3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.5 Estudo da influência de sal e nitrito no crescimento de bactérias ácido lácticas em presunto
Nesta etapa, foi realizado um planejamento experimental 22, com duplicata no ponto central, conforme Tabela 2.3. Neste estudo, variou-se as concentrações de sal e nitrito e avaliou- se o seu efeito no crescimento de bactérias presentes nas massas de presunto formulados em laboratório.
A partir da análise das curvas de crescimento, os parâmetros de crescimento A, λ e µ foram obtidos. Os resultados são apresentados nas Tabelas 3.5.1 e 3.5.2 para 5 e 10ºC, respectivamente. No caso dos experimentos A, B e E, os parâmetros de crescimento foram obtidos pelo Modelo de Gompertz Modificado. Entretanto, nos experimentos C e D, a curva de crescimento apresentava uma fase lag muito extensa, dificultando a aplicação deste modelo. Nestes dois casos, foi utilizado o Modelo de Monod, que fornece o valor da velocidade específica máxima de crescimento pela inclinação da curva ln (N/N0) x tempo, e fornece ainda a população
máxima atingida e o valor da fase lag. Como o modelo não se ajusta à toda curva de crescimento, não é apresentado o r2 para o Modelo de Monod.
Tabela 3.5.1. Resultados para o planejamento fatorial 22 com ponto central, para a temperatura de 5ºC.
Valores
codificados Valores reais Variáveis resposta Sal Nitrito Sal (%)
Nitrito (ppm) [logUFC/g]A µ [dias -1] λ [dias] r2 A 0 0 2,3 200 6,59 0,32 6,38 0,969 A 0 0 2,3 200 7,15 0,39 4,39 0,987 B -1 +1 0,6 400 3,73 0,22 7,90 0,954 C +1 -1 4,0 0 4,00 0,20 40,00 D +1 +1 4,0 400 1,00 0 45,00 E -1 -1 0 0 7,11 0,98 17,16 0,982
Tabela 3.5.2. Resultados para o planejamento fatorial 22 com ponto central, para a temperatura de 10ºC.
Valores
codificados Valores reais Variáveis resposta Sal Nitrito Sal (%)
Nitrito
(ppm) [logUFC/g]A µ [dias-1] λ [dias] r2
A 0 0 2,3 200 5,54 2,11 4,06 0.986 A 0 0 2,3 200 6,25 1,95 5,10 0.994 B -1 +1 0,6 400 3,69 0,41 11,51 0.965 C +1 -1 4,0 0 4,89 0,60 3,00 D +1 +1 4,0 400 1,00 0 45,00 E -1 -1 0 0 7,36 0,35 0 0,957
Os resultados das Tabelas acima foram submetidos à análise de variância e estimativa dos efeitos através do software STATISTICA 6.0. Os fatores foram considerados estatisticamente significativos quando p teve um valor menor que 0,10, ou seja, com nível de significância de 90%. As Tabelas 3.5.3 e 3.5.4 apresentam os resultados da análise estatística.
Tabela 3.5.3. Análise de variância e estimativa dos efeitos para as variáveis-respostas estudadas a 5ºC.
Variáveis Resposta – 5ºC
A (logUFC/g) µ (µ (diasµ (µ ( -1) λ λ λ λ (dias)
Fatores
Efeito Valor - p Efeito Valor - p Efeito Valor - p (1) Sal -2,92351 0,084296 -0,50391 0,069146 29,96769 0,029838 (2) Nitrito -3,19164 0,077287 -0,4776 0,072923 -2,12786 0,371636 (1) por (2) 0,191642 0,708835 0,277601 0,124404 7,127859 0,123948 Tabela 3.5.4. Análise de variância e estimativa dos efeitos para as variáveis-respostas estudadas a
10ºC.
Variáveis Resposta – 10ºC
A (logUFC/g) µ (µ (diasµ (µ ( -1) λ λ λ λ (dias)
Fatores
Efeito Valor - p Efeito Valor - p Efeito Valor - p (1) Sal -2,5819 0,0825 -0,07735 0,616736 18,24660 0,025649 (2) Nitrito -3,7781 0,0565 -0,27265 0,249274 26,75340 0,017498 (1) por (2) -0,1119 0,7956 -0,32735 0,21086 15,24660 0,030688
Para a temperatura de 5ºC, pode-se observar que, para as variáveis resposta A e µ, ambos os fatores apresentaram efeito significativo. Porém, não houve interação entre os fatores para estas variáveis respostas. Para o parâmetro λ - duração da fase lag, o fator que apresentou efeito
significativo foi a concentração de sal. Tais resultados são mais facilmente visualizados através das superfícies de resposta e curvas de nível construídas para cada uma das variáveis resposta (Figura 3.5.2, 3.5.3 e 3.5.4 para as variáveis respostas A, µ e λ, respectivamente).
2,068 2,735 3,402 4,07 4,737 5,404 6,071 6,738 7,405 8,072 above
Fitted Surface; Variable: A 2**(2-0) design; MS Pure Error=,1516207
DV: A 2,068 2,735 3,402 4,07 4,737 5,404 6,071 6,738 7,405 8,072 above
Fitted Surface; Variable: A 2**(2-0) design; MS Pure Error=,1516207
DV: A SAL N IT R IT O -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Figura 3.5.2. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta A – densidade populacional máxima, à temperatura de 5ºC.
Na curva de nível para a variável A (Fig. 3.5.2) observa-se que o seu valor aumenta à medida que as concentrações de sal e de nitrito diminuem, ou seja, um aumento da concentração dos sais de cura causa uma redução de aproximadamente 3% para este parâmetro (Tabela 3.5.3).
A equação do modelo da superfície de resposta e da curva de nível para a variável resposta A é apresentada a seguir (Eq. 3.5.1):
A =4,9322 - 1,4617*sal - 1,5958*nitrito (Eq. 3.5.1)
Pode-se considerar que, como o final da vida-de-prateleira é atingida para populações superiores a 107 UFC/g (ou seja, A>7) poder-se-ia recomendar faixas de nitrito acima de 280 ppm e sal acima de 2,8 %. Entretanto, para a variável sal, deve ser feita uma avaliação organoléptica. No caso do nitrito, esta faixa está dentro da recomendada pela legislação – permitindo até 150 ppm residual.
0,072 0,179 0,286 0,394 0,501 0,608 0,715 0,822 0,929 1,036 above
Fitted Surface; Variable: M 2**(2-0) design; MS Pure Error=,0030193
DV: M 0,072 0,179 0,286 0,394 0,501 0,608 0,715 0,822 0,929 1,036 above
Fitted Surface; Variable: M 2**(2-0) design; MS Pure Error=,0030193
DV: M SAL N IT R IT O -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Figura 3.5.3. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta µ – velocidade específica máxima de crescimento, à temperatura de 5ºC.
As equações dos modelos das superfícies de respostas e das curvas de níveis para as variáveis respostas µ (Eq. 3.5.2) e λ (Eq. 3.5.3), para a temperatura de 5ºC, são apresentadas a
seguir:
µ µµ
µ=16,9876 + 24,6980*sal - 25,1888*nitrito (Eq. 3.5.2) λ λ λ λ =20,1393 + 14,9838*sal (Eq. 3.5.3) -0,048 4,155 8,357 12,559 16,761 20,964 25,166 29,368 33,571 37,773 above
Fitted Surface; Variable: L 2**(2-0) design; MS Pure Error=1,975665
DV: L -0,048 4,155 8,357 12,559 16,761 20,964 25,166 29,368 33,571 37,773 above
Fitted Surface; Variable: L 2**(2-0) design; MS Pure Error=1,975665
DV: L SAL N IT R IT O -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Figura 3.5.4. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta λ – duração da fase lag de crescimento (dias-1), à temperatura de 5ºC.
Quanto menor a concentração dos sais de cura em um produto, mais rápido o crescimento microbiano, já que estes agentes retardam o desenvolvimento dos microrganismos. Este fato está comprovado na Figura 3.5.3, onde mostra que, ao reduzir o valor da concentração de sal e de nitrito, ocorre um favorecimento do crescimento, ou seja, aumenta a velocidade específica máxima. Observa-se que, nas mesmas faixas de sal e nitrito recomendadas para a variável resposta A (sal >2,8% e nitrito > 280 ppm), a variável resposta µ apresentaria valores abaixo da metade do máximo alcançado, o que seria bastante favorável. Para a variável λ, como pode ser confirmado na Fig. 3.5.4, apenas a concentração de sal é significativa, também observando-se faixas mais favoráveis para a concentração de sal > 2,8%. Para esta variável, observou-se um aumento no seu valor em aproximadamente 30% quando a concentração de sal passou de um nível inferior para o superior.
Para a temperatura de 10ºC, a variável resposta A apresentou valores significativos tanto para a concentração de sal quanto para a concentração de nitrito com valores de 2,5% e 3,7%, respectivamente, quando estes passaram de um nível inferior para um superior. Estes efeitos podem ser visualizados na Figura 3.5.5. Na curva de nível para esta variável (Fig. 3.5.5) observa- se que o seu valor aumenta à medida que as concentrações de sal e de nitrito diminuem, ou seja, um aumento da concentração dos sais de cura causa uma redução de 2,5% para a concentração de sal e 3,8% para a concentração de nitrito, para este parâmetro (Tabela 3.5.4). No caso da variável A, percebe-se uma diminuição deste valor a partir da concentração de 2,3% de sal associado a 200 ppm de nitrito.
Analisando-se a Tabela 3.5.4, para a temperatura de 10ºC, observa-se que para o parâmetro λ, tanto a concentração de sal e de nitrito, quanto a interação entre eles apresentaram efeitos significativos. Analisando-se esta variável, verifica-se uma estimativa de aumento de seu valor em 18% para a concentração de sal e 26% para a concentração de nitrito, quando estes fatores passaram de um nível inferior para um nível superior. Estes resultados podem ser visualizados através da curva de nível construída para a variável resposta λ na Figura 3.5.6. Assim como a 5ºC, nota-se que os maiores valores da fase lag são para a concentração de sal a 2,8% associado a 280 ppm de nitrito.
1,626 2,319 3,013 3,707 4,401 5,095 5,788 6,482 7,176 7,87 above
Fitted Surface; Variable: A 2**(2-0) design; MS Pure Error=,113288
DV: A 1,626 2,319 3,013 3,707 4,401 5,095 5,788 6,482 7,176 7,87 above
Fitted Surface; Variable: A 2**(2-0) design; MS Pure Error=,113288
DV: A SAL N IT R IT O -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Figura 3.5.5. Superfície de resposta e curva de nível para a variável resposta A (logUFC/g), à temperatura de 10ºC. 0,277 5,192 10,106 15,021 19,935 24,85 29,764 34,679 39,593 44,508 above
Fitted Surface; Variable: L 2**(2-0) design; MS Pure Error=,541008
DV: L 0,277 5,192 10,106 15,021 19,935 24,85 29,764 34,679 39,593 44,508 above
Fitted Surface; Variable: L 2**(2-0) design; MS Pure Error=,541008
DV: L SAL N IT R IT O -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
Figura 3.5.6. Superfície de resposta e curva de nível para a variável resposta λ −duração da fase lag (dias), à temperatura de 10ºC.
As equações dos modelos das superfícies de respostas e das curvas de níveis para as variáveis respostas Α (Eq. 3.5.4) e λ (Eq. 3.5.5), para a temperatura de 10ºC, são apresentadas a
seguir:
λ λλ
λ = 11,4445+ 9,1233*sal + 13,3767*nitrito + 7,6233*sal*nitrito (Eq. 3.5.5)
Conclui-se que pode-se recomendar faixas de nitrito acima de 280 ppm e sal acima de 2,8%, já que o final da vida-de-prateleira é atingida para populações superiores a 107 UFC/g (ou seja, A>7), se o produto for armazenado à 5ºC. Entretanto, para a variável sal, deve ser feito uma avaliação organoléptica. No caso do nitrito, esta faixa está dentro da recomendada pela legislação – permitindo 150 ppm residual - e dentro da faixa atualmente utilizada pela indústria. Observa-se que, nas mesmas faixas de sal e nitrito recomendadas para a variável resposta A (sal >2,8% e nitrito > 280 ppm), a variável resposta µ apresentaria valores abaixo da metade do máximo alcançado, o que seria bastante favorável. Para a variável λ, como pode ser confirmado na Fig. 4, apenas a concentração de sal é significativa, também observando-se faixas mais favoráveis para a concentração de sal > 2,8%.
Apesar de se obter bons resultados de vida-de-prateleira nas faixas de sal acima de 2,8% e nitrito acima de 280 ppm, deve-se ressaltar a importância do abaixamento da temperatura de estocagem, pois sabe-se que altas concentrações de nitrito e de sal podem afetar a saúde do consumidor.
As equações (3.5.6) e (3.5.7) demonstram a relação entre a temperatura de estocagem com a duração da fase lag e a velocidade específica máxima de crescimento. A equação (3.5.6) foi obtida pela substituição dos valores apresentados na Tabela 2 (pg. 57) na equação 9 (pg. 56) e a equação (3.5.7) foi obtida pela substituição dos valores apresentados na Tabela 4 e na equação 12, ambos na página 59.
- λ =-3,3042+(0,0676)*T Eq (3.5.6)
µ =0,2183+(0,0571)*T Eq. (3.5.7)
Por exemplo, se a temperatura de estocagem for de 3ºC a duração da fase lag seria de aproximadamente 11 dias e o valor de µ−velocidade específica máxima de crescimento, seria de 0,15 dias-1. Considerando-se uma população inicial de 102, o tempo necessário para se atingir a vida de prateleira passaria de 51 dias a 5ºC para 75 dias a 3ºC, o que permitiria cumprir a vida- de-prateleira, sendo esta de 60 dias, sem o uso excessivo de conservantes.