PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
LILIAN DUTRA FERREIRA
UTILIZAÇÃO DA MICROBIOLOGIA PREDITIVA NA AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM PRESUNTO FATIADO
Florianópolis 2004
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UTILIZAÇÃO DA MICROBIOLOGIA PREDITIVA NA AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS EM PRESUNTO FATIADO
Dissertação de Mestrado em Engenharia de Alimentos para obtenção do título de Mestre em Engenharia de Alimentos
Universidade Federal de Santa Catarina Centro Tecnológico
Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Pós-graduação em Engenharia de Alimentos
___________________________________ Profa. Dra. Gláucia M. Falcão Aragão Orientadora e Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos
Banca Examinadora:
___________________________________ Profa. Dra. Gláucia M. Falcão Aragão
___________________________________ Profa. Dra. Pilar Rodriguez de Massaguer
___________________________________ Prof. Amauri Rosenthal
___________________________________ Prof. Dra. Sandra R. S. Ferreira (suplente)
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Agradeço a Deus, por ter me dado saúde e serenidade para cumprir mais esta etapa da minha vida.
À Professora Gláucia M. Falcão Aragão pela orientação, apoio, e incentivo. Tenho em você uma grande amiga.
Às minhas bolsistas, Adriane Maranho, Cristiane da Costa, e por alguns meses a Edilaine Monara dos Santos, pela dedicação, responsabilidade e imensurável contribuição para a realização deste trabalho. A participação, as idéias e o alto astral de vocês foram muito importantes para a concretização desta idéia.
Às amigas especiais, Carol e Adriana, pelo carinho e compreensão nos muitos momentos de alegria e, como amigas do peito que são, também nos momentos de tristeza e dúvida.
Aos colegas do Laboratório de Engenharia Bioquímica (ENGEBIO), Fernanda Streit, Francielo, Vanessa, Mônica, Murilo, Ernandes, Renato, Rafael, Érika, Suzane, Fernanda Koch, e Cíntia Maria, pela amizade e auxílio no ambiente de laboratório.
Ao meu pai, Ronaldo; à minha querida mãe, Elza; ao meu filho Bruno, que tanto me alegrou nos momentos de dificuldade; e aos meus irmãos, Cláudia, Karina e Ronaldo. Muito obrigado pelo auxílio e compreensão nos inúmeros momentos que pudemos partilhar juntos. Sem esse valioso incentivo eu não teria alcançado muitos dos meus sonhos.
Ao Moacir, que é minha inesgotável fonte de incentivo e motivação. O seu amor, carinho e compreensão nos momentos difíceis sempre foram essenciais para que eu seguisse firme o meu caminho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS... vi
LISTA DE TABELAS... vii
RESUMO... viii
ABSTRACT ... ix
INTRODUÇÃO ... 1
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
1.1. Microbiologia preditiva: histórico... 3
1.1.2 Objetivos e aplicações ... 6 1.2 Modelos preditivos ... 8 1.2.1 Modelos primários... 10 1.2.1.1 Modelo de Gompertz ... 11 1.2.2 Modelos secundários ... 12 1.2.3 Modelos terciários... 15 1.3 Bactérias ácido-lácticas ... 17 1.3.1 Produtos cárneos... 18
1.3.2 Principais alterações por bactérias lácticas ... 20
1.4 Vida-de-prateleira de produtos cárneos... 21
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 25
2.1 Bactérias ácido-lácticas ... 25
2.1.1 Meio de manutenção de Lactobacillus viridescens ... 25
2.1.2 Preparo do inóculo de Lactobacillus viridescens ... 25
2.1.3 Meio de crescimento... 25
2.2 Avaliação do crescimento de Lactobacillus viridescens em caldo MRS... 26
2.2.1 Avaliação do crescimento de Lactobacillus viridescens ... 26
2.2.1.1 Contagem de colônias ... 26
2.2.1.2 Absorbância e medição de pH... 26
2.3 Determinação dos parâmetros de crescimento de L. viridescens ... 28
2.3.1 Estimativa dos parâmetros de crescimento pelo modelo de gompertz modificado... 28
2.3.2. Fórmulas para calcular o erro... 28
2.3.3. Planejamento fatorial 32... 28
2.4 Avaliação do crescimento de bactérias ácido lácticas em presunto fatiado ... 30
2.4.1 Levantamento microbiológico das linhas de presunto... 30
2.4.2 Avaliação da vida-de-prateleira de presunto fatiado sob variação da formulação das massas... 32
2.4.2.1. Preparo das massas... 33
2.4.3 Acompanhamento da vida-de-prateleira dos presuntos fatiados formulados no laboratório... 35
2.4.4 Planejamento fatorial 22
com ponto central... 35
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 37
3.1 Avaliação do crescimento de bactérias ácido lácticas em presunto fatiado ... 39
3.1.1 Levantamento microbiológico das linhas de presunto... 39
3.2 Estudo do efeito do armazenamento de presunto fatiado embalado à vácuo em três temperaturas diferentes (5, 8 e 15ºC) sobre o crescimento de bactérias ácido lácticas... 42
3.3 Efeito da temperatura de estocagem (5, 8 e 15ºc) na velocidade específica máxima de crescimento e na duração da fase lag de bactérias ácido lácticas em presunto fatiado ... 51
3.4 Estudo da influência das concentrações de sal e nitrito sobre o crescimento de Lactobacillus viridescens em meio de cultura ... 65
3.5 Estudo da influência de sal e nitrito no crescimento de bactérias ácido lácticas em presunto fatiado ... 75
4. CONCLUSÕES E SUGESTÕES ... 82
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 84
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Esquema da metodologia utilizada para avaliação do crescimento de bactérias
ácido-lácticas. ... 27
Figura 2.2. Fluxograma do processo de fabricação de presunto fatiado... 31
Figura 3.1. Levantamento microbiológico da linha de presunto fatiado. ... 39
Figura 3.2. Acompanhamento do crescimento microbiano do presunto fatiado a 5º e 10ºC. ... 40
Figura 3.5.2. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta A – densidade populacional máxima, à temperatura de 5ºC... 77
Figura 3.5.3. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta µ – velocidade específica máxima de crescimento, à temperatura de 5ºC... 78
Figura 3.5.4. Superfície de resposta e curva de nível obtida para a variável resposta λ – velocidade específica máxima de crescimento, à temperatura de 5ºC... 78
Figura 3.5.5. Superfície de resposta e curva de nível para a variável resposta A, à temperatura de 10ºC. ... 80
Figura 3.5.6. Superfície de resposta e curva de nível para a variável resposta λ, , à temperatura de 10ºC. ... 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Variáveis codificadas e variáveis reais utilizadas para o planejamento fatorial 32 com ponto central para avaliação do efeito das concentrações de sal e de nitrito nos parâmetros microbiológicos de crescimento... 29 Tabela 2.2. Pontos de amostragem para o presunto fatiado... 32 Taela 2.3. Variáveis codificadas e variáveis reais utilizadas para o planejamento fatorial 22 com ponto central... 36 Tabela 3.1. Tempo de vida-de-prateleira até os produtos atingirem a contagem microbiana de 107 UFC/25g... 41 Tabela 3.5.1. Resultados para o planejamento fatorial 22 com ponto central, para a temperatura de 5ºC. ... 75 Tabela 3.5.2. Resultados para o planejamento fatorial 22 com ponto central, para a temperatura de 10ºC. ... 76 Tabela 3.5.3. Análise de variância e estimativa dos efeitos para as variáveis-respostas estudadas a 5ºC. ... 76 Tabela 3.5.4. Análise de variância e estimativa dos efeitos para as variáveis-respostas estudadas a 10ºC. ... 76
RESUMO
