Reação de mutagênese

Inicialmente os oligonucleotídeos liofilizados, sintetizados em um total de 25nM, foram dissolvidos em água deionizada para uma concentração estoque de 1µg/µl. Após a confirmação da concentração e integridade em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, estes oligonucleotídeos foram diluídos para a concentração de uso de 25ηg/µl. Maxipreparações das construções plasmidias pET-LmEIF4G3-4 foram linearizadas com Nco I

73 (LmEIF4G3) e BamH I (LmEIF4G4) e quantificadas em gel, corado com brometo de etídio,

como descrito no tópico 4.1. As quantificações foram ainda confirmadas por espectrofotometria. A mutagênese sítio-dirigida foi realizada numa reação contendo: 5µL de tampão de reação 10 vezes concentrado, 5µL de plasmídeo (6ηg/µl - 30ηg), 5µL do oligonucleotídeo 1 (25ηg/µL - 125 ηg), 5µL do oligonucleotídeo 2 (25 ηg/µl -125 ηg), 1µL de dNTPs (Stratagene®), 28µL de água deionizada e 1µL de DNA polimerase PfuUltra HF (2.5 U/µL). As condições utilizadas na reação de PCR foram: 95ºC por 30 segundos, 55ºC por 1 minuto e 68ºC por 7 minutos (16 ciclos). Como controle da reação foi utilizado o plasmídeo pWhitescriptTM, que contém um códon de parada (TAA) dentro do gene da β-galactosidase na posição onde deveria haver uma Glutamina (CAA - pBluescript), e oligonucleotídeos que permitem reverter esta mutação. Após a reação, 10µL de cada amplificação foram resolvidos em gel de agarose 0.8%, contendo brometo de etídio, e visualizados em transiluminador UV. Em seguida, as reações foram digeridas com 1µL da enzima Dpn I (10 U/µL) a 37 ºC/1h, que digere os plasmídeos não-mutagenizados. Bactérias XL1-Blue eletrocompetentes, previamente preparadas em nosso laboratório, foram transformadas com 1-5µL das reações de mutagênese (tratadas com Dpn I) através de um choque elétrico de 2kV. Após a descarga elétrica, as bactérias foram inoculadas em 1 ml de meio LB puro por 1 hora (para recuperação) e semeadas em placas contendo LB sólido com ampicilina (100 µg/ml), a 37º C por 18 horas. Para avaliar a eficiência de transformação, 1µl do plasmídio pUC19 (0,1ηg) foi transformado nas mesmas condições. Alguns clones transformantes, oriundos da mutagênese, foram inoculados em 2ml de meio LB contendo ampicilina, crescidos a 37ºC por 18 horas e submetidos à minipreparações de DNA (Sambrook e Russell, 2001). Os plasmídeos resultantes, obtidos foram quantificados e seqüenciados, para a confirmação das mutações inseridas.

74 4.5 - Transcrição e expressão de mRNAs sintéticos

Para transcrição in vitro, com a enzima T7 RNA polimerase, primeiro as diferentes construções plasmidiais foram linearizadas com as seguintes enzimas de restrição: [LmEIF4G1, LmEIF4G3-5, LmEIF4E1-4, LmEIF4AI, LmEIF4G3FSL/AAA, LmEIF4G3KLV/AAA,

LmEIF4G4FSL/AAA, LmEIF4G4M20Y, LmEIF4G4M20S, LmEIF4G4M20D, LmEIF4G4M20A e

LmEIF4G4IL (clonados nos vetores pET21a ou pET21d, com Not I)]; [LmEIF4G2, LmEIF4AI e LmEIF4AIII (clonados nos vetores pET21d ou pRSETA, com Xho I)]; [LmEIF4G3LNK/AAA,

LmEIF4G4KLV/AAA, LmEIF4G4LNK/AAA (clonado no pET21a ou pET21d com Pvu I)]; [TbEIF4E1 e TbEIF4E3 (clonados no vetor pGEM3zf+ com Xba I)]; [TbEIF4E2 e TbEIF4E4 (clonados no vetor pGEM3zf+ com BamH I)]. O gene codificando o eIF4G humano foi obtido a partir de uma construção no pBluescript KS (Melo et al., 2003), linearizada com Sac I. As reações de transcrição foram realizadas em um volume final de 50µL contendo: 5µL tampão de transcrição 10 vezes concentrado (400mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM MgCl2), 2µL de solução de rNTPs [100mM-ATP, CTP, UTP e 10mM-GTP (GE Healthcare®)], 5µL de 10mM m7-GTP (New England Biolabs®) a 5 mM na reação, 0.5µL de 1M DTT, 1.5 µL de inibidor de RNAse (GE Healthcare®), 2µL T7 RNA polimerase 5U/µL (Usb®), 3µg de DNA plasmidiale 3 µg de DNA plasmidial cortado com enzima de restrição 3’ imediatamente após o gene, e água deionizada, tratada com DEPC, para 50µL final. A reação foi incubada por 2 horas a 37ºC, após os 30 minutos iniciais foi adicionado 0.5 µl de 100mM GTP, e após mais 30 minutos foi adicionado 0.5µl de T7 RNA polimerase. Ao término das reações de transcrição, 1µL de cada transcrito sintetizado foi analisado em gel de 1% agarose corado com brometo de etídio. Os mRNAs sintéticos obtidos foram extraídos em fenol/cloroformio 1:1, precipitados com 100% etanol / 0,3M NaCl e ressuspendidos em 20µL água deionizada tratada com DEPC. Alíquotas de 0.1µL, 0.2µL e 1 µL dos RNAs purificados foram traduzidas

