A criptosporidiose em indivíduos infetados com VIH: influência da patogénese na clínica, imunologia e prevenção

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO E MONOGRAFIA

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS Ana Paula Way Yong de Vila Fernandes

LISBOA 2016

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Relatório de Estágio e Monografia

i Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

As Palavras São como um cristal, as palavras. Algumas, um punhal, um incêndio. Outras, orvalho apenas. Secretas vêm, cheias de memória. Inseguras navegam: barcos ou beijos, as águas estremecem. Desamparadas, inocentes, leves. Tecidas são de luz e são a noite. E mesmo pálidas verdes paraísos lembram ainda. Quem as escuta? Quem

as recolhe, assim, cruéis, desfeitas, nas suas conchas puras? Eugénio de Andrade in O Coração do Dia

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Relatório de Estágio e Monografia

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Relatório de Estágio e Monografia

iii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

Aos que, por gestos, palavras ou actos, me ajudaram a chegar aqui.

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Relatório de Estágio e Monografia

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Relatório de Estágio e Monografia

v Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

Por vontade da autora, o texto deste TRABALHO FINAL – Relatório de Estágio (1ª Parte) e Monografia (2ª Parte) – não segue as normas do novo acordo ortográfico.

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Relatório de Estágio e Monografia

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vii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

1ª Parte

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

+

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

Laboratórios Labco - Hospital da Luz e Soprelab - Santa Isabel

Orientação: Drª Isabel Alexandra Oliveira Mendes Pereira Moutinho Gonçalves

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS Ana Paula Way Yong de Vila Fernandes

LISBOA 2016

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Relatório de Estágio

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Relatório de Estágio

xi Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

AGRADECIMENTOS

À Senhora Professora Doutora Cristina Marques, pelos contactos prévios que estabeleceu para que me fosse possível realizar o estágio profissionalizante numa entidade prestigiada e pela forma como comigo comungou o saber que todos lhe reconhecem. Espero honrar essa distinção.

À Senhora Prof. Doutora Quirina Santos Costa por, para além da orientação e revisão da monografia, se ter disponibilizado a orientar a revisão do presente Relatório de Estágio.

Ao Senhor Prof. Doutor Paulo Paixão, Drª Isabel Moutinho, Drª Anabela Cunha e demais colaboradores da Labco, pela atenção e ajuda que me dispensaram durante o estágio.

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Relatório de Estágio

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Relatório de Estágio

xiii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

LISTA DE SIGLAS, ACRÓNIMOS E ABREVIATURAS

ACTH _{Hormona adrenocorticotrófica}

ADH Hormona anti-diurética

ADP Adenosina difosfato

AEQ Avaliação Externa da Qualidade

AES Advanced Expert System

AGJ Anomalia de glicémia em jejum

A-KG 2-oxoglutarato

ALP Fosfatase alcalina

ALT Alanina aminotransferase

AMP 2-amino-2-metil-1-propanol

aPTT Tempo de tromboplastina parcial activada

AST Aspartato aminotransferase

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosina trifosfato

ATP III Adult Treatment Panel

BAAR Bacilos álcool-ácido resistentes

BC Bilirrubina conjugada

BCP Púrpura de bromocresol

BE Excesso de base

BHI Caldo Coração - Cérebro

BNC Bilirrubina não conjugada

BNP Péptido natriurético cerebral

CAM Gelose Campylosel

CAN2 Gelose chromID™ Candida

CDC Center for Disease Control

CE Esterase do colesterol

CHCM Concentração de hemoglobina celular média

CHGM/MCHC Concentração de hemoglobina globular média

CIVD Coagulação intravascular disseminada

CK Creatina cinase

CK-MB Creatina cinase “muscle-brain”

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CNA Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro

CNP 2-cloro-4-nitrofenol

CNP-G2 2-cloro-4- nitrofenol-α-D-maltósido

CNP-G3 2-cloro-4-nitrofenol-α-D-maltotriose

CO Oxidase do colesterol

COS Gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro

CPS3 Gelose chromIDTM_CPS®

CQE Controlo da Qualidade Externo

CQI Controlo da Qualidade Interno

CRMLN Cholesterol Reference Method Laboratory Network

DEA-HCl/AAP N,N-dietilamina-HCl/4-aminoantipirina

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Relatório de Estágio

xiv Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

DIG Diagnóstico Imunológico da Gravidez

DM Diabetes mellitus

DMG Diabetes mellitus gestacional

EDTA Etileno Diamina Tetra-Acético

EGTA Etileno Glicol Tetra-Acético

G3 Maltotriose

GCNA L-gama-glutamil-3-carboxi-4-nitranilida

GFR Taxa de filtração glomerular

GK Glicerol quinase

GLDH Glutamato desidrogenase

GPO Glicerol-3-fosfato-oxidase

GRAN Gelose Granada™

HAE2 Gelose Chocolate Haemophilus 2

Hb Hemoglobina

HbA1C Hemoglobina glicada A1C

hCG Gonadotrofina coriónica humana

HCO3- Bicarbonato

HCP-1 Proteína transportadora do heme-1

HEKT Gelose Hektoen

Hg Concentração de Hemoglobina

HGM/MCH Hemoglobina globular média

HGPRT Hipoxantina-guanina fosforibosil transferase

HM Imunoensaio heterogéneo

HPO Peroxidase de Rábano Silvestre

Ht Hematócrito

IAM Infarto agudo do miocárdio

ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva

ICSH International Council for Standarddization in Haematology

IFCC International Federation of Clinical Chemistry

IL Interleucina

IMT IMT-Tecnologia de multisensores integrados

INR Razão normalizada internacional

INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

IRC Insuficiência Renal Crónica

IREG-1 Ferroportina

ISE Eléctrodo selectivo de iões

ISI Índice Internacional de sensibilidade

IV Intravenosa

LBA Lavado Bronco Alveolar

LCR Líquido cefalorraquidiano

LDH Lactato desidrogenase

LED Díodos emissores de luz

MCK Gelose Mac Conkey

MDH Malato desidrogenase

MRSA Staphhylococcus aureus resistente à meticilina

MSA Gelose Chapman 2 (Manitol salgado)