Os produtos cárneos processados, como o presunto fatiado, têm sido consumidos cada vez mais pela população no mundo inteiro. A crescente preocupação da indústria com a qualidade de seus produtos fez com que fossem estudadas alternativas para prolongar a vida-de-prateleira dos mesmos. As bactérias ácido-lácticas fazem parte da microflora natural de muitos produtos cárneos armazenados a temperaturas de refrigeração e, com a utilização de embalagens à vácuo para os produtos cárneos, as bactérias lácticas psicrotróficas encontram condições favoráveis para seu desenvolvimento, já que podem crescer em atmosferas microaerofílicas, toleram baixos valores de pH, presença de sal e sais de cura. Neste contexto, a microbiologia preditiva de alimentos se apresenta como uma ferramenta importante no estudo do crescimento de vários microrganismos, como as bactérias ácido lácticas. Os modelos matemáticos da microbiologia preditiva são utilizados na descrição do comportamento de microrganismos a diferentes condições físico-químicas, como também podem ser usados para prever a segurança microbiana e a vida-de-prateleira de produtos, através da procura por pontos críticos no processo, e para otimizar as cadeias de produção e distribuição. Tendo em vista a necessidade das indústrias em aumentar a vida-de-prateleira de seus produtos, este trabalho teve por objetivo utilizar a microbiologia preditiva para modelar o crescimento de bactérias lácticas em presunto fatiado embalado à vácuo. Para tanto, foram realizados quatro mapeamentos microbiológicos das linhas de produção de presunto fatiado. Foi visto que a contagem microbiana após o cozimento foi reduzida em cerca de três ciclos logarítmos, porém, elevou-se um ciclo logaritmo após o fatiamento. Foi realizado um estudo de Lactobacillus viridescens, bactéria ácido-láctica normalmente encontrada como deteriorante de produtos cárneos. Neste estudo foi avaliado através de contagem de colônias, medidas de pH e absorbância a influência da variação de concentrações de sal e nitrito em meio MRS. A partir dos dados de crescimento de L. viridescens, a função de Gompertz Modificada foi ajustada aos dados obtidos experimentalmente, através do software STATISTICA 6.0 e os parâmetros de crescimento: velocidade específica máxima de crescimento - µ (h-1), duração da fase lag - λ (h), e densidade populacional máxima atingida - A (logUFC/g) foram estimados. O fator que mais influenciou os parâmetros microbiológicos de crescimento de L. viridescens, nas faixas testadas, foi a concentração de sal. A avaliação do crescimento de bactérias lácticas no presunto fatiado foi realizada através da variação dos sais de cura: sal e nitrito nas formulações das massas. Este estudo verificou uma diminuição da velocidade específica máxima de crescimento e um aumento da duração da fase lag nas faixas de nitrito acima de 280 ppm e sal acima de 2,8%. A vida-de-prateleira de presunto fatiado foi avaliado em três temperaturas de estocagem: 5, 8 e 15ºC, e três modelos primários: Modelo de Gompertz, Gompertz Modificado e Logístico foram ajustados ao crescimento das bactérias ácido lácticas. O modelo que melhor descreveu o crescimento foi o de Gompertz Modificado. Os resultados evidenciaram a importância da temperatura de armazenamento, já que estes atingem a fase estacionária em 51, 18 e 14 dias às temperaturas de 5, 8 e 15ºC, respectivamente. Uma comparação entre três modelos secundários: Modelo da Raiz Quadrada, Linear e de Arrhenius foi realizada para avaliar o efeito da temperatura de armazenamento na velocidade específica máxima de crescimento e na duração da fase lag. As performances destes três modelos foram satisfatórias, sendo que, ao analisar através de índices matemáticos e estatísticos, tais como: r2, MSE (erro médio quadrático), fator bias e de exatidão, o Modelo da Raiz Quadrada foi o que obteve melhores resultados em geral.
ABSTRACT
Meat products, such as sliced ham, have been consumed more and more in the last few years. The growing concern of the industries with the quality of its products made them study other alternatives to extend the shelf-life. The lactic acid bacteria are the dominant microflora of meat products stored at refrigerated temperatures and, with the use of vaccum packed meat products, the psychotrophics lactic acid bacteria find favorable conditions for their development, since they can grow in microaerophilic environments, tolerate low values of pH, presence of salt and curing salts. The predictive microbiology is a valuable tool on the study of growth of a variety of microorganisms, such as the lactic acid bacteria. The mathematical modelling of the predictive microbiology are used to describe the behavior of microorganisms at different physical and chemical conditions, as well is to to predict the microbial safety and the shelf-life of products, with the search for critical points in the process, and to optimize the production and distribution chains. Having in mind the need of the industries to extend the shelf-life of their products, the aim of this work is to use predictive microbiology to model the growth of lactic acid bacteria in vaccum packed sliced ham. For that objective, four microbiological surveys of the sliced ham´s production line was performed. It could be seen that the microbial count after the heat treatment was reduced in about three logarithmic cycles; however, one cycle was raised after the slicing stage. A study on Lactobacillus viridescens, a lactic acid bacteria normally found in meat products was carried out. The influence of different concentrations of salt and nitrite in a culture media, MRS was evaluated through colony count, pH and absorbance measures. From growth data of Lactobacillus viridescens, the Modified Gompertz Model was fit to the experimental data, with the use of a software named STATISTICA 6.0 and the growth parameters: growth rate- µ (h), lag phase duration - λ (h-1), and logarithmic increase of population - A were estimated. Salt was the factor that influenced the most on the microbial growth parameters of Lactobacillus viridescens. The evaluation of the growth of lactic acid bacteria in sliced ham was performed with different concentrations of the curing salts: salt and nitrite in the mass formulation. This study showed a decrease on the growth rate and an increase on the lag phase duration in ranges of nitrite above 280 ppm and 2.8% of salt. The shelf-life of sliced ham was evaluated in three different temperatures: 5, 8 and 15ºC and three primary growth models: Gompertz Model, Modified Gompertz Model and Logistic Model were fit to the growth of the lactic acid bacteria. The model that best fit and described the growth was the Modified Gompertz Model. The results showed the importance of the storage temperature, since the products reached the stationary phase in 51, 18 and 14 days at temperatures of 5, 8 and 15ºC, respectively. A comparison of three secondary growth models: Square Root Model, Linear Model and Arrhenius Equation showed the effect of the storage temperature on the growth rate and lag phase duration. Those three models performance were satisfactory, but, when the mathematical and statistical values were performed (such as: r2, MSE, bias and accuracy factor), the Square Root Model was the model that had the best results.
INTRODUÇÃO
As bactérias ácido-lácticas fazem parte da microflora natural de muitos produtos cárneos armazenados a temperaturas de refrigeração embaladas a vacuo (CAYRE et al., 1999; CAYRÉ et al., 2003; HUGAS, 1998; BORCH et al., 1988; BREDHOLT et al., 2001; FRANZ e HOLY, 1996). A predominância das bactérias lácticas sobre o resto da microflora dos produtos cárneos cozidos e curados, de acordo com Cayre et al. (1999), contribui para a extensão da vida de prateleira dos mesmos, pois, por tratar-se de crescimento lento, a alteração do produto é retardada em comparação àquelas produzidas em condições aeróbias. As bactérias lácticas podem crescer em atmosferas microaerófilas, tolerar baixos valores de pH, presença de sal e sais de cura, produzir odores e sabores desagradáveis, além de descolorir e formar limo na superfície dos produtos (CAYRE et al., 1999). O gênero Lactobacillus é um componente essencial da população microbiana em carnes e produtos cárneos, possuindo influência na sua qualidade (CARR et al., 2002).
A microbiologia preditiva é uma área promissora e em rápido desenvolvimento da microbiologia de alimentos, a qual tem recebido significante atenção científica nos últimos anos, fornecendo base de dados e pacotes de softwares que podem ser ferramentas úteis na análise de riscos. Os modelos da microbiologia preditiva são usados na descrição do comportamento de microrganismos a diferentes condições físico-químicas, como também podem ser usados para prever a segurança microbiana e a vida-de-prateleira de produtos, através da procura por pontos críticos no processo, e para otimizar as cadeias de produção e distribuição (ZWIETERING et al., 1991). De acordo com Whiting & Buchanan (1993), os modelos são classificados em primários, secundários e terciários. Os modelos primários descrevem mudanças no número de microrganismos ou nas respostas microbianas com o tempo, num ambiente específico. As respostas microbianas são: duração da fase lag, velocidade específica máxima de crescimento e aumento logarítmico da população. O Modelo de Gompertz Modificado é considerado por alguns autores como estatisticamente suficiente para descrever dados de crescimento e também o mais simples de se usar (VAN IMPE et al., 1995; WHITING, 1995; ZWIETERING et al., 1990). Os modelos secundários descrevem como os parâmetros do modelo primário mudam com parâmetros ambientais constantes, como o pH, temperatura, atividade de água (aw), concentração de agentes antimicrobianos, entre outros (SCHAFFNER e LABUZA, 1997). Nos últimos anos,
têm-se encontrado na literatura diversas pesquisas sobre modelos secundários. Alguns exemplos destes modelos são: modelos polinomiais ou metodologia de superfície de resposta, equação de Arrhenius, modelo da raiz quadrada ou de Ratkowsky, entre outros (DAVEY e DAUGHTRY, 1995, MCMEEKIN et al., 2002, SCHAFFNER e LABUZA, 1997, WHITING, 1995). Segundo Giannuzzi et al. (1998) a temperatura é o fator mais importante nas reações de deterioração de alimentos, principalmente para a deterioração microbiana, uma vez que a velocidade específica máxima de crescimento e a fase lag são altamente dependentes da temperatura.
A vida útil de carnes e produtos cárneos pode ser definida como o tempo de armazenamento até a deterioração. O ponto de deterioração pode ser definido por uma contagem bacteriana máxima aceitável, ou por off-flavors, odores inaceitáveis ou pela aparência. A vida de prateleira depende do número de tipos de microrganismos, na sua maioria bactérias, inicialmente presentes e seu subseqüente crescimento. Durante a estocagem, fatores ambientais como: temperatura, atmosfera gasosa, pH e NaCl irão selecionar uma determinada bactéria e afetar sua taxa de crescimento e atividade (BORCH et al., 1996).
Desta forma, este trabalho teve com objetivo utilizar a microbiologia preditiva para avaliar o crescimento de bactérias deteriorantes de presunto fatiado embalado à vácuo. Dentre os objetivos específicos estão: mapeamento microbiológico das linhas de produção de presunto fatiado; acompanhamento da vida-de-prateleira dos produtos em diferentes temperaturas; avaliação do crescimento de uma bactéria ácido láctica – Lactobacillus viridescens - em meio de cultura sob influência de sal e nitrito; avaliação do crescimento de bactérias ácido lácticas em presunto fatiado através de formulações de massas em laboratório, a diferentes concentrações de sal e de nitrito.
Visando facilitar o acompanhamento deste trabalho, o mesmo foi dividido em 6 capítulos. O capítulo 1 apresenta uma revisão bibliográfica sobre os diversos assuntos relacionados ao trabalho. No capítulo 2 são descritos os materiais e métodos envolvidos na realização dos experimentos. Os resultados, bem como a discussão, são apresentados no capítulo 3. Alguns dos resultados são apresentados na forma de artigos e os demais capítulos (4 e 5) apresentam as conclusões e sugestões e as referências bibliográficas, respectivamente.
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Microbiologia preditiva: histórico
O início da utilização de modelos preditivos microbiológicos data de 1920, onde o cálculo dos valores de D (tempo necessário para reduzir em 90% a população inicial de microrganismos) e Z (intervalo de temperatura necessário para reduzir o valor de D a um décimo do valor inicial) foram usados satisfatoriamente para assegurar que alimentos enlatados estivessem livres do risco de envenenamento por Clostridium botulinum (McMEEKIN et al., 2002, WHITING, 1995). Um exemplo de modelo preditivo desenvolvido por Esty & Meyer (1992), foi encontrado em processamento térmico de alimentos, onde foi usado um processo térmico suficiente para destruir 1012 esporos de C. botulinum do tipo A. A grande margem de segurança inserida neste modelo faz com que ainda seja largamente utilizado pelas indústrias de processamento de latas, porém ele é pouco reconhecido como um modelo microbiológico preditivo (McMEEKIN et al., 2002).
Segundo Tijskens et al. (2001), a microbiologia preditiva teve início em 1930, porém as aplicações práticas começaram a se materializar somente nos anos 80, com o uso de uma importante ferramenta utilizada nos dias de hoje, o computador. Segundo Whiting (1995), com o surgimento dos computadores pessoais (PCs), a modelagem microbiana tornou-se uma área de interesse crescente, já que os modelos poderiam ser facilmente utilizados por tecnólogos e microbiologistas de alimentos. A microbiologia preditiva surgiu como conseqüência de duas linhas de pesquisa distintas. A primeira linha de pesquisa era o controle da deterioração de pescados, tendo como origem no Reino Unido, e a segunda linha era a prevenção do botulismo e outras intoxicações microbiológicas, tendo como origem os Estados Unidos (ROSS e McMEEKIN, 1994)
De acordo com McMeekin et al. (2002), a origem da microbiologia preditiva moderna está entre os anos 1960 e 1970, onde modelos cinéticos foram utilizados para resolver problemas de deterioração de alimentos e envenenamento alimentar, e modelos probabilísticos utilizados para a prevenção de botulismo e outras intoxicações.
As aplicações das técnicas de modelagem matemática para o crescimento e sobrevivência de microrganismos em alimentos começaram a ser empregadas a partir da década de 80. Segundo Ross & McMeekin (1994), a utilização dos modelos ocorreu por duas razões. A primeira foi o aumento de casos importantes de envenenamento alimentar durante os anos 80, levando ao aumento da conscientização pública da necessidade da oferta de alimentos seguros. A segunda razão foi a constatação de muitos microbiologistas, de que os métodos tradicionais na determinação de qualidade e segurança – inclusive os considerados rápidos – eram limitados pelo tempo de obtenção de resultados e tinham um pequeno valor preditivo.
O potencial da microbiologia preditiva tem despertado o interesse de pesquisas e de financiamentos, especialmente nos Estados Unidos, Reino Unido, Austrália e Europa. Este interesse fez desenvolver o software Food Micromodel (ROSS e McMEEKIN, 1994), que é o maior e o mais compreensível programa existente no Reino Unido. Foi desenvolvido por um programa de pesquisa financiado pelo Ministério de Pesca, Agricultura e Alimentos e o software está disponível para compra na Leatherhead Food Research Association.
Ross & McMeekin (1994), afirmam que o interesse pelo assunto na Europa fez surgir e desenvolver um programa, o FLAIR (Food Linked Agricultural and Industrial Research), que reúne cerca de 30 laboratórios em dez países da Comunidade Econômica Européia (CEE), colaborando no estudo de respostas de crescimento de microrganismos patogênicos e deteriorantes em diversos produtos naturais. Nos Estados Unidos, as pesquisas em microbiologia preditiva são feitas pelo USDA, na Pensilvânia, no Microbial Food Safety Research, onde foi desenvolvido um software denominado Pathogen Modeling Program (PMP) (ROSS e McMEEKIN, 1994). Segundo Tijskens et al. (2001), este é um pacote de programa facilmente manuseado e bem escrito.
Existem outros pacotes de programas a respeito de microbiologia preditiva que foram criados para fins específicos. Um deles é o Seafood Spoilage Predictor (SSP), um programa bem elaborado para predizer a deterioração de alimentos marinhos em valores definidos de fatores ambientais. Este programa também esta disponível na internet. Outro programa, o Food Spoilage Predictor é um software de interação tempo-temperatura, que prediz o aumento em números de pseudomonas psicotróficos deteriorantes em alimentos (TIJSKENS et al., 2001).
Como a segurança alimentar é um item crescente de interesse na sociedade moderna, a disciplina relativamente nova denominada microbiologia preditiva, se consolidou com mérito próprio nos últimos anos, e tem recebido mais e mais importância na indústria de processamento de alimentos no mundo inteiro (McCLURE et al., 1994; SWINNEN et al., 2004).
