e portanto maior frequência de varredura, obtemos maiores valores para os deslocamentos dos nanofios. Já para as medidas com maior pixel dwell time (e menor frequência de varredura) é feita um média temporal na posição dos nanofios devido às oscilações térmicas, levando a menores valores para as amplitudes medidas. A Figura 3.7 (a) apresenta um gráfico polar com as amplitudes e direções dos deslocamentos medidos com o ajuste gaussiano. Os deslocamentos são isotrópicos, como esperado para oscilações induzidas termicamente.

Para checar esta hipótese, o Dr. Richard Janissen, um dos colaboradores neste trabalho, realizou análise de variância de Allan (e desvio de Allan) para avaliar os tipos de ruídos associados às vibrações [127]. Nota-se na Figura 3.7 (b) que de fato os deslocamentos medidos estão associados a vibrações térmicas, de acordo com o slope da curva.

Figura 3.7: (a) Gráfico polar apresentando as amplitudes e direções dos deslocamentos dos nanofios medidos com o ajuste gaussiano 2D para as três taxas de varredura. São apresentados 100 frames para cada frequência. (b) Gráfico de desvio de Allan mostrando que os deslocamentos medidos correspondem a oscilações induzidas por excitação térmica. Também foram feitas medidas similares em ar (Figura 3.8) para comparar os resultados dos deslocamentos dos nanofios com os resultados obtidos nas medidas realizadas em meio líquido. A Figura3.8(a) apresenta os valores de deslocamentos obtidos para 100 frames para as medidas realizadas com a menor e a maior taxas de varreduras (0,2 MHz e 2,5 MHz) utilizadas na medidas feitas em meio líquido. Os resultados obtidos são similares aos do meio líquido, no entanto os valores de deslocamentos obtidos com a maior taxa de varredura são maiores em ar. Os deslocamentos também são isotrópicos, como mostra a Figura 3.8 (b), indicando oscilações termicamente induzidas. A Figura

Figura 3.8: (a) Deslocamentos do topo dos nanofios, obtidos com ajuste gaussiano, para medidas realizadas em ar com taxas de varredura de 0.2 MHz e 2,5 MHz. Os dados foram obtidos a partir de 100 frames para cada caso. (b) Gráfico polar mostrando a magni- tude e a direção dos deslocamentos obtidos nas duas medidas. (c)Box plot comparando os resultados obtidos em PW e em ar para as taxas de varredura 0.2 MHz e 2,5 MHz. Os asteriscos(****) indicam que os grupos para as medidas em ar e PW com 2,5 MHz apresentam variação com 𝑝 < 0, 0001. Os grupos em ar e PW não apresentaram varia- ção significativa para as medidas com 0.2 MHz. (d) Desvio de Allan mostrando que os deslocamentos medidos correspondem a oscilações térmicas.

É esperado que, nas medidas com 2,5 MHz, os deslocamentos dos nanofios em ar sejam mais altos que os deslocamentos em PW, pois em meio líquido há maior dissipação de energia por forças hidrodinâmicas em sentidos opostos ao movimento dos nanofios. Nas medidas com 0,2 MHz, o pixel dwell time é maior, então as posições dos nanofios são obtidas em uma média temporal, levando à detecção de baixas amplitudes Isto ocorre tanto nas medidas em ar quanto nas medidas em líquido, assim não há variação significativa entre esses dois grupos. Esses resultados juntamente com a análise de desvio

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de Allan também mostram que os deslocamentos medidos estão relacionados a oscilações térmicas.

Este resultado foi aplicado nas medidas posteriores realizadas neste trabalho, relacionadas às medidas de forças de adesão da bactéria X. fastidiosa. Usamos a menor frequência de varredura (0,2 Hz) para medir menores amplitudes relacionadas às oscilações térmicas e diferenciar os deslocamentos medidos no topo dos nanofios controles e dos nanofios com bactérias aderidas. Além disso, usamos o ajuste gaussiano como método para localização do centro dos nanofios.