MTB Azul de metiltimol

NAD Nicotinamida adenina dinucleótido

NADH Forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleótido

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Relatório de Estágio

xv Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

NCCLS National Commitee for Clinical Laboratory Standars

NCEP III National Cholesterol Education Program

NEQAS National External Quality Assesment Service for

Microbiology

NRBC Eritrócitos nucleados

NT-ProBNP Fracção terminal N do péptido natriurético cerebral

OCPC Cálcio o-cresolftaleína complexona

OMS OMS - Organização Mundial de Sáude

Ox Oxacilina

P5P Piridoxal-5-fosfato

pCO2 Pressão parcial de dióxido de carbono

PCR Proteína C-reactiva

PDF Produtos de degradação da fibrina/fibinogénio

Pen Penicilina

PERH Plano Estratégico dos Resíduos Hospitalares

PETINIA Imunoensaio de inibição turbidimétrico melhorado de

partículas homogéneas

PMAPS Sulfato de p-metilaminofenol

PMT-1 Transportadora de metal divalente

p-NP p-nitrofenol

p-NPP p-nitrofenilfosfato

pO2 Pressão parcial de oxigénio

POD Peroxidase

PR Vermelho de pirogalol

PT Tempo de protrombina

PTH Hormona paratiróideia

PTOG Prova de Tolerância Oral à Glucose

R Resistente

RBC Eritrócitos

RDW Coeficiente de dispersão eritrocitária

RET Reticulócitos

RNA Ácido ribonucleico

rpm Rotações por minuto

S Sensível

S Soro

SatO2 Saturação de oxigénio

SB Secreções Brônquicas

SCA Síndrome coronário agudo

SCS Gelose Schadler + 5% de sangue de carneiro

SDS Sulfato dodecil

SELENITO F- T Caldo selenito

SIADH Síndrome de secreção inapropriada de hormona anti-diurética

TDG Tolerância diminuída à glucose

TODD H-T Caldo Todd Hewitt + Antibióticos

TP Tempo de Protrombina

TSA Teste de susceptibilidade aos antibióticos

TT Tempo de Trombina

U Urina

UFC Unidades formadoras de colónias

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Relatório de Estágio

xvi Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

VCA3 Gelose Chocolate PolyVitex

VGM/MCV Volume globular médio

VS Velocidade de sedimentação

YER Gelose Yersinia

β-HCG Subunidade Beta da Gonadotrofina Coriónica Humana

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Relatório de Estágio

xvii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ... XI LISTA DE SIGLAS, ACRÓNIMOS E ABREVIATURAS ... XIII ÍNDICE DE FIGURAS ... XXV ÍNDICE DE TABELAS ... XXVII RESUMO ... XXIX ABSTRACT ... XXXI

1 INTRODUÇÃO... 1

2 CONTROLO DA QUALIDADE ... 7

2.1 CONTROLO INTERNO ... 7

2.2 CONTROLO QUALIDADE EXTERNO ... 9

3 GESTÃO DE RESÍDUOS HOSPITALARES ... 11

3.1 ENQUADRAMENTO LEGISLATIVO ... 12

4 VALÊNCIA DE MICROBIOLOGIA... 15

4.1 INTRODUÇÃO ... 15

4.2 RESUMO DAS ANÁLISES EFECTUADAS NA SECÇÃO DE MICROBIOLOGIA ... 16

4.3 MEIOS DE TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO ... 17

4.3.1 Meios de STUART ... 18

4.3.2 Meio de Amies com carvão ... 18

4.3.3 Meio PORTAGERM™ ... 19

4.4 EXAME MICROSCÓPICO ... 19

4.4.1 Exame a fresco ... 19

4.4.2 Exame corado ... 19

4.4.2.1 Coloração diferencial – Método de Gram ... 19

4.4.2.2 Coloração de Ziehl-Neelsen modificado (Coloração álcool-ácido resistente) 21 4.4.2.3 Coloração com fucsina de Ziehl ... 22

4.5 IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS ... 23

4.5.1 Testes manuais ... 23

4.5.1.1 Teste da catalase ... 23

4.5.1.2 Teste da coagulase ... 24

4.5.1.3 Identificação serológica do Grupo de Lancefield ... 25

4.5.1.4 Teste da citocromo oxidase ... 25

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Relatório de Estágio

xviii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

4.5.1.6 Prova de Filamentação ou Blastese ... 27

4.6 CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO ... 28 4.6.1 Humidade ... 28 4.6.2 Temperatura ... 28 4.6.3 Atmosfera ... 28 4.7 TÉCNICAS DE SEMENTEIRA ... 29 4.7.1 Meios sólidos ... 30 4.7.2 Meios líquidos ... 30 4.8 MEIOS DE CULTURA ... 30

4.9 COLHEITA, PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS . 32 4.9.1 Urina asséptica... 32

4.9.1.1 Colheita... 32

4.9.1.1.1 micção “jacto médio” ... 32

4.9.1.1.2 punção de cateter urinário ... 32

4.9.1.1.3 punção supra-púbica ... 32

4.9.1.1.4 saco colector em crianças ... 33

4.9.1.2 Processamento ... 33

4.9.1.3 Interpretação de resultados ... 34

4.9.1.3.1 Exame directo a fresco ... 34

4.9.1.3.2 Exame directo corado ... 34

4.9.1.3.3 Exame cultural ... 34

4.9.1.4 Agentes etiológicos mais frequentes ... 35

4.9.2 Exsudado faríngeo ... 35

4.9.2.1 Colheita... 36

4.9.3 Exsudado nasal ... 36

4.9.3.1 Colheita... 36

4.9.3.3 Interpretação de Resultados ... 37

4.9.4 Expectoração/secreções brônquicas... 37

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Relatório de Estágio

xix Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

4.9.4.1.1 Expectoração ... 37

4.9.4.1.2 Secreções brônquicas ... 38

4.9.4.2 Exame directo e exame cultural ... 38

4.9.4.2.1 Exame directo ... 38

4.9.4.2.2 Exame cultural ... 38

4.9.4.3.1 Agentes etiológicos mais frequentes ... 39

4.9.5 Lavado bronco-alveolar ... 39

4.9.5.1 Colheita... 39

4.9.6 Exsudado purulento ... 40

4.9.6.1 Colheita... 40

4.9.6.1.1 Exsudados de lesões fechadas ... 40

4.9.6.1.2 Exsudados de lesões abertas ... 41

4.9.6.1.3 Exsudado ocular ... 41 4.9.6.1.4 Exsudado auricular ... 41 4.9.6.2 Processamento ... 42 4.9.6.2.1 Exame directo ... 42 4.9.6.2.2 Exame cultural ... 42 4.9.6.3 Interpretação de Resultados ... 43