1.1.2 Objetivos e aplicações
A microbiologia preditiva de alimentos é uma área promissora e em rápido desenvolvimento da microbiologia de alimentos, a qual tem recebido significante atenção cientifica nos últimos anos, fornecendo base de dados e pacotes de softwares que podem ser ferramentas úteis na análise de riscos (SHIMONI e LABUZA, 2000). É considerada uma área multidisciplinar, já que engloba áreas da matemática, engenharia, química e biologia para fornecer prognósticos comportamentais em determinados alimentos sob condições definidas (SCHAFFNER e LABUZA, 1997; McDONALD e SUN, 1999).
Segundo Whiting (1995), o objetivo principal da microbiologia preditiva é de descrever matematicamente o crescimento ou a diminuição de microrganismos presentes em alimentos sob condições ambientais específicas. De acordo com ele, com esta habilidade para descrever, vem a habilidade para prever combinações de condições onde não existem dados experimentais, dentro de uma faixa apropriada de cada condição. Estas condições ambientais incluem ambos fatores intrínsecos e extrínsecos.
Zwietering et al. (1991), afirmam que os modelos da microbiologia preditiva são usados na descrição do comportamento de microrganismos a diferentes condições físico-químicas, como também pode ser usada para prever a segurança microbiana e a vida-de-prateleira de produtos, através da procura por pontos críticos no processo, e para otimizar as cadeias de produção e distribuição. A microbiologia preditiva tem se mostrado uma excelente ferramenta na elaboração de planos de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), identificando perigos e pontos críticos de controle, especificando limites e ações corretivas (McMEEKIN et al., 2002; VERSYCK et al., 1999).
Dentre outros, os microbiologistas de alimentos têm procurado modelos eficientes para o crescimento microbiano que possam permitir a previsão de conseqüências microbiológicas na estocagem de alimentos (BARANYI e ROBERTS, 1994). Eles utilizam, de maneira clássica, três parâmetros na caracterização da curva de crescimento bacteriano: a duração da fase lag (λ), a velocidade especifica máxima de crescimento (µ) e a aumento logarítmico da população
(A). Todos os parâmetros precisam ser estimados de forma exata em diversas áreas de conhecimento, em especial na microbiologia de alimentos (BATY e DELIGNETTE-MULLER, 2004). Segundo Dalgaard & Koutsoumanis (2001), a estimativa destes parâmetros é essencial na caracterização de efeitos de anti-microbianos, otimização de meios microbiológicos e no desenvolvimento de modelos cinéticos utilizados nas tecnologias de alimentos e de fermentação.
A microbiologia preditiva tem sido aceita como uma ferramenta útil para diversas áreas de interesse, como, desenvolvimento de produtos, APPCC, “risk assessment” como também para fins educacionais. A maioria das pesquisas tem focado na modelagem preditiva de crescimento e/ou inativação de microrganismos patogênicos em alimentos (DEVLIEGHERE et al., 1999). De acordo com Neumeyer et al. (1997), as vantagens dos modelos preditivos na microbiologia de alimentos são inúmeras e incluem: predizer a vida-de-prateleira de produtos alimentícios, avaliando a eficiência da higiene do processamento e distribuição, determinando o efeito dos lapsos nas condições de armazenamento e na determinação da segurança microbiológica de um produto.
Davey (1994) afirma que o uso de modelos preditivos pode reduzir a necessidade de análises laboratoriais dispendiosas, e em longo prazo, pode ser considerado um pré-requisito para o controle computacional de operações e para otimização de processos.
As respostas microbianas, segundo Ross e McMeekin (1994), são medidas sob condições definidas e controladas e os resultados são sumarizados na forma de equações matemáticas, as quais, por interpolação, podem prever respostas para novas condições que não foram verdadeiramente testadas.
O verdadeiro poder das abordagens feitas pela microbiologia preditiva é que, ao contrário do processo tradicional de estocagem, os modelos, uma vez validados, podem ser utilizados para predizer com rapidez e segurança a resposta dos microrganismos sob varias condições. Isto faz com que a microbiologia preditiva seja considerada uma ferramenta preciosa para os microbiologistas de alimentos na tomada de decisão diária (McCLURE et al., 1994).
1.2 Modelos preditivos
Um modelo matemático é um conjunto de suposições, algumas das quais podem ser formuladas por equações que descrevem relações matemáticas entre as variáveis definidas. A demanda crescente por modelagens matemáticas na área de segurança microbiológica alimentar teve inicio com a preocupação de que o controle de qualidade de alimentos baseado na inspeção do produto final era dispendioso, trabalhoso e ineficiente (TIJSKENS et al., 2001). Baranyi et al. (1995), ressaltam que, do ponto de vista mecanístico, função e modelo não são termos equivalentes: uma função é definida como uma abstração matemática que facilita a descrição de um modelo particular; e o termo modelo matemático se refere a uma série de hipóteses básicas de um processo estudado, algumas das quais, podem ser expressas por meio de funções ou de equações (diferenciais).
A experiência mostra, segundo Baranyi & Roberts (1994), que os modelos matemáticos utilizados na microbiologia preditiva, não podem simplesmente ser copiados daqueles elaborados para a biotecnologia e engenharia química há muitos anos. Estes autores afirmam que são muitas as razões para que a microbiologia preditiva de alimentos construa suas próprias ferramentas estatístico-matemáticas. Algumas destas razões são:
• Ao contrário do que ocorre com a biotecnologia, que visa a otimização, o objetivo principal dos microbiologistas de alimentos é de minimizar ou prevenir o crescimento microbiano. Estes efeitos dos fatores inibitórios fazem com que sejam estudados mais intensivamente.
• A concentração de células de interesse é bem menor que na biotecnologia, que geralmente é maior que 106-107 células/ml. Como conseqüência, alguns métodos validados a elevadas concentrações celulares, como turbidimetria e medidas de condutância, não devem ser aplicados diretamente, sendo necessário estabelecer a relação entre o número de células e medida na menor concentração celular.
• A cinética da fase lag, que é pouco importante num biorreator, é de grande importância para a microbiologia de alimentos.
• Geralmente, a quantidade de informação sobre a composição físico-química do alimento é menor e menos precisa quando comparada a um biorreator,
consequentemente, os métodos estatístico-matemáticos aplicados envolvem várias simplificações e elementos empíricos.
Os modelos que descrevem o crescimento microbiano formam a base para a adoção de estratégias na área de segurança alimentar. O objetivo de um modelo, segundo Soboleva et al. (2000), é de prever quando, e em quais circunstâncias, o número microbiano crescerá a um nível que possa ameaçar a saúde pública. Os modelos desenvolvidos na microbiologia preditiva podem ser utilizados para calcular o número de microrganismos presentes em um alimento dadas a composição específica, a linha de produção, e a cadeia de distribuição do alimento (WIJTZES et al., 1998).
De acordo com Whiting (1995), o processo de modelagem depende de técnicas de regressão matemática, conseqüentemente, deve ser levado em consideração um critério padrão para a análise de regressão, incluindo distribuições normais e variâncias homogeneizadas.
O desenvolvimento de um modelo microbiológico deve incluir as seguintes etapas (STRINGER e DENNIS, 2000):
• Seleção cautelosa e preparação apropriada do microrganismo alvo
• Inoculação do microrganismo alvo num meio de cultura (meio microbiológico ou alimento) com características definidas
• Armazenamento do meio de cultura sob condições controladas
• Amostragem do meio de crescimento para o microrganismo alvo em determinados intervalos de tempo
• Construção de um modelo que descreva as respostas do microrganismo alvo
• Validação das predições do modelo, tendo como preferência a validação do modelo em um alimento para assegurar que são significativas
• reparametrizacão ou melhoramento do modelo
De acordo com Krist et al. (1998); McMeekin et al. (2002), Kilcast & Subramaniam (2000), existem duas categorias de modelos preditivos: os mecanísticos e os empíricos. Os modelos mecanísticos descrevem, com base teórica, a resposta microbiana. No entanto, estes
modelos são raros devido à complexidade da fisiologia microbiana. Os modelos empíricos descrevem matematicamente os dados, porém não fornecem uma boa introspecção do processo. Estes modelos empíricos podem ser divididos em modelos cinéticos e probabilísticos.
Os modelos cinéticos são baseados no estudo do comportamento da população microbiana em função do tempo, enquanto que os modelos probabilísticos examinam a probabilidade de que um microrganismo responda crescendo, morrendo ou produzindo um metabólito num dado período de tempo (McMEEKIN e ROSS, 2002; ROSS e McMEEKIN, 1994; WHITING, 1995). Como os modelos preditivos são classificados de acordo com o comportamento da população que descrevem, existem modelos de crescimento, de inativação (WHITING, 1995; McMEEKIN e ROSS, 2002) e de limites ou interface de crescimento (modelos cresce-não-cresce) (McMEEKIN e ROSS, 2002).
Whiting & Buchanan (1993) propuseram uma outra classificação dos modelos matemáticos utilizados na microbiologia preditiva. Nesta classificação os modelos são considerados primários, secundários ou terciários. Os modelos primários e secundários, de acordo com WHITING (1995), podem ser lineares ou não-lineares, segregados - quando a população é definida por células homogêneas, ou não-segregados – quando a população é definida por células médias, estruturado, quando é composto por vários componentes, ou não-estruturado, quando é composto por um único componente.
A classificação dos modelos, segundo Whiting & Buchanan (1993), é apresentada a seguir.
1.2.1 Modelos primários
Os modelos primários descrevem mudanças no número de microrganismos ou nas respostas microbianas com o tempo, num ambiente específico. As respostas microbianas são: duração da fase lag, velocidade específica máxima de crescimento e aumento logarítmico da população. Estes modelos podem estimar a quantidade de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml), a formação de toxinas, os níveis de substrato e produtos metabólicos (que são
medidas diretas da resposta). Uma equação ou função matemática descreve a mudança da resposta com o tempo, fornecendo um grupo característico de valores dos parâmetros.
Os modelos primários mais utilizados na literatura são os modelos de Gompertz e os de Baranyi & Roberts (BUCHANAN et al., 1997). Outros exemplos de modelos primários são os de primeira ordem de Monod (LABUZA e FU, 1993), o modelo logístico – de Schnute (ZWIETERING et al., 1990), o modelo de inativação térmica de primeira ordem (WHITING, 1995), e o modelo de Boltzman (ERKMEN e ALBEN, 2002).
1.2.1.1 Modelo de Gompertz
O modelo de Gompertz tem sido utilizado com sucesso para descrever o comportamento microbiano em diferentes alimentos (MASSON et al., 2002).
Este modelo foi introduzido na microbiologia de alimentos por Gibson et al., em 1987, onde estes autores compararam a equação logística e a de Gompertz na parametrização de uma curva de crescimento de Clostridium botulinum (ROSS e McMEEKIN, 1994, GIANNUZZI et al., 1998, LABUZA e FU, 1993).
O Modelo de Gompertz, representado na Equação 2.1 (ERKMEN e ALBEN, 2002) foi selecionado devido ao melhor ajuste.
{
exp(
*
)
}
exp
*
b
c
t
a
y
=
−
−
(2.1)
onde y é a densidade da população (logaritmo do número de unidades formadoras de colônias/ml) num dado tempo t (h). Os parâmetros a, b, e c, são estimados pelo modelo. Estes parâmetros estão relacionados com os parâmetros microbiológicos de crescimento λ (duração da fase lag), µmax (velocidade específica máxima de crescimento) e A (aumento logarítmico da população) pelas seguintes equações:
A
b
=
1
+
µ
max*
λ
(2.3)A
c
=
µ
max (2.4)A função ou Modelo de Gompertz foi modificado por Zwietering et al. (1990). A reparametrização do modelo foi feita para que os parâmetros estimados pudessem ter um significado biológico. Os parâmetros: velocidade específica máxima de crescimento (µmax), duração da fase lag (λ) e aumento logarítmico da população (A) foram então introduzidos no modelo. Isto facilitou o encontro de valores iniciais e o cálculo de intervalos de confiança durante o ajuste da curva (LABUZA e FU, 1993; Van IMPE et al., 1995). Zwietering et al. (1990) concluíram que, em quase todos os casos testados, o Modelo Modificado de Gompertz é estatisticamente suficientemente para descrever dados de crescimento e também o mais simples de se usar (Van IMPE et al., 1995; WHITING, 1995).
O Modelo de Gompertz Modificado está representado na Equação 2.5
(
)
+ − − = *exp exp * * t 1 A e A y µ λ (2.5)Tanto o Modelo de Gompertz original quanto o Modificado, segundo Labuza & Fu (1993), têm sido testados em muitas espécies de microrganismos com bons ajustes. No entanto, o ajuste do Modelo de Gompertz é fortemente afetado pelo número de observações utilizados na construção da curva, como foi observado por Bratchell et al. (1989), bem como pela qualidade estatística destas observações.
1.2.2 Modelos secundários
Os modelos secundários descrevem como os parâmetros do modelo primário mudam com parâmetros ambientais constantes, como o pH, temperatura, atividade de água (aw), concentração
têm-se encontrado na literatura diversos trabalhos sobre modelos secundários. Alguns exemplos deste modelo são: modelos polinomiais ou metodologia de superfície de resposta, equação de Arrhenius, modelo da raiz quadrada ou de Ratkowsky, entre outros (DAVEY e DAUGHTRY, 1995, McMEEKIN et al., 2002, SCHAFFNER e LABUZA, 1997, WHITING, 1995).
Fu & Labuza (1993) mostram que a lei de Arrhenius se aplica para uma determinada faixa de temperatura, uma vez que o crescimento microbiano é um processo bioquímico. Deste modo, a dependência da temperatura na velocidade específica de crescimento pode ser caracterizada por uma energia de ativação uma vez que todos os outros fatores são mantidos constantes. A equação 2.6 representa esta função de dois parâmetros.
−
=
RT
E
A
k
*
exp
a (2.6)onde k é a velocidade específica de crescimento determinada da curva de crescimento; A representa o fator de colisão, T é a temperatura absoluta (K), R é a constante universal dos gases (8.314 J/mol.K) e Ea (J/mol) é a energia de ativação, a qual é uma medida da sensibilidade da
velocidade específica de crescimento em relação à temperatura.
A metotodogia de superfície de resposta é uma equação de regressão que se ajusta utilizando-se técnicas padrões de regressão e podem conter termos lineares, quadráticos, cúbicos (WHITING, 1995).
O Modelo de Belehradek, ou Modelo da Raiz Quadrada é baseado na relação linear entre a raiz quadrada da velocidade específica máxima de crescimento e a temperatura. Este modelo foi inicialmente utilizado por Ratkowsky et al. (1982) para modelar o efeito da temperatura na velocidade específica máxima de crescimento. A versão mais comum do modelo para temperaturas abaixo da velocidade específica máxima de crescimento está na equação abaixo:
) (T T0 a
k = − (2.7)
onde k representa a velocidade específica máxima de crescimento ou outro parâmetro, a é a constante de regressão, T0 representa a temperatura mais baixa onde o crescimento é observado,
Em microbiologia preditiva de alimentos, a temperatura, o pH e a aw são consideradas as
variáveis ambientais mais importantes na determinação do crescimento microbiano em alimentos. Segundo Giannuzzi et al. (1998), a temperatura é o fator mais importante nas reações de deterioração de alimentos, principalmente para a deterioração microbiana, uma vez que a velocidade específica máxima de crescimento e a fase lag são altamente dependentes da temperatura. Apesar da temperatura ser um fator importante na estabilidade microbiana, as temperaturas de refrigeração nem sempre são mantidas constantes durante a manipulação e o transporte. Para isso, os efeitos da temperatura na estabilidade microbiana têm sido amplamente estudados por pesquisadores, através de modelos computacionais baseados em transferência de calor e estimativas de crescimento microbiano. Um exemplo de Modelo da Raiz Quadrada, que descreve a influência da temperatura na velocidade específica máxima de crescimento foi citado por Ratkowsky et al. (1983).
Alguns fatores, de acordo com Schaffner & Labuza (1997), tais como o pH e a aw são
comumente encontrados em alguns modelos, sendo necessário expressá-los em concentração de íon hidrogênio ou conteúdo de sal. Quando o modelo é desenvolvido para carnes curadas, por exemplo, é necessária a incorporação de um termo no modelo que descreva a influência do nitrito no crescimento microbiano. Embora seja raro, os modelos podem incluir outros fatores além da temperatura, pH, aw e nitrito, como o potencial redox, a composição dos gases do headspace
(oxigênio, dióxido de carbono e nitrogênio) entre outros.
Segundo estes mesmos autores, a influência de uma microbiota competitiva ainda não foi explorada por muitos modelos. Quando se tem uma mistura de microrganismos, a predominância de um ou de outro varia de acordo com a energia de ativação de cada um, sendo que, aqueles que possuem maior energia de ativação, são predominantes a altas temperaturas, enquanto que aqueles que possuem energia de ativação menores, deverão ser predominantes a temperaturas mais baixas. Pode ocorrer inclusive a produção de substâncias antimicrobianas por alguns contaminantes naturais, o que pode afetar o crescimento de outros microrganismos presentes nos alimentos.
1.2.3 Modelos terciários
Segundo Whiting (1995), os modelos terciários são ferramentas, onde as rotinas dos
softwares computacionais transformam os modelos primários e secundários em programas
amigáveis, como softwares e sistemas espertos. Estes programas podem calcular as respostas microbianas de acordo com as mudanças nas condições ambientais, comparar efeito de diferentes condições, ou comparar o comportamento de diversos microrganismos.
Alguns softwares comerciais fornecem predições do crescimento microbiano ou da taxa de crescimento ou da fase lag, sob condições definidas (McMEEKIN et al., 2002). Entre eles estão:
• USDA’s Pathogen Modeling Program (PMP). Este programa foi desenvolvido nos
Estados Unidos pelos pesquisadores Dr. Robert L. Buchanan e por Dr. Richard Whiting. Segundo Tijskens et al. (2001), O PMP prevê curvas de crescimento de bactérias a valores definidos de temperatura, pH e concentração de NaCl (ou atividade de água). As vantagens deste programa são: sem custo e fácil de usar. As desvantagens são que o usuário pode fornecer apenas predições individuais dos parâmetros de Gompertz e estes não podem ser coletados em uma tabela - para determinados valores de fatores ambientais - para copiá-los em outras aplicações. O programa está disponível no site
http://www.arserrc.go/mfs/pathogen.htm ,
• Food MicroModel (McCLURE et al., 1994; PANISELLO e QUANTICK, 1998). Este
programa foi desenvolvido por um grupo de empresas em conjunto com o governo do Reino Unido. Os modelos no Food Micromodel foram produzidos através de dados obtidos em meios de crescimento em laboratório e validados pela comparação de predições feitas pelo modelo com dados obtidos da literatura ou obtidos de estudos com alimentos inoculados (STRINGER e DENNIS, 2000). Este programa está na internet e maiores informações sobre este software podem ser encontradas no site:
www.foodmicromodel.com,
• Seafood Spoilage Predictor (DALGAARD et al., 2002), desenvolvido para predizer a
vida de prateleira de alimentos de origem marinha estocados a temperatura constante ou sob flutuaçoes de temperatura. O software está disponível no site:
• Food Spoilage Predictor (NEUMEYER et al., 1997), software commercial que modela o
efeito da atividade de água e de flutuações de temperatura no crescimento de
1.3. Bactérias ácido-lácticas
As bactérias ácido-lácticas compreendem um grupo amplo de microrganismos microaerofílicos associados a plantas, carnes e produtos lácteos, que podem produzir uma variedade de compostos antagônicos ao crescimento de outras bactérias (JONES, 2004; CARR et al., 2002). São conhecidas pelo seu uso como culturas starters na produção de produtos derivados do leite, como leite fermentado, iogurte, manteiga e queijos. As bactérias ácido-lácticas são importantes comercialmente no processamento de carnes, bebidas alcoólicas e vegetais. Estes produtos incluem salsicha, presunto curado, vinhos, cerveja, picles e chucrute. Apesar das bactérias lácticas possuírem efeitos benéficos na indústria de alimentos, elas podem também ser um incômodo como contaminantes, já que produzem off-flavours (CARR et al., 2002).
Bredholt et al. (2001) afirmam que as bactérias lácticas são consideradas microrganismos não patogênicos, seguros ao consumo e que já estão sendo utilizadas em alimentos há vários anos.
Segundo Carr et al. (2002), as bactérias ácido-lácticas são classificadas em dois grupos, baseado no produto final de sua fermentação: homofermentativas e heterofermentativas. As bactérias homofermentativas produzem ácido láctico como produto principal da fermentação de glicose. As heterofermentativas produzem um número de produtos além de ácido láctico, que incluem dióxido de carbono, ácido acético e etanol a partir da fermentação de glicose. As bactérias homofermentativas incluem o gênero Streptococcus e Pediococcus, entre outras, e as heterofermentativas incluem o gênero Leuconostoc e um subgrupo do gênero Lactobacillus, as betabactérias. As bactérias ácido lácticas podem ser caracterizadas como Gram positivas, aeróbias e anaeróbias facultativas, formadoras de cocos, não formadoras de esporos, as quais são negativas para oxidase, gelatinase, catalase e benxidina, não reduzem nitratos a nitritos, e são ácidos tolerantes, apresentando o acido láctico como principal produto da fermentação de carboidratos (ADAMBERG et al., 2003).
Segundo Wessels et al. (2004), as bactérias lácticas mais comuns na fermentação de alimentos incluem: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptoccus, Tetragenococcus, e Weisella. Destas bactérias,
reconhecidas desde os anos 40, os Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus historicamente representam o gênero dominante.
O gênero Lactobacillus foi inicialmente classificado em homofermentativos e heterofermentativos por Orla e Jensen baseado na quantidade de ácido láctico formado durante a fermentação da glicose. Estes mesmos autores dividiram o gênero Lactobacillus em três grupos: Termobacteria, Estreptobacteria e Betabacteria; baseado na temperatura de crescimento e das reações bioquímicas.
O cultivo das bactérias ácido-lácticas pode ser realizado utilizando-se caldos enriquecidos e meios de cultura seletivos ou não, dependendo da necessidade de isolamento de um gênero em particular dentro de uma mistura de microrganismos ou para mantê-lo isolado em uma cultura. Os meios de cultura mais indicados e utilizados para o isolamento das bactérias ácido-lácticas são os meios: Agar APT, Agar Rogosa, ou Agar Man, Rogosa e Sharpe (MRS). O nome MRS tem origem nas fórmulas de de Man et al. (1960). O meio APT (All Purpose Tween) é um meio de cultura recomendado para procedimentos qualitativos no cultivo de bactérias ácido lácticas (REMEL, 2003).
1.3.1 Produtos cárneos
De acordo com Hugas (1998), as carnes são altamente sensíveis à deterioração microbiana devido à suas propriedades: atividade de água, pH e nutrientes. Em carnes, as bactérias ácido lácticas constituem uma parte da flora inicial a qual se desenvolve facilmente após a carne ser processada, estocada à baixas temperaturas, embaladas sob vácuo ou sob atmosfera modificada. Este mesmo autor afirma que as linhagens de bactérias ácido lácticas geralmente consideradas como naturais em carnes e produtos cárneos são: Carnobacterium piscicola e C. divergens,
Lactobacilus sakei, Lb. viridescens, Lb. curvatus e Lb. plantarum, Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides, Le. gelidum e Le. carnosum. Os produtos metabólicos das bactérias ácido lácticas e a bactéria em si têm sua importância na preservação dos alimentos, apesar de que o crescimento incontrolável de algumas espécies de bactérias lácticas podem causar deterioração em carnes e produtos cárneos.
As bactérias ácido-lácticas fazem parte da microflora natural de muitos produtos cárneos armazenados a temperaturas de refrigeração (CAYRE et al., 1999;CAYRÉ et al., 2003; HUGAS,
1998; BORCH et al., 1988; BREDHOLT et al., 2001, FRANZ e HOLY, 1996). Segundo Cayre et al. (1999) e Samelis et al. (2000), com a utilização de embalagens à vácuo para os produtos cárneos, as bactérias lácticas psicrotróficas encontram condições favoráveis para seu desenvolvimento, já que podem crescer em atmosferas microaerofílicas e anaeróbias, toleram baixos valores de pH, presença de sal e sais de cura.
A competitividade das bactérias lácticas sobre o resto da microflora dos produtos cárneos cozidos e curados, de acordo com Cayre et al. (1999), contribui para a extensão da vida de prateleira dos mesmos, pois, por tratar-se de crescimento lento, a alteração do produto é retardada em comparação àquelas produzidas em condições aeróbias. Além disso, seu crescimento provoca uma diminuição no pH do produto, criando condições desfavoráveis para a proliferação de outros microrganismos, como as enterobactérias e alguns patógenos.
Vermeiren et al. (2004) afirmam que os produtos cárneos cozidos e curados são produtos refrigerados economicamente importantes com um alto consumo em países europeus. Como estes produtos são aquecidos a temperaturas de 65 – 75ºC, a maioria das células vegetativas são mortas e a recontaminação do tratamento pós-aquecimento é que determina a sua vida de prateleira. Quando produtos cárneos são estocados sob refrigeração e em condições de anaerobiose, como em embalagens à vácuo ou embalagens com atmosfera modificada, são as bactérias ácido lácticas que irão predominar no processo deteriorativo.
Segundo Samelis et al. (2000), a taxa de deterioração é determinada através da combinação de fatores intrínsecos (pH, sal, conservantes, fatores antimicrobianos naturais) e extrínsecos (período de armazenamento, composição do produto, tipo de embalagem). A predominância das bactérias lácticas fica inalterada pela temperatura de resfriamento utilizada, porém sua taxa de crescimento ou seja, taxa de deterioração, é acelerada à medida que sua temperatura aumenta. Uma grande diversidade de bactérias ácido lácticas tem sido estudada individualmente para uma enorme variedade de produtos cárneos.
O gênero Lactobacillus é um componente essencial da população microbiana em carnes e produtos cárneos, possuindo influência na sua qualidade. Segundo Carr et al. (2002), este gênero pode ser subdividido em três grupos: as betabactérias, estreptobactérias e as termobactérias. As termobactérias podem crescer a temperaturas de 45ºC ou mais, porém não crescem a 15ºC. As estreptobactérias crescem a 15ºC, mas não a 45ºC; e as betabactérias crescem em temperatura ótima a 15ºC. Entre os subgêneros dos Lactobacillus, as estreptobacterias e betabacterias são
conhecidas no que se refere à proliferação durante a preservação de carnes e produtos cárneos, e estão presentes em grande número (MORISHITA e SHIROMIZU, 1986). Segundo Korkeala & Lindroth (1987), os odores – sabores ácidos e azedos observados na deterioração de carnes e produtos cárneos embalados a vácuo são causados pelo gênero lactobacilli.
As embalagens à vácuo estão sendo utilizadas cada vez mais como uma técnica para a extensão da vida de prateleira de alimentos perecíveis.
1.3.2 Principais alterações por bactérias lácticas
A atividade metabólica das bactérias ácido lácticas resulta em deterioração, mostrando-se assim: azedo, off-flavors, exudados leitosos, produção de limo, inchamento da embalagem, descoloração e esverdeamento (SAMELIS et al., 2000). Segundo Milbourne (1983), o esverdeamento de produtos cárneos curados é um problema muito bem conhecido pelas indústrias de carnes, e uma destas causas se deve ao microrganismo Lactobacillus viridescens, o qual pode ser isolado de quase todas as indústrias de processamento de carnes.
A flora deteriorante de produtos cárneos embalados à vácuo ou com atmosfera modificada consiste, na sua maioria, de Lactobacillus spp., seguido de Leuconostoc spp., Weisella spp., e
Carnobacterium spp., e podem também ser uma parte dominante da flora dependendo da
permeabilidade do filme e do oxigênio residual obtido através do processo de vácuo (VERMEIREN et al., 2004).
Segundo Nicolai et al. (1993), para carnes embaladas à vácuo, a deterioração a temperaturas abaixo de 20ºC é dominada pelo crescimento anaeróbio de bactérias ácido lácticas, as quais produzem, na sua maioria, ácido láctico, causando um odor forte após longo tempo de estocagem. Algumas espécies heterofermentativas como os Lactobacillus viridescens podem produzir peróxidos que reagem com os pigmentos da carne e causam o esverdeamento. Geralmente, a formação de compostos putrefativos fica limitada e as bactérias ácido lácticas tornam-se as bactérias dominantes no meio (NATTRESS et al., 2001 apud EGAN, 1983). Contagem microbianas máximas atingem níveis de 106 a 107 UFC/cm2 para carne cruas (NATTRESS et al., 2001) e de 107 a 108 UFC/cm2, após um longo período de estocagem – 5 a 10 semanas para carnes cruas embaladas à vácuo (NICOLAI et al., 1993).
Franz & Holy (1996) citam que a deterioração de carnes processadas embaladas à vácuo resulta em um rápido crescimento de bactérias acido lácticas. Estas são capazes de se multiplicarem durante a estocagem a temperatura de refrigeração destes produtos, já que são microrganismos psicrotróficos, microaerofilicos e resistentes ao sal e nitrito.
As bactérias ácido lácticas, de acordo com Hugas (1998), podem interferir na multiplicação de bactérias deteriorantes e patogênicas por meio de diversos mecanismos: competição de nutriente e oxigênio, competição por sítios de ligação e produção de uma ampla faixa de substâncias antagonísticas, principalmente ácido láctico ou ácido láctico e acético, acetoína, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas.
1.4 Vida-de-prateleira de produtos cárneos
A qualidade e a vida de prateleira de alimentos geralmente é determinada pela presença e crescimento de bactérias. As bactérias provenientes de alimentos podem ser divididas em dois grupos: patogênicas e deteriorantes (WIJTZES et al., 2001). A extensão da vida de prateleira de produtos cárneos processados tem sido considerada um assunto importante por muitos grupos de pesquisa (BREWER et al., 1991).
Borch et al. (1996) definem a vida útil de carnes e produtos cárneos como o tempo de armazenamento até a deterioração. O ponto de deterioração pode ser definido por uma contagem bacteriana máxima aceitável, ou por off-flavors, odores inaceitáveis ou pela aparência. A vida de prateleira depende do número de tipos de microrganismos, na sua maioria bactérias, inicialmente presentes e seu subseqüente crescimento. Durante a estocagem, fatores ambientais como: temperatura, atmosfera gasosa, pH e NaCl irão selecionar uma determinada bactéria e afetar sua taxa de crescimento e atividade. A vida útil de produtos cárneos refrigerados pode variar de dias até diversos meses.
Existem muito fatores que podem influenciar a vida de prateleira, e estes fatores sub-dividem-se em intrínsecos e extrínsecos. Os fatores intrínsecos são as propriedades finais do produto, como: atividade de água (aw), pH, potencial redox (Eh), oxigênio disponível, nutrientes,
microflora natural, bioquímica natural da formulação do produto, e uso de aditivos na formulação do produto. Estes fatores são influenciados por muitas variáveis, como o tipo e a qualidade do
material cru, formulação do produto e sua estrutura. Os fatores extrínsecos não são inerentes ao produto, mas afetam o produto final desde a sua fabricação até o final de sua vida-de-prateleira, tais como: perfil tempo – temperatura durante o processamento; controle da temperatura durante o armazenamento e a distribuição; umidade relativa (UR) durante o processamento, armazenamento e distribuição; exposição à luz ultra-violeta (UV) e contagem microbiana do ambiente durante estas etapas; composição da atmosfera na embalagem; tratamento térmico subseqüente; e o manuseio do consumidor (KILCAST e SUBRAMANIAM, 2000).
A indústria estabelece a vida útil baseada na perda de qualidade de um alimento, seja microbiológica ou organolepticamente. Neste período, o produto deve ainda estar organolepticamente aceitável. Para o consumidor, o final da vida útil de um produto é quando o alimento não possui mais um sabor aceitável (FU e LABUZA, 1993).
A taxa da deterioração de qualidade de um produto alimentício, uma vez que sai de sua etapa de processamento, é função de seu microambiente, principalmente da composição gasosa, umidade relativa (UR) e temperatura. Considerando que a composição gasosa e a UR geralmente são controladas por embalagens apropriadas, a temperatura do alimento depende das condições de estocagem. Deste modo, a qualidade de um produto alimentício e sua vida útil é fortemente dependente do histórico da temperatura, desde a produção, distribuição e o armazenamento, até o consumo (TAOUKIS e LABUZA, 1989). De acordo com estes mesmos autores, a perda da vida de prateleira de um alimento geralmente é avaliada pela medida de um ou mais parâmetros de características de qualidade. Estes parâmetros podem ser físicos, químicos, microbiológicos, enzimáticos, ou índices sensoriais, dependendo do produto, do processo, da embalagem e das condições de armazenamento (GOULD, 1993; TAOUKIS e LABUZA, 1989; VELD, 1996; BLACKBURN, 2000). As mudanças físicas podem ser causadas pelo manuseio errôneo dos alimentos durante o processamento e distribuição. As mudanças químicas, como resultado de ações enzimáticas, reações oxidativas e escurecimento não-enzimático, podem levar à deterioração do produto. Métodos tradicionais na determinação da vida de prateleira incluem a estocagem do produto a diferentes temperaturas e na determinação da deterioração através de análises sensoriais ou contagem microbiana (BLACKBURN, 2000).
Segundo Kotzekidou & Bloukas (1996), o presunto cozido pode ser considerado um produto cárneo altamente perecível. O baixo conteúdo de sal (geralmente 2.0%), um pH acima de
6.0 e uma atividade de água (aw) geralmente superior a 0.945, são apenas algumas barreiras para
inibir os tipos mais comuns de microrganismos associados a estes produtos.
Métodos tradicionais de extensão de vida de prateleira incluem a utilização de nitritos. A literatura mostra evidências de que, em carnes curadas, têm-se utilizado a interação do nitrito com o sal e outros fatores bacteriostáticos (PAPADOPOULOS et al., 1991). Estudos anteriores mostram que o lactato de sódio pode reduzir a atividade de água (aw) em diversos produtos
cárneos (PAPADOPOULOS et al., 1991), além de possuir diversas funções: não influi no pH, possui sabor levemente salgado em comparação ao cloreto de sódio (NaCl). Sua utilização em carnes faz com que seja um ingrediente para flavoring, e suas atividades umectantes contribuem para a capacidade de retenção de água e aumenta o rendimento do cozimento. A função principal do lactato de sódio é o efeito na extensão da vida de prateleira em produtos cárneos cozidos, como: presunto, bacon, salames e corned beef, principalmente quando estes produtos necessitam de manuseio após o tratamento térmico, como o fatiamento ou embalamento, os quais podem causar recontaminação (HOUTSMA et al., 1993; STEKELENBURG, 2003; PAPADOPOULOS et al., 1991).
O sal tem com principal efeito a redução da atividade de água (aw), além do efeito
bacteriostático. A cura de produtos cárneos é um processo no qual se adiciona sal e outros ingredientes como o nitrito de sódio, ascorbatos, fosfatos e outros temperos. No nível usado comercialmente, e permitido pela legislação, inibe o crescimento de alguns microrganismos, dependendo de sua concentração, tipo de microrganismo, etc (MURNO). Segundo Boyle & Schmidt (1999), o sal é utilizado como tempero e como aditivo; e sua função é de liga, já que extrai as proteínas miofibrilares. A característica mais visível é a coloração rósea das carnes curadas. Esta coloração é resultante da reação do nitrito com a mioglobina, a qual, quando desnaturada pelo calor, forma uma coloração rósea homogênea. O nitrito fornece um flavor característico e atua como um antioxidante potente na prevenção do desenvolvimento de
off-flavors em carnes curadas durante o armazenamento. Uma das principais funções do nitrito é de
inibir o crescimento de microrganismos deteriorantes e patogênicos, especialmente o Clostridium
botulinum. Os ascorbatos, incluindo o ascorbato de sódio e o ácido eritórbico, são utilizados para
melhorar e manter a coloração de carnes processadas. A função dos fosfatos é de aumentar a suculência e textura e ajudar a prevenir a rancidez da gordura em produtos como presunto, bacon e lingüiças. As carnes podem ser curadas através da mistura direta dos ingredientes curados em
produtos, ou pela injeção de salmouras. Os ingredientes de cura são dissolvidos em água para formar a salmoura, onde esta pode ser incorporada nas carnes pela injeção, tumbleamento, imersão, ou até por uma combinação destas técnicas. A técnica mais utilizada por indústrias é a cura através da injeção (BOYLE e SCHMIDT, 1999). Segundo Roberts & Dainty (1991), os produtos cárneos curados diferem muito em composição e qualidade, porém os tipos de bactérias que crescem nestes produtos são bastante similares pois os principais fatores que controlam seu crescimento são os mesmos.
Publicações sobre predições de vida útil para crescimento microbiano baseado em modelos matemáticos estão sendo realizadas e estão sendo aplicadas para a distribuição de alimentos refrigerados. Fu e Labuza (1993), afirmam que o conceito de microbiologia preditiva deve ser empregado para predições de vida útil baseadas em crescimento microbiano. Zamora & Zaritzky (1986) apresentaram equações matemáticas a fim de estimar o tempo necessário para a carne resfriada embalada a vácuo atingir uma contagem microbiana de 107UFC/cm3 sob diferentes condições de armazenamento (ALMONACID-MERINO e TORRES, 1993). Segundo estes autores, a vida de prateleira de um alimento refrigerado é determinada, a qualquer tempo, pelo efeito cumulativo da temperatura durante o manejo prévio do produto. Infelizmente, o canal de distribuição não é bem equipado para o controle da temperatura ótima durante a distribuição e exposição destes produtos refrigerados. Existem problemas sérios no que se refere à estabilidade microbiana, devido à freqüência de abuso de temperatura. Almonacid-Merino & Torres (1993) citam que a faixa de temperatura ótima para o manuseio e exposição de alimentos refrigerados é de -1 a 2ºC, e nunca acima de 5ºC e que, ganhos na confiança do consumidor na qualidade do produto pode acarretar em um aumento da demanda por produtos refrigerados.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos envolvendo vida-de-prateleira de presunto fatiado foram realizados no Laboratório de Engenharia Bioquímica, do Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, da Universidade Federal de Santa Catarina. Os presuntos fatiados prontos e as massas de presunto foram cedidos por uma indústria localizada no Rio Grande do Sul e trazidos para o laboratório.
2.1 Bactérias ácido-lácticas
Foi avaliado o crescimento da bactéria ácido-láctica denominada Lactobacillus
viridescens. A cepa de L. viridescens (CCT-5843) foi adquirida na Coleção de Cultura Tropical. 2.1.1 Meio de manutenção de Lactobacillus viridescens
As células de L. viridescens foram mantidas em caldo MRS (de MAN et al., 1960) e reativadas a cada 30 dias.
2.1.2 Preparo do inóculo de Lactobacillus viridescens
A cultura de L. viridescens foi reativada em caldo MRS (de MAN et al., 1960) a 30°C por 9 horas, seguido de outra reativação por mais 9 horas à mesma temperatura. Após este período de incubação, foi realizada a contagem da população, que ficou em 106 UFC/mL. Esta
cultura foi utilizada como inóculo para o estudo do crescimento.
2.1.3 Meio de crescimento
As células de L. viridescens foram cultivadas em caldo MRS (de MAN et al., 1960). O crescimento desta bactéria ácido-láctica foi avaliado no próprio caldo MRS, e também no presunto fatiado.
