Etapas e grupos experimentais

O experimento compreendeu em duas etapas simultâneas. A fase in vivo foi denominada de primeira etapa, e a fase in vitro, denominada de segunda etapa, ambas com mesmo número de amostras e momentos experimentais, realizadas simultameamente (Quadro 1).

QUADRO 1. Grupos e conduta experimental utilizada, etapas in vivo (composto

por seis galinhas poedeiras) e in vitro (composto por seis placas contendo meio de cultivo BSK).

Grupos (in vivo e in vitro)

Abreviação Conduta experimental Controle G1 Soro obtido de aves saudáveis

Doença G2 Inoculação de soro obtido de aves parasitadas com Borrelia anserina

(0,44x106 _{espiroquetas/ mL)}

Tratado G3 Soro parasitado com Borrelia anserina tratado por luz visível associada à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio

Luz visível G4 Soro parasitado com Borrelia anserina irradiado por luz visível

Nanoemulsão G5 Soro parasitado com Borrelia anserina associado a emulsão utilizada na diluição da ftalocianina de cloro-alumínio

Ftalocianina G6 Soro parasitado com Borrelia anserina associado à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio

Imunossupressão G7 Soro obtido de aves imunossuprimidas com acetato de metilprednisolona

3.5.1. Primeira etapa experimental (in vivo)

As galinhas foram submetidas a um período de sete dias de adaptação; posteriormente foram realizados exames de diagnóstico: exame clínico (Feitosa, 2008), avaliação da espiroquetemia por meio de microscopia de campo escuro (MCE) (Dhawedkar e Dhanesar, 1983). A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) protocolo padronizado no Laboratório de Virologia e Diagnóstico Molecular, do Departamento de Microbiologia e Imunologia, do Instituto de Biociências da UNESP. A dosagem de imunoglobulina Y (IgY) protocolo padronizado no Laboratório de Doenças Parasitárias, do Departamento de Epidemiologia e Saúde Pública, da UFRRJ. As análises bioquímicas de colesterol, triglicerídeos, fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), volume globular (VG) e proteína plasmática total (PPT) segundo Thrall (2012), das 42 aves para servir como referência de padrão normal, momento zero (M0).

Posteriormente foi realizada a imunossupressão das aves dos grupos: G2 (doença), G3 (tratado), G4 (luz visível), G5 (nanoemulsão), G6 (fatlocianina) e G7 (imunossupressão) utilizando 30 mg de acetato de metilprednisolona (Depo, Medrol®), por via intramuscular, em dose única (ATALIBA et. al., 2007), com intuito de tornar as aves mais susceptíveis à infecção com Borrelia

anserina. No dia seguinte, foi realizado o tratamento do sangue parasitado por B. anserina utilizando luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio.

Imediatamente após o tratamento, foi feita a inoculação de 0,25 mL do soro parasitado tratado nas aves receptoras, por via intramuscular (músculo peitoral) (Figura 3). A inoculação dos grupos experimentais foi realizada de acordo com o citado anteriormente no item 3.2. Animais experimentais.

Foi realizado o acompanhamento diário das aves por 45 dias; a cada cinco dias foram realizados exames diagnósticos, nos dias cinco, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 45 após inoculação.

3.5.2. Segunda etapa experimental (in vitro)

No primeiro momento foram realizados exames laboratóriais para diagnóstico de borreliose, por meio de MCE e PCR da cepa utilizada e,

posteriormente, foi realizada a inoculação de seis placas por grupo, dos sete grupos in vitro em meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) enriquecido com 6% de soro de coelho. G1 (controle - placa) foi inoculado com sangue proveniente de animais saudáveis, sem borreliose; G2 (doença - placa) recebeu inoculação de cepa parasitada por B. anserina; G3 (tratado - placa) foi inoculado com sangue proveniente de animais imunossuprimidos; G4 (luz visível - placa) recebeu soro parasitado tratado por luz visível; G5 (nanoemulsão - placa) recebeu soro parasitado associado apenas a nanoemulsão utilizada na diluição da ftalocianina; G6 (ftalocianina - placa) recebeu soro parasitado associado à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio; G7 (Imunossupressão - placa) recebeu cepa parasitada tratada por meio da luz visível associada à ftalocianina de cloro-aluminio.

Para realização da inoculação em meio de cultura, obteve-se soro com as espiroquetas segundo protocolo descrito por Labruna et al., (1999), onde foi colhido o volume de aproximadamente 60 mL de sangue total, em tubos contendo gel ativador de coágulo, deixando coagular em temperatura ambiente por 2 a 3 horas, do volume de soro obtido foi utilizado 0,25 mL para inoculação em 2 mL do meio BSK, acondicionado em placas de cultivo celular. Todo o processo de inoculação foi feito em fluxo laminar com material estéril.

O acompanhamento foi realizado por 45 dias, onde a cada cinco dias, eram realizados exames diagnósticos e 0,5 mL do meio deve ser repicado para um novo meio e o restante congelado a -80°C com solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10%.

3.5.3. Redução de patógenos por meio de tratamento com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio

Para irradiação com luz visível associada à ftalocianina de cloro- alumínio, foi utilizado o sistema que atua no comprimento de onda na faixa do visível de 660 nm. O dispositivo utilizado neste estudo foi o sistema BTH Quantum Tech. Este sistema de luz é contínuo (CW), com uma potência total na fibra óptica ao redor 0,3 W, contendo 6 mL da suspensão contendo Borrelia

anserina a qual foi adicionada a um volume fixo de emulsão de ftalocianina em

concentração de 5 uM. Este material foi submetido ao período de 15 minutos de incubação e posterior irradiação unilateral de luz visível com comprimento na faixa descrita acima, na dose de luz de 10 J/cm-2_{, agitado constantemente} por um intervalo de tempo proporcional a dose utilizada de modo que a irradiação fosse uniforme em toda a amostra, com duração de 18 minutos e 30 segundos. Todo o processo foi feito em fluxo laminar com material estéril. Após os procedimentos de inativação as amostras foram inoculadas em aves imunossuprimidas para posterior avaliação.

(A) (B)

FIGURA 3. Inoculação de 0,25 mL de soro parasitado com Borrelia anserina

tratado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio, nas galinhas poedeiras receptoras, por via intramuscular (músculo peitoral). (B) Tratamento do sangue parasitado com Borrelia anserina na tentativa de inativação com luz visível associada à fatlocianina de cloro-alumínio. O aparelho de irradiação de luz LED, não pode ser exposto devido a processo de registro de patente. Fonte: Lopes, 2015.