75 em lisado de reticulócito de coelho (RRL), de acordo com as recomendações do fabricante

(Promega®): 3.6µL de lisado, 0.2µL de solução de aminoácidos livre de metionina, 0.2µL de metionina marcada com 35S-10µCi/µL e 1µL de RNA. As reações de tradução foram realizadas na temperatura de 30°C, durante 90 minutos. Após a tradução, alíquotas de 5µL de cada amostra foi acrescida de tampão de amostra para, gel de SDS-PAGE, e submetida à migração por eletroforese. Após a migração, o gel foi corado com azul de Coomassie R-250 (Sigma®) e submetido a secagem em papel de filtro a 70°C, durante uma hora, sob vácuo. Para a visualização das proteínas recombinantes marcadas 35S, o gel foi exposto a um filme de autoradiografia (BioMax MR,Kodak®), que foi em seguida revelado.

4.6 - Ensaio de interação proteína-proteína (Pull-Down)

Para os ensaios de interação proteína-proteína (pull-down), as resinas Ni-NTA Agarose ou Glutationa Sefarose 4B foram previamente equilibradas com o tampão de ligação B (100mM KCl, 1 mM MgCl2, 50mM Hepes pH 7.2, 0.2% NP-40, 5% glicerol). O tampão B foi acrescido de 10mM imidazol nos ensaios com as proteínas de fusão com cauda de poli- Histidinas, para evitar ligações inespecíficas com a resina Ni-NTA Agarose, enquanto nos experimentos com as proteínas de fusão GST a resina Glutationa Sefarose 4B foi previamente bloqueada com 10µg/µL de BSA, com a mesma finalidade. Para cada ensaio, aproximadamente 10µL de cada resina bloqueada foi incubada com 2µg de proteína recombinante em um volume final de 200µL (em tampão B), durante 1 hora/sob agitação/ a 4oC. As resinas foram lavadas duas vezes com tampão B e incubadas com 5µL de proteínas marcadas radioativamente (no volume final de 200µL em tampão B), durante 2 horas/sob agitação/a 4oC. Após três lavagens com 500 µL de tampão B, as proteínas ligadas às resinas foram eluídas com 40µL de tampão de amostra para SDS-PAGE e 10µL de cada amostra

76 foram submetidas a eletroforese em gel 15%. Os géis foram corados com azul de Coomassie

R-250, para a visualização das proteínas recombinantes e submetidos à autoradiografia (como descrito anteriormente) para visualização das proteínas radioativas marcadas com 35S (Einarson, 2001; Dhalia et al., 2005). A figura 4 ilustra um ensaio de interação proteína- proteína, pull-down, entre uma proteína recombinante fusionada à GST e uma proteína marcada radioativamente com 35S.

Figura 15. Esquema da técnica de Pull-Down usando a proteína isca (I) expressa em bactéria e a proteína presa (P) expressa em sistema de tradução de mamíferos (marcada com 35S). 1- A seqüência codificando para a isca (I) foi clonada no vetor pGEX4T3; 2- Expressão da proteína I fusionada a GST, em E. coli. 3- A proteína GST-I purificada,

77 dialisada e quantificada foi imobilizada na resina Glutationa Sefarose 4B (GS); 4- A

seqüência codificante para a proteína presa (P) foi clonada nos vetores pET21a, pET21d ou pGEM3zf+, que permitem a sua transcrição in vitro; 5- Síntese da proteína 35S-P, em sistema de tradução de mamíferos; 6- Uma alíquota da proteína GST-I, imobilizada na resina GS, é incubada com a proteína 35S-P por duas horas a 4ºC; 7- Após lavagens, para remover ligações inespecíficas, as proteínas presa e isca são eluídas da GS. As proteínas são em seguida fracionadas em SDS-PAGE 15%, corado com azul de Coomassie R-250 para visualização das proteínas recombinantes e as proteínas radioativas foram detectadas por autoradiografia.