O Exame a fresco baseia-se na observação directa da amostra ao microscópio, preservando a forma natural dos microrganismos.
O exame a fresco permite apreciar a presença de elementos celulares e microrganismos, nomeadamente, bactérias, fungos e parasitas. É executado colocando o produto numa lâmina, cobrindo com uma lamela e observando ao microscópico óptico com objectiva de 40x (32).
4.4.2 Exame corado
O exame pós-coloração (fixação e coloração de microrganismos), facilita a posterior observação microscópica.
Este, permite avaliar as características morfológicas das bactérias no que se refere à sua forma e afinidade para os corantes.
Existem vários tipos de coloração, tendo sido utilizados durante o estágio as seguintes colorações (32)
4.4.2.1 Coloração diferencial – Método de Gram
Certas bactérias, quando tratadas por um corante básico de pararosanilina (ex.: violeta de cristal), e seguidamente pelo iodo, fixam o corante de tal modo que este não é removido pelo diferenciador álcool-acetona. A estas bactérias dá-se o nome de bactérias Gram-
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positivas, e coram de azul escuro. A parede das bactérias Gram-positivas é constituída por uma camada espessa de peptidoglicano, suficientemente porosa para permitir a passagem de metabolitos para a membrana plasmática. Outras bactérias são descoradas quando é aplicado o diferenciador álcool – acetona, e designadas de Gram-negativas. Estas bactérias apresentam uma fina camada de peptidoglicano na constituição da parede. Para que se possam ver mais facilmente quando observadas ao microscópio, aplica-se um corante de contraste de cor vermelha (fucsina ou safranina).
É a coloração mais recorrente no laboratório de Microbiologia, formando a base para distinguir os grupos mais importantes de bactérias: Gram-positivas e Gram-negativas. É ainda possível observar, através da coloração de Gram, as diferentes morfologias que as bactérias podem apresentar. Deste modo, as bactérias podem apresentar forma esférica (cocos), forma de bastonete (bacilo), forma oval (cocobacilo), forma de vírgula (vibrião), forma ondulada (espirilo), ou em forma de espiral (espiroqueta).
Algumas bactérias formam ainda agregados podendo dispor-se em: diplococos, cachos e cadeias (32,33).
Reagentes:
1) Solução de violeta de cristal (cristal violeta – 18 g, álcool etílico desnaturado – 200 ml, oxalato de amónio – 8 g, água destilada estéril – 800 ml);
2) Solução de lugol (iodo – 13 g, iodeto de potássio – 20 g, PVP – 100 g, água destilada estéril – 970 ml);
3) Descolorante (álcool etílico desnaturado – 500 ml, acetona – 500 ml); 4) Solução de safranina (safranina – 2,4 g; álcool etílico desnaturado – 100 ml,
água destilada estéril – 900 ml). Procedimento:
1) Espalhar em camada fina a amostra a examinar numa lâmina, secar e fixar ao calor;
2) Cobrir o esfregaço com cristal violeta, aguardar 1 minuto e passar cuidadosamente por água;
3) Cobrir com a solução de lugol, deixar em contacto durante 1 minuto e passar com cuidado por água;
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5) Cobrir com safranina, deixar em contacto durante 1 minuto, passar cuidadosamente por água e secar.
Princípio:
Após a fixação da amostra na lâmina pelo calor, as bactérias são expostas ao cristal violeta (corante primário) e o iodo é adicionado, formando um complexo com o primeiro. Quando é aplicada a solução descolorante, o complexo é retido nas bactérias gram- positivas, mas não nas gram-negativas. Nas bactérias do tipo Gram-positivo o corante fica confinado na camada espessa de peptidoglicano que constitui a parede e estas apresentam uma coloração violeta. Ao invés, as bactérias Gram-negativas como possuem uma camada de peptidoglicano muito fina, não retêm o corante primário aquando da descoloração, sendo necessário realizar uma contra-coloração com safranina, que lhes dá uma aparência avermelhada (32).
4.4.2.2 Coloração de Ziehl-Neelsen modificado (Coloração álcool-ácido resistente) Certos microrganismos possuem na sua parede ácidos gordos de cadeia longa (ácido micólico), que conferem impermeabilidade ao violeta de cristal e a outros corantes básicos. Calor ou detergentes devem ser usados para permitir a entrada de corantes primários nestas bactérias. Uma vez dentro das células bacterianas, o corante não é eliminado mesmo com solvente álcool-ácido. A coloração Ziehl-Neelsen tem como princípio fundamental a coloração álcool-ácido-resistente de microrganismos e diferencia grupos específicos de bactérias como Mycobacterium spp e Criptosporidium sp.
É utilizada para corar micobactérias e outros organismos álcool-ácido-resistentes. Reagentes:
1) Carbolfucsina (reagente de Kynioun-Biomérieux);
2) Solução ácido-alcoólica (970 ml de álcool etílico 96% + 30 ml de HCl); 3) Solução de azul-de-metileno (Solução de Gabett-Biomérieux).
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1) Espalhar em camada fina a amostra a examinar numa lâmina, secar e fixar ao calor;
2) Cobrir o esfregaço com solução de carbolfucsina;
3) Aguardar durante 5 minutos, escorrer o corante e lavar cuidadosamente com água;
4) Adicionar a solução ácido-alcoólica, deixar em contacto durante 3 minutos e lavar suavemente com água destilada;
5) Cobrir a lâmina com azul-de-metileno e deixar em contacto durante 1 minuto; 6) Passar por água destilada e deixar secar.
Princípio:
A parede das micobactérias possui cadeias longas de ácidos gordos denominados ácidos micólicos, que tornam a bactéria bastante hidrofóbica e a protegem de ácidos e bases fortes, bem como de agentes tóxicos e antibióticos que necessitam de uma solução aquosa. A coloração de Ziehl-Neelsen modificada a frio utiliza carbolfucsina contendo fenol que solubiliza os lípidos da parede bacteriana e auxilia a penetração do corante. Durante a descoloração com solução ácido-alcoólica os microrganismos que não possuem ácidos micólicos na parede libertam o corante primário, enquanto as micobactérias permanecem coradas de vermelho. Finalmente, realiza-se uma contra-coloração com azul-de-metileno que vai corar o fundo e os restantes microrganismos de azul (32).
4.4.2.3 Coloração com fucsina de Ziehl
É utilizada para identificar colónias suspeitas de Campylobacter spp., através da observação da sua morfologia.
Procedimento:
1) Efectuar esfregaço das colónias suspeitas;
2) Cobrir a Lâmina com fucsina durante 1 a 3 minutos (ou 10 segundos no caso do
Campylobacter spp.);
3) Lavar cuidadosamente com água; 4) Secar.
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