4.9.6.4.1 Infecções do ouvido ... 43

4.9.6.4.2 Infecções oculares ... 43

4.9.6.4.3 Abcessos viscerais ... 43

4.9.6.4.4 Queimaduras ... 43

4.9.6.4.5 Infecções da pele e tecidos moles ... 44

4.9.7 Exsudado vaginal ... 44

4.9.7.2.1 Exame directo a fresco ... 44

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Relatório de Estágio

xx Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

4.9.7.2.3 Exame cultural ... 45 4.9.7.3 Agentes etiológicos mais frequentes ... 45 4.9.8 Exsudado anal/vaginal para a pesquisa de Streptococcus do grupo B ... 45 4.9.8.1 Colheita... 45 4.9.8.2 Processamento ... 45 4.9.8.3 Interpretação de resultados ... 46 4.9.9 Exsudado uretral ... 46 4.9.9.1 Colheita... 46 4.9.9.2 Processamento ... 46 4.9.9.3 Interpretação de resultados ... 46 4.9.9.3.1 Exame directo a fresco ... 46 4.9.9.3.2 Exame directo corado ... 47 4.9.9.3.3 Exame cultural ... 47 4.9.9.4 Agentes etiológicos mais frequentes ... 47 4.9.10 Fezes – Coprocultura ... 47 4.9.10.1Colheita... 47 4.9.10.2Processamento ... 48 4.9.10.3Interpretação de resultados ... 48 4.9.10.3.1Exame cultural ... 48 4.9.10.4Agentes etiológicos mais frequentes ... 48 4.9.11 Sangue – hemocultura ... 48 4.9.11.1Colheita... 48 4.9.11.2Processamento ... 50 4.9.11.3Interpretação de resultados ... 51 4.9.11.3.1Exame directo corado ... 51 4.9.11.3.2Exame cultural ... 51 4.9.11.3.3Contaminação vs infecção: ... 51 4.9.11.3.4Hemoculturas polimicrobianas ... 52 4.9.11.3.5Comunicação de resultados ... 52 4.9.11.4Agentes etiológicos mais frequentes ... 52 4.9.12 Catéteres vasculares – Método de Maki ... 53 4.9.12.1Colheita... 53 4.9.12.2Processamento ... 53

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Relatório de Estágio

xxi Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

4.9.12.3Interpretação de resultados ... 54 4.9.12.4Agentes etiológicos mais frequentes ... 54 4.9.13 Líquido Cefalorraquidiano ... 54 4.9.13.1Colheita... 54 4.9.13.2Processamento ... 54 4.9.13.3Interpretação de resultados ... 55 4.9.13.3.1Exame directo corado ... 55 4.9.13.3.2Exame cultural ... 56 4.9.13.4Agentes etiológicos mais frequentes ... 56 4.9.14 Líquidos orgânicos Cefalorraquidiano ... 56 4.9.14.1Colheita... 56 4.9.14.2Processamento ... 57 4.9.14.3Interpretação de resultados ... 57 4.9.14.3.1Exame directo corado ... 57 4.9.14.3.2Exame cultural ... 58 4.9.14.4Agentes etiológicos mais frequentes ... 58 4.9.15 Esperma... 58 4.9.15.1Colheita... 58 4.9.15.2Transporte e estabilidade: ... 59 4.9.15.3Processamento ... 59 4.9.15.4Interpretação de resultados ... 59 4.9.15.4.1Exame directo corado ... 59 4.9.15.4.2Exame cultural ... 60 4.9.16 Dermatófitos ... 60 4.9.16.1Análise micológica de pele, pelos/cabelos e unhas ... 60 4.9.16.1.1Exame directo a fresco ... 60 4.9.16.1.2Exame cultural ... 61 4.9.17 Técnicas automatizadas ... 61 4.9.17.1Mini API_{... 61} 4.9.17.1.1API_{NH ... 62} 4.9.17.1.2ATB HAEMO ... 62 4.9.17.1.3ATB STREP 5... 63 4.9.17.2Vitek _{2 ... 63}

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Relatório de Estágio

xxii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

4.9.17.3VITEK®_{MS ... 66} 4.9.17.4BACT/ALERT®_{3D/120 – BioMérieux ... 67} 4.9.17.5Frascos de Cultura BacT/ALERT ... 69 4.9.18 Detecção de antigénios ... 70 4.9.19 Identificação de microrganismos isolados com maior frequência ... 71

4.10 TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ... 76 4.11 DIAGNÓSTICO DE CLAMÍDIA ... 85

4.11.1 Clearview®_{Chlamydia MF ... 85} 4.12 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES ... 86

4.12.1 Concentrador Easy-Copros para parasitas intestinais ... 86

4.13 EXAME DE FEZES ... 89

4.13.1 Pesquisa de Sangue oculto ... 89

4.14 GENOMERA™ _{CLOSTRIDIUM DIFFICILE ASSAY ... 90}

5 VALÊNCIA DE HEMATOLOGIA ... 93 5.1 INTRODUÇÃO ... 93 5.2 ADVIA®_{120 ... 94} 5.2.1 Eritrograma ... 95 5.2.1.1 Contagem de eritrócitos (RBC) ... 96 5.2.1.2 Doseamento de hemoglobina (Hb) ... 97 5.2.1.3 Hematrócrito (Ht) ... 98 5.2.1.4 Índices Eritrócitários ... 99 5.2.1.4.1 Volume Globular Médio (VGM/MCV) ... 99 5.2.1.4.2 Coeficiente de Dispersão Eritrocitário (RDW) ... 99 5.2.1.4.3 Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM/MCHC) ... 99 5.2.1.4.4 Concentração de Hemoglobina Celular Média (CHCM) ... 100 5.2.1.4.5 Hemogobina Globular Média (HGM/MCH) ... 100 5.2.1.5 Eritrócitos Nucleados (NRBC) ... 101 5.2.2 Leucograma ... 101 5.2.2.1 Canal BASO ... 102 5.2.2.2 Canal PEROX ... 104 5.2.3 Contagem de plaquetas ... 105 5.2.4 Coloração e observação do esfregaço sanguíneo em hematologia ... 107

5.3 HEMOGLOBINA GLICOSILADA... 117 5.4 O HA-8180V ... 118

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Relatório de Estágio

xxiii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

5.5 ELECTROFORESE DE HEMOGLOBINAS E PROTEÍNAS ... 121

5.5.1 Electroforese de Hemoglobinas ... 122 5.5.2 Electroforese de Proteínas ... 125

5.6 DISPOSITIVO VES-MATIC ... 127 5.7 HEMOSTASE E COAGULAÇÃO ... 129

5.7.1 Tempo de Protrombina (TP) ... 130 5.7.2 Tempo de tromboplastina parcial activada – aptt ... 131 5.7.3 Tempo de Trombina (TT)... 132 5.7.4 Antitrombina ... 132 5.8 SYSMEX®_{CA – 560 ... 133} 5.9 SISTEMA VIDAS®_{... 134} 5.10 D-DÍMEROS ... 135 5.11 IMUNO-HEMATOLOGIA ... 136 5.11.1 Grupagem ABO/D ... 138 5.11.1.1Método Microaglutinação em Coluna de Gel ... 138 5.11.1.2Teste de Coombs ou Teste de Antiglobulina Humana ... 139 5.11.1.3Teste de Coombs Indirecto, Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) ou Teste de Antiglobulina Humana Indirecto ... 141 6 VALÊNCIA DE BIOQUÍMICA ... 143

6.1 INTRODUÇÃO ... 143 6.2 URIANÁLISE ... 144

6.2.1 Análise de urina de 24 h ... 144 6.2.2 Análise de urina tipo II ... 144 6.2.2.1 O CLSI-NCCLS ... 144 6.2.3 O CLINITEK ATLAS®_{... 145} 6.2.3.1 Método ... 146

6.3 EXAME MICROSCÓPICO DO SEDIMENTO ... 151

6.3.1 Leucócitos ... 151 6.3.2 Eritrócitos ... 151 6.3.3 Células ... 152 6.3.4 Cilindros ... 152 6.3.5 Cristais... 153 6.3.6 Células de adipócitos ... 155 6.4 GEM® _PREMIERTM_{3000 ... 155}

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Relatório de Estágio

xxiv Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

6.4.1 Características ... 156

6.5 DIMENSION®_{XPAND™ ... 157}

6.5.1 Parâmetros e técnicas respeitantes ao DIMENSION®_{Xpand™ ... 159} 6.6 TÉCNICAS MANUAIS ... 197

6.6.1 Pesquisa de drogas de abuso ... 197 6.6.1.1 Anfetaminas ... 197 6.6.1.2 Barbituratos ... 198 6.6.1.3 Benzodiazepinas ... 198 6.6.1.4 Cocaína ... 198 6.6.1.5 THC (canabinóide) ... 199 6.6.1.6 Morfina (Opiáceos) ... 199 6.6.2 Metodologia... 200 6.6.3 DIG (Diagnóstico Imunológico da Gravidez) ... 200 6.6.4 A HCG (Gonadotrofina Coriónica Humana) ... 201 6.6.5 Metodologia (imunocromatográfica) ... 201 6.6.6 Reacção de Waaler-Rose ... 201 6.6.6.1 Metodologia ... 201 6.6.7 Antigénios febris ... 202 6.6.7.1 Metodologia ... 202 6.6.8 Reacção de Paul-Bunnel ... 203 6.6.8.1 Metodologia ... 203 6.7 ANÁLISE DE ESPERMA ... 203 6.7.1 Espermograma ... 203 6.7.2 Metodologia... 205 6.7.2.1 Colheita... 205 6.7.2.2 Procedimento laboratorial ... 205 6.8 TESTE DO SUOR ... 209 7 CONCLUSÕES ... 211 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 213 ANEXO A ... 219 ANEXO B ... 223 ANEXO C ... 225 ANEXO D ... 226 ANEXO E ... 228

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Relatório de Estágio

xxv Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Diferentes fases do processamento do exame analítico. ... 4 Figura 2 – Gestão de resíduos dos grupos I, II, III e IV ... 11 Figura 3 – Contentor para materiais corto-perfurantes. ... 12 Figura 4 – Contentores para lixo de risco biológico. ... 12 Figura 5 – Quadro Legislativo no período de 1999 a 2009, com expressão no PERH .. 13 Figura 6 – Triagem de amostras biológicas de Microbiologia Clínica... 17 Figura 7 – Teste da catalase. ... 23 Figura 8 – Teste da coagulase... 24 Figura 9 – Identificação serológica do grupo de Lancefield. ... 25 Figura 10 – Teste da citocromo oxidase. ... 26 Figura 11 – Teste da optoquina. ... 27 Figura 12 – Formação do tubo germinativo na levedura Candida albicans. ... 28 Figura 13 – Caixa hermética e saco com atmosfera modificada. ... 29 Figura 14 – Imagem da sementeira das urinas em câmara de fluxo laminar vertical.... 35 Figura 15 – Diferentes concentrações das urinas ... 35 Figura 16 – Sistema Mini API®_{... 61} Figura 17 – Sistema Vitek_{2 ... 64} Figura 18 – Sistema VITEK®_{MS (Tecnologia MALDI-TOF) ... 67} Figura 19 – BacT/ALERT_{3D ... 68} Figura 20 – Frasco de cultura BacT/Alert®_{típico. ... 70} Figura 21 – Procedimento experimental do Clearview® Chlamydia MF ... 86 Figura 22 – Componentes do KIT e Procedimento do Teste Easy–Copros ... 88 Figura 23 – Dispositivo de teste One-Step FOB ... 90 Figura 24 – Sistema GenomERa™ Clostridium difficile assay ... 90 Figura 25 – Representação esquemática dos diversos passos do ensaio ... 91 Figura 26 – ADVIA®_{120 Hematology System ... 94} Figura 27 – Dispersão da luz pelos eritrócitos a diferentes ângulos de detecção ... 96 Figura 28 – Citograma em que se observa Volume/Concentração de hemoglobina ... 97 Figura 29 – Citograma Baso. ... 102 Figura 30 – Citograma Perox ... 103 Figura 31 – Dispersão e absorção de luz pelos leucócitos no canal PEROX ... 105

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Relatório de Estágio

xxvi Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

Figura 32 – Citograma de dispersão dos RBC ... 106 Figura 33 – Citograma de dispersão plaquetária ... 106 Figura 34 – Esfregaço sanguíneo... 108 Figura 35 – Algoritmo proposto de interpretação de resultados. ... 116 Figura 36 – Analisador HA-8180V. ... 119 Figura 37 – Cromatograma tipo do analisador HA-8180V. ... 120 Figura 38 – CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING ... 122 Figura 39 – Padrão eletroforético (ECZ) da amostra do sangue de controlo (AFSC). . 124 Figura 40 – Perfil Electroforético de Hemoglobinas para amostra de sangue normal. 124 Figura 41 – Ordem de detecção das proteínas ... 126 Figura 42 – VES-MATICcube 30 ... 127 Figura 43 – Cascata da coagulação... 130 Figura 44 – Sysmex®_{CA – 560 ... 133} Figura 45 – Equipamento VIDAS®_{... 135} Figura 46 – Grupagem ABO/D ... 139 Figura 47 – Card de Teste de Coombs Indirecto ... 141 Figura 48 – Sistema Clinitek Atlas®_{com Manipulador de Amostras tipo Carrossel para} Urinas tipo II ... 145 Figura 49 –Exame microscópico do sedimento urinário. ... 152 Figura 50 – GEM® Premier 3000 utilizado no tratamento de point-of-care ... 156 Figura 51 – Aparelho automático (DIMENSION®_{Xpand™) ... 157} Figura 52 – Classificação das lipoproteínas plasmáticas... 163 Figura 53 – Teste rápido de cocaína ... 199 Figura 54 – Exemplo do método usado ... 200 Figura 55 – Câmara de Neubauer utilizada para a contagem de espermatozóides... 207 Figura 56 – Exemplos de alterações morfológicas de espermatozóides. ... 209

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xxvii Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Meios de cultura comerciais utilizados (composição: Anexo A) ... 31 Tabela 2 – Identificação de Gram-positivos ... 71 Tabela 3 – Identificação de cocobacilos Gram-negativos ... 72 Tabela 4 – Identificação de Enterobacteriaceae ... 73 Tabela 5 – Identificação de bacilos Gram-negativos não fermentativos ... 73 Tabela 6 – Identificação de Campylobacter spp. ... 74 Tabela 7 – Identificação de leveduras ... 75 Tabela 8 – Locais de ação dos antimicrobianos ... 76 Tabela 9 – Antibióticos a reportar para ENTEROBACTERIACEAE – I ... 77 Tabela 10 – Antibióticos a reportar para Enterobacteriaceae – II ... 78 Tabela 11 – Antibióticos a reportar para ENTEROBACTERIACEAE – III ... 78 Tabela 12 – Antibióticos a reportar para Salmonella spp. e Shigella spp ... 79 Tabela 13 – Antibióticos a reportar para Pseudomonas spp. ... 79 Tabela 14 – Antibióticos a reportar para Haemphilus spp. – I ... 80 Tabela 15 – Antibióticos a reportar para Haemophilus spp. – II ... 80 Tabela 16 – Antibióticos a reportar para Moraxella catarrhalis ... 81 Tabela 17 – Antibióticos a reportar para Staphylococcus spp.– I ... 81 Tabela 18 – Antibióticos a reportar para Staphylococcus spp.– II ... 82 Tabela 19 – Antibióticos a reportar para Enterococcus spp.– I ... 82 Tabela 20 – Antibióticos a reportar para Enterococcus spp. – II ... 83 Tabela 21 – Antibióticos a reportar para Sreptococcus pneumoniae ... 83 Tabela 22 – Antibióticos a reportar para Sreptococcus pneumoniae ... 84 Tabela 23 – Antibióticos a reportar para Streptococcus do grupo viridans ... 84 Tabela 24 – Antibióticos a reportar para Streptococcus pyogenes ... 85 Tabela 25 – Parâmetros determinados no ADVIA®_{120 ... 95} Tabela 26 – Valores de referência para a hemoglobina em g/dL ... 98 Tabela 27 – Valores de referência para as diferentes populações leucocitárias ... 104 Tabela 28 – Plano de Controlo da Qualidade Interno do ADVIA®_{120 ... 109} Tabela 29 – Morfologia dos glóbulos vermelhos (anormais) ao m.o. ... 111 Tabela 30 – Valores de referência para as zonas electroforéticas de hemoglobina individuais principais dependendo da idade . ... 125

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Tabela 31 – Valores de referência para as principais fracções individuais de proteínas no soro. ... 126 Tabela 32 – Controlo da qualidade interno do aparelho VES-MATIC (Velocidade de Sedimentação) ... 129 Tabela 33 – Ensaios realizados no VIDAS®_{... 136} Tabela 34 – Resultados dos cards ... 138 Tabela 35 – Classificação do tipo de cilindros ... 153 Tabela 36 – Analitos medidos e respectivos parâmetros deduzidos ... 156 Tabela 37 – Valores de Referência para cada parâmetro analisado pelo aparelho automático (DIMENSION®_{Xpand) ... 193} Tabela 38 – Calibradores e FLEXs utilizados no Sistema Dimension. ... 194 Tabela 39 – Calibradores, Conservação e estabilidade ... 194 Tabela 40 – Estabilidade dos controlos de química clínica ... 195 Tabela 41 – Controlos utilizados no Dimension ... 196 Tabela 42 – Plano de Controlo Interno para os parâmetros abaixo indicados, determinados pelo aparelho automático DIMENSION ... 197 Tabela 43 – Parâmetros seminais ... 204

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xxix Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

RESUMO

Na sequência da conclusão da componente escolar do Curso de Mestrado em Análises Clínicas da FFUL e com vista ao preenchimento parcial das condições requeridas para obtenção do título de Mestre na referida especialidade, entre 23 de Março de 2015 e 2 de Outubro de 2015, foi realizado, em regime laboral, o estágio profissionalizante nas valências de Microbiologia, Hematologia e Bioquímica, em dois Laboratórios Clínicos do Grupo LABCO, sitos na cidade de Lisboa (Luz e Rato), sob a supervisão dos Senhores Prof. Doutores Cristina Marques (FFULisboa) e Paulo Paixão (LABCO) e orientação da Drª Isabel Moutinho e Drª Anabela Cunha (LABCO), ao qual diz respeito o Relatório de Estágio, incluído na 1ª parte do presente documento. Posteriormente, sob a orientação e revisao final da Prof. Doutora Quirina Santos Costa, foi elaborada a monografia que consta da 2ª parte do presente documento – "A Criptosporidiose em indivíduos infectados com VIH: influência da patogénese na Clínica, Imunologia e Prevenção” –, tema este aprovado pelo Conselho Científco na sua reunião de 29 de maio 2015.

Em termos de carga horária, como referido anteriormente, o estágio profissionalizante ultrapassou o valor regulamentarmente prescrito, de 1080 horas.

O presente relatório de estágio inicia com a abordagem do controlo interno e externo e do seu importante papel na redução dos erros analíticos e na avaliação do desempenho dos dois laboratórios.

De seguida, são tratadas as valências que integraram o estágio, pela seguinte ordem: Microbiologia, Hematologia e Bioquímica. Para cada valência são descritas as técnicas laboratoriais que realizámos mais frequentemente, bem como uma breve abordagem ao seus fundamentos teóricos.

Nas conclusões, são apresentados, sucintamente, os contributos deste estágio para a formação profissional e académica da mestranda, bem como algumas sugestões potencialmente interessantes para futuros estágios profissionalizantes nesta especialidade.

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ABSTRACT

Following the former component conclusion of the Master's Degree program in Clinical Analysis by the Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa (FFULisboa) and with the aim of fullfilling the partial conditions required for the obtainance of a master's degree in that specialty, it was carried out, in labor regimen, between 23 March 2015 and 2 October 2015, the professionalizing period of training in the valences/scientific domains of Microbiology, Hematology and Biochemistry, in two Clinical Laboratories of LABCO enterprises, in the city of Lisbon (LUZ and Rato), under the supervision of Professors Cristina Marques (FFULisboa) and Paulo Paixão (LABCO) under the technical guidance of Doctor Isabel Moutinho and Doctor Anabela Cunha (LABCO), to which refers the report of the training period enclosed in the first part of the present document. Ultimately, under the orientation and final revision of Professor Quirina Santos Costa, the monograph included in the second part of the present document was elaborated – “The Criptosporidiosis in HIV infected individuals: Influence of pathogenesis in the Clinic, Immunology and Prevention” –, whose subject was approved on 29th_{May 2015, by the} FFULisboa Scientific Committee.

In terms of labor hours, the reported professionalizing period of training exceeded the prescribed value of 1080 hours.

In the initial part of the report the analysis is made according to the internal and external control and its important paper in the reduction of the analytical errors and in the evaluation of both laboratories performances.

Followed, the scientific domains that had integrated the period of training, for the following order are: Microbiology, Hematology and Biochemistry. For each one, it is described the laboratorial techniques more frequently used, as well as a brief approach to its theoretical fundaments.

In the conclusions, the contributions of this training period for the professional and academic formation of the master’s degree student are succinctly presented, as well as some suggestions that can be of most interest for future professionalizing periods of training in this specialty.

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1 INTRODUÇÃO

O estágio profissionalizante realizado, integrado no Mestrado em Análises Clínicas da FFULisboa (MAC VII), decorreu em regime laboral, de 23 de Março de 2015 a 2 de Outubro de 2015, em dois laboratórios do Grupo Labco/Grupo General Lab Portugal: Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz e Laboratório Soprelab (Santa Isabel), ambos localizados em Lisboa, o primeiro na Zona da Luz - Benfica e, o segundo, na Zona do Rato.

O estágio abrangeu as valências de Microbiologia, Bioquímica e Hematologia.

A valência de Microbiologia foi desenvolvida integralmente no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz, nos primeiros três meses do estágio, com o horário entre as 07h30 e as 16h00, com meia hora para almoço; as valências de Bioquímica e Hematologia desenvolveram-se inicialmente no mesmo laboratório, com o mesmo horário de trabalho e, no último mês do estágio, no Laboratório Soprelab, com o horário das 08h30 às 17h30, com meia hora para almoço.

Verifica-se, pois, que a duração do estágio superou a carga horária de 1080h, regulamentarmente prescrita.

O Laboratório de Patologia Clínica funciona em regime de outsourcing com a General Lab Portugal, parceiro estratégico rigorosamente selecionado para prestar este serviço no Hospital da Luz (1).

Este laboratório está integrado no Grupo General Lab Portugal, do qual fazem também parte o laboratório Soprelab (Santa Isabel – Lisboa) e os laboratórios dos Hospitais Lusíadas (Lisboa), Cascais, Loures, Boavista (Porto) e Santiago (Setúbal). Desta forma, o laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz funciona em articulação com os outros laboratórios do grupo, sobretudo com o laboratório Soprelab, onde funciona a sede da empresa e no qual se determina o maior e mais diversificado número de parâmetros, sendo por isso considerado como o laboratório central.

O Hospital da Luz foi inaugurado a 18 de abril de 2007 pelo, então, Exº Senhor Presidente da Républica, Professor Aníbal Cavaco Silva.

Consiste num projecto privado da Espírito Santo Saúde (ESS). O complexo “implicou um investimento de 130 milhões de euros (105 milhões só para o hospital) e vai empregar 600 trabalhadores mais 200 colaboradores indirectos, de acordo com Isabel Vaz, presidente da Administração da ESS (Diário de Notícias 18 Abril 2007)”(2).

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2 Ana Paula W. Y. de Vila Fernandes

O complexo integra o Hospital da Luz, de que faz parte o Hospital Residencial e as Casas da Cidade, "área com 115 apartamentos para pessoas com mais de 64 anos e independentes", explica ao DN Tomás Branquinho da Fonseca, membro da administração (2). Desde a sua abertura, o Hospital da Luz tornou-se uma referência incontornável no sector e contribuiu de uma forma marcante para a valorização da iniciativa privada em Portugal (3).O Hospital da Luz tem acordos celebrados com as principais seguradoras e sistemas complementares de saúde, que permitem aos seus clientes, beneficiários ou associados ter acesso aos serviços do Hospital (4).

Durante o estágio foi-me dada oportunidade de compreender o funcionamento geral de um laboratório de análises clínicas e de executar algumas das técnicas realizadas diariamente nesta unidade hospitalar. O Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz realiza exames analíticos, incluídos nos meios complementares de diagnóstico e terapêutica, tendo como destinatários todos os doentes em regime de internamento, urgência e ambulatório que de uma forma ou de outra escolheram esta unidade de saúde. Este apoio aos doentes internados e aos doentes do serviço de urgência implica funcionamento permanente do laboratório para os exames analíticos considerados urgentes, para além da realização de alguns exames de rotina no horário normal de trabalho. Ao laboratório além das amostras do serviço de internamento e de urgência também chegam as amostras de ambulatório cerca de 200 diárias constituindo num laboratório de elevado afluxo, em que se tem de primar a rapidez com o saber fazer. Os resultados são enviados atempadamente para que possam ser tomadas decisões clínicas com base neles, para os respectivos serviços dos quais foram enviados. Para além disso existe uma elevada e importante cooperação entre o laboratório e o clínico no esclarecimento de qualquer dúvida. É disso exemplo a comunicação imediata de resultados com alterações importantes e a discussão de novas abordagens laboratoriais no diagnóstico e seguimento terapêutico dos diferentes tipos de patologias.

O espaço laboratorial está dividido em duas secções, uma correspondendo a um open space dedicado à Bioquímica e Hematologia e outra individualizada, exclusiva da valência de Microbiologia.

Da valência de Microbiologia fazem parte os equipamentos: Vitek_2,

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Relatório de Estágio

de colorações, câmara de fluxo laminar, que asseguram um rápido diagnóstico nesta valência.

Nesta secção está centralizada a análise de produtos microbiológicos provenientes de outros laboratórios do grupo, tornando-o num excelente local para a apreensão/formação de novas competências.

Na restante área funcionam as valências de Bioquímica e Hematologia, com as limitações próprias de um laboratório concebido, sobretudo para a realização de análises de urgência. A nível dos equipamentos englobados na secção de hematologia contam-se o ADVIA®_{120 Hematology System (hemograma), o Sysmex}®_{CA-560 (coagulação) e o} VES-MATICcube 30 (velocidade de sedimentação).

A valência de Bioquímica engloba a utilização dos seguintes aparelhos: Dimension® Xpand®_{(química clínica), Clinitek Atlas}®_{(química urinária) e GEM}®_{Premier 3000} (gasimetrias).

Relativamente à imunologia e endocrinologia é determinado um número muito reduzido de parâmetros, na maioria relacionados com a serologia das doenças infeciosas, DIG e pesquisa de drogas de abuso.

A rotina de um laboratório clínico é complexa pela multiplicidade de processos distintos e inter-relacionados a serem controlados e pela variedade de matrizes analisadas (sangue, urina, fezes, liquor, líquidos cavitários, etc.). Esta inicia-se por uma fase pré-analítica (figura 1), envolvendo a qualificação de amostras que dependem da preparação do paciente, da colheita realizada, do acondicionamento das amostras e do transporte. Na etapa analítica, pelos produtos, materiais e serviços qualificados, pelo controle e processamento do material biológico, pela equipa competente, realizando exames em equipamentos em condições óptimas de operação, empregando-se uma tecnologia da informação moderna. Na fase pós-analítica há a relevante correlação clínico-laboratorial e a exata interpretação clínica dos resultados

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Relatório de Estágio

Figura 1 – Diferentes fases do processamento do exame analítico.

Deste modo, o laboratório de patologia clínica tem como objectivos fornecer informação com base nos testes de diagnóstico in vitro ajudando os médicos a tomarem as decisões correctas para a saúde dos seus doentes como na rápida detecção de doenças e prescrição de terapias adaptadas ao indivíduo per si, reduzindo o tempo de permanência no hospital e o risco de falência terapêutica.

O laboratório possui um Sistema de Gestão de Qualidade implementado e documentado de forma adequada, cumprindo os requisitos da Norma NP EN ISO 9001:2008, Manual das Boas Práticas Laboratoriais e Legislação aplicável. Durante o estágio, pude acompanhar reuniões, seminários, implementação de novo software e os trabalhos desenvolvidos com vista a auditoria de renovação/extensão da certificação do laboratório. O Laboratório de Patologia Clínica do Hospital da Luz e o Laboratório Central estão informatizados com um sistema integrado de gestão laboratorial – APOLLO – que permite integrar em suporte informático os diferentes laboratórios e todos os resultados analíticos gerados, possibilitando um acesso rápido, simples e geral das análises de um dado utente no momento, bem como o seu historial analítico.

Este sistema de gestão laboratorial traduz-se numa maior eficiência, com uma consequente optimização dos diversos processos laboratoriais e redução de custos. O sistema permite um tratamento informático de todos os parâmetros estudados, tendo em conta o seguinte:

 Registo das análises pedidas incluindo dados demográficos e clínicos do utente;  Identificação da amostra mediante leitura óptica de códigos de barra;

 Elaboração de listas de trabalho, com as técnicas a efectuar;

Fase pós-analítica Fase pré-analítica Fase analítica

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Relatório de Estágio

 Visualização de resultados analíticos transmitidos pelos equipamentos onde foram efectuadas as análises;

 Processar a facturação aos sub-sistemas dos utentes e a execução de diversos mapas estatísticos.

O organograma do laboratório inclui um Director Técnico com formação de médico Patologista, especialistas em análises clínicas, técnicos de Análises Clínicas e Saúde Pública e administrativos.

Com vista à interiorização do espírito de equipa, melhoria do serviço prestado e obtenção de resultados satisfatórios tanto para os clientes como para a própria Empresa, General Lab Portugal tem estabelecidos os seguintes princípios:

A MISSÃO

General Lab é um grupo de laboratórios dedicados à realização de análises clínicas e biológicas que oferece aos seus clientes um serviço de diagnóstico, responsável, profissional e inovador, com eficiência e qualidade, tanto humana como técnica.

A VISÃO

A General Lab pretende ser o líder europeu no sector das análises clínicas e biológicas e proporcionar um serviço que acompanha e tende a superar as expectativas dos clientes utilizando os nossos valores.

Os VALORES

– O potencial dos nossos Recursos Humanos;

– A capacidade de adaptação dos nossos processos às necessidades dos clientes; – O espírito de inovação na procura constante de novas soluções técnicas; – A parceria e a integração na procura constante de novas soluções técnicas; – O poder de estabelecer alianças estratégicas em outras organizações; – O compromisso com o meio ambiente e a sociedade em geral. POLÍTICA DA QUALIDADE

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Relatório de Estágio

A Política da Qualidade do Grupo General Lab consiste em fornecer o trabalho em equipa, no controlo e melhoria contínua dos processos para garantir a satisfação do cliente e superar as suas expectativas.

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Relatório de Estágio

2 CONTROLO DA QUALIDADE

A Medicina Laboratorial sofreu nos últimos 50 anos um enorme desenvolvimento tecnológico e científico, estimando-se hoje ter impacto em cerca de 70% das decisões médicas. As suas diversas áreas de ação intervêm, entre outras, na identificação do risco para o desenvolvimento de patologias, na deteção precoce, na planificação de estratégias diagnósticas, na seleção de tratamentos mais eficazes e na monitorização da resposta terapêutica, servindo também de base para o estabelecimento de normas de orientação clínica (7–12).

2.1 CONTROLO INTERNO

O Controlo da Qualidade Interno (CQI) alberga um conjunto de procedimentos adoptados num Laboratório, com vista a permitir um controlo e monitorização da qualidade dos resultados das análises à medida que as mesmas são executadas. Consiste especificamente nas medidas de controlo levadas a cabo na rotina laboratorial, que visam garantir a consistência, reprodutibilidade e fiabilidade dos resultados obtidos. O Controlo da Qualidade interno avalia igualmente a precisão das técnicas automatizadas, que é medida através do desvio padrão.

Este é realizado com base no Plano de Controlo da Qualidade Interno onde estão definidos quais os parâmetros a controlar, o controlo a ser utilizado, a periodicidade, os critérios de aceitação e a actuação perante a não verificação destes últimos. Tem como objectivo garantir a deteção de anomalias, avaliação de erros e sua imediata correção.

As amostras utilizadas no CQI podem ter duas origens, nomeadamente, o próprio fabricante do reagente/Kit ou um fornecedor independente especializado na produção de amostras de Controlo da Qualidade. Sempre que possível opta-se pela utilização do Controlo da Qualidade dum fornecedor independente. A realização deste controlo visa a monitorização do desempenho e da estabilidade dos sistemas analíticos utilizados. Para os diversos parâmetros analisados, existem objectivos e requisitos de qualidade definidos e adequados aos sistemas analíticos instalados, garantindo assim a utilização racional e eficaz de procedimentos de controlo. Cada sector analítico tem um plano de CQI, onde se encontram descritos os requisitos exigidos para cada parâmetro. Estes requisitos são os que melhor se adequam a cada sistema analítico e podem ser diferentes para cada um.

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Relatório de Estágio

Os requisitos traduzem-se por um Erro Total (ET) admissível, que é determinado com base numa de cinco opções:

1. ET adoptado: ponderado tendo em conta o histórico analítico, factores biológicos e clínicos (fórmula de Tomb);

2. Recomendações Instituto Nacional Dr. Ricardo Jorge (INSA) - Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade (PNAEQ);

3. RCV variabilidade clinicamente significativa (C. G. Fraser); 4. ET biológico (Ricos C. et al);

5. CLIA (Clinical Laboratory Improvemente Amendments).

Mensalmente efetua-se o tratamento estatístico dos resultados do CQI, avaliando a Inexatidão, Imprecisão, ICV e ET para cada programa. Os resultados são registados para a elaboração de cartas controlo e determinação de parâmetros que permitem avaliar o desempenho como a média, o desvio padrão (SD), o coeficiente de variação (CV), o BIAS e o ET. Na avaliação dos resultados de controlo interno deverá verificar-se se o ET obtido para cada parâmetro é inferior ao ET admissível. Caso seja superior, devem ser avaliados problemas de inexatidão ou imprecisão de forma a implementar as medidas corretivas adequadas.

Em relação aos aparelhos automáticos normalmente são usados dois controlos (um normal e um patológico) que são inseridos no ínicio de cada dia de trabalho, para se ter a certeza que todos os resultados desse dia são os verdadeiros para cada doente.

Em relação a técnicas manuais como as serologias, o controlo faz-se na abertura de cada lote e sempre que houver dúvidas em relação a determinado teste.

Nos procedimentos do Controlo da Qualidade interno do laboratório de microbiologia são utilizadas estirpes de referência (ATCC – iniciais de American Type Culture Collection), obtidas a partir de culturas de colecção, que são processadas como estirpes isoladas a partir de amostras clínicas.

Outro controlo importante, consiste no controlo dos meios usados na microbiologia pois temos que nos certificar que estão em perfeitas condições para que não apresentam microrganