Estudo reverso da interação entre os mutantes LmEIF4G3-4 com homólogos das subunidades do eIF4F de L major

Para confirmar a ligação específica entre homólogos do eIF4G e as demais subunidades do eIF4F de L. major, foi estabelecido um ensaio reverso a partir da expressão em E. coli de todas as variantes das proteínas LmEIF4G3 e LmEIF4G4 (proteína completa, regiões parciais e proteínas mutadas) em fusão com GST. Estas proteínas recombinantes foram incubadas com as demais subunidades do complexo eIF4F de L. major, marcadas com 35_{S, em ensaios de pull-down. No primeiro ensaio, imobilizamos as variantes da}

proteína LmEIF4G3 na resina Glutationa Sefarose 4B e em seguida incubamos com LmEIF4AI marcado radioativamente. Duas variantes da proteína LmEIF4G3 [(N- terminal+MIF4G (LmEIF4G31-310) e MIF4G+C-terminal (LmEIF4G326-635)] e proteína

LmEIF4G3 completa interagem com o LmEIF4AI. Não ocorreu interação das proteínas mutantes do LmEIF4G3 (FSL/AAA e LNK/AAA) com LmEIF4AI (Figura 26). Comparando os resultados reversos, com os resultados diretos, é possível que a proteína GST-LmEIF4G3 recombinante não se ligue tão bem ao 35S-LmEIF4AI como a proteína GST-LmEIF4AI se liga ao 35S-LmEIF4G3, entretanto a mutação dos aminoácidos LNK/AAA no LmEIF4G3, em ambos os ensaios, abolem a interação ao LmEIF4AI (Figura 24 e 26). Já a mudança dos aminoácidos FSL/AAA, pode induzir alteração na conformação de proteína GST-LmEIF4G3FSL/AAA, justificando sua não interação à proteína LmEIF4AI

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Figura 26. Análise da interação entre a proteína LmEIF4AI e as diferentes proteínas

LmEIF4G3. As diferentes proteínas recombinantes LmEIF4G3 fusionadas a GST (N-

terminal+MIF4G, MIF4G+C-terminal, completa, FSL/AAA e LNK/AAA), foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com a proteína 35S-LmEIF4AI. O painel superior representa as proteínas recombinantes fracionadas em gel 15% SDS- PAGE corado com azul de Coomassie. O painel inferior representa a autoradiografia mostrando as ligações específicas entre as proteínas N-terminal+MIF4G (mais fracamente), MIF4G+C-terminal e LmEIF4G3 completacom a proteína LmEIF4AI (setas).

Em seguida, testamos à capacidade das proteínas GST-LmEIFG3-4 interagirem com os diferentes homólogos LmEIF4E1-4. Confirmamos a interação específica entre a proteína GST-LmEIF4G4 e a proteína 35S-LmEIF4E3, como já esperado, e verificamos ainda a interação específica da proteína GST-LmEIF4G3 com 35S-LmEIF4E4 (Figura 27). Como descrito anteriormente, a proteína 35S-LmEIF4G3 foi capaz de interagir com todos os homólogos LmEIF4E1-4 numa afinidade baixa (Figura 20), todavia o resultado obtido no

99 ensaio reverso sinaliza para uma interação específica apenas entre as proteínas LmEIF4G3 e LmEIF4E4 (Figura 27). Para estudar mais detalhadamente a interação LmEIF4G3/LmEIF4E4, as variantes da proteína LmEIF4G3 (em fusão com GST) foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com a proteína 35S-LmEIF4E4. Neste ensaio foi confirmada a interação entre a proteína LmEIF4E4 e proteínas N- terminal+MIF4G, completa e mutante LNK/AAA, embora não tenha ocorrido interação com MIF4G+C-terminal e a proteína mutante FSL/AAA (Figura 28). Estes resultados demonstram que o motivo de ligação no LmEIF4G3 à proteína LmEIF4E4 está localizado em sua curta região N-terminal (apenas 26 aminoácidos) e envolve um ou mais aminoácidos da trinca FSL, pois quando FSL é modificada para AAA a interação LmEIF4G3/LmEIF4E4 é abolida (Figura 28).

Visando a identificação de domínios de interação e aminoácidos envolvidos na ligação da proteína LmEIF4G4 aos parceiros LmEIF4E3 e LmEIF4AI, diferentes regiões/ou mutações da proteína LmEIF4G4 foram expressas fusionadas à GST (N-terminal+MIF4G, MIF4G+C-terminal, completa, e os mutantes FSL/AAA, KLV/AAA, LNK/AAA e IL/AA) e testadas quanto a sua capacidade de interagir com 35S-LmEIF4E3 (Figura 29) e 35S- LmEIF4A1 (dados não mostrados). Foi confirmado que a proteína LmEIF4E3 interage especificamente com a maioria das variedades da proteína LmEIF4G4, exceto com as proteínas MIF4G+C-terminal e mutante IL/AA (Figura 29). Este resultado confirma que o motivo de interação com LmEIF4E3 está presente na curta região N-terminal da proteína LmEIF4G4, e que a modificação da IL/AA abole a interação LmEIF4G4/LmEIF4E3 (Figura 29). Com relação ao estudo da interação entre as variantes de LmEIF4G4 com a proteína LmEIF4AI, nenhuma interação foi detectada, provavelmente devido a baixa afinidade do

100 LmEIF4G4 pelo LmEIF4A1, (quando comparada a afinidade do LmEIF4G3 pelo LmEIF4AI).

Estes resultados obtidos sinalizam para a presença de pelo menos dois possíveis complexos eIF4F em L. major. Um dos complexos seria formado pelas proteínas LmEIF4E4, LmEIF4G3 e LmEIF4A1, e o outro seria formado pelas proteínas LmEIF4E3, LmEIF4G4 e LmEIF4A1. Estes complexos apresentam propriedades diferentes, quanto a ligação de suas subunidades:a ligação ao LmEIF4A1 é dependente da região C-terminal do LmEIF4G4, diferentemente do LmEIF4G3 que necessita apenas do MIF4G. Além disso, apresentam diferentes motivos de ligação aos seus parceiros eIF4E. O LmEIF4E4 se associa ao LmEIF4G3 através do trio de aminoácidos FSL, dentro do contexto FSLXXV/IV/L. Enquanto a proteína LmEIF4E3 liga-se à região envolvendo os aminoácidos hidrofóbicos IL, do motivo (F/Y/MXXXXI/LR/L), presente na região N-terminal do LmEIF4G4. Este modo diferencial de interação sinaliza para mecanismos únicos, encontrados nestes protozoários, que precisam ser melhor investigados. Atualmente, os motivos de ligação equivalentes nos ortólogos EIF4G3-4 de T.brucei foram modificados por mutações sítio- dirigida, e o efeito destas mutações na interação entre os homólogos ao eIF4F de T. brucei, estão sendo investigados (Danielle do Nascimento Moura, 2009, dados não publicados).

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Figura 27. Análise da interação entre as proteínas LmEIF4G3-4 e as proteínas

LmEIF4E1-4 (ensaio reverso). As proteínas recombinantes GST (controle negativo),

GST-LmEIF4G3 e GST-LmEIF4G4 foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com as proteínas LmEIF4E1-4, marcadas radioativamente com 35S. As autoradiografias demonstram as interações especificas entre os pares de proteínas LmEIF4G3/LmEIF4E4 e LmEIF4G4/LmEIF4E3 (setas).

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Figura 28. Análise da interação entre a proteína LmEIF4E4 e as diferentes proteínas

LmEIF4G3. As proteínas recombinantes LmEIF4G3 fusionadas a GST (N-

terminal+MIF4G, MIF4G+C-terminal, completa e mutantes FSL/AAA e LNK/AAA), foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com a proteína 35_S-

LmEIF4E4. (A) O painel superior representa as proteínas recombinantes fracionadas em gel 15% SDS-PAGE corado com azul de Coomassie. O painel inferior representa a autoradiografia demonstrando ligações específicas das proteínas N-terminal+MIF4G, completa, e mutante LNK/AAA com a proteína LmEIF4E4 (setas). Entretanto não ocorre ligação entre a proteína LmEIF4E4 e as proteínas C-terminal +MIF4G e mutante FSL/AAA (asterisco). (B) Representação esquemática da região N-terminal da proteína LmEIF4G3, indicando que o motivo de ligação ao LmEIF4E4 está presente na região N-terminal e parece envolver pelo menos um dos aminoácidos da trinca FSL (asterisco).

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Figura 29. Análise da interação entre a proteína LmEIF4E3 e as diferentes proteínas

LmEIF4G4. As proteínas recombinantes LmEIF4G4 fusionadas a GST (N-

terminal+MIF4G, C-terminal+MIF4G, completa, e mutantes LNK/AAA, FSL/AAA, M20Y e IL/AA) foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com a proteína

35_{S-LmEIF4E3. (A) O painel superior representa as proteínas recombinantes fracionados}

em gel 15% SDS-PAGE corado com azul de Coomassie. O painel inferior representa a autoradiografia demonstrando ligações específicas de variantes da proteína LmEIF4G4 com a proteína LmEIF4E3 (setas). Neste ensaio, também é evidenciada a ausência de ligação entre proteínas C-terminal +MIF4G e mutante IL/AA (asterisco). (B) Representação esquemática da região N-terminal da proteína LmEIF4G4, indicando que o motivo de ligação ao LmEIF4E3 está presente na região N-terminal e parece envolver pelo menos um dos aminoácidos IL (asterisco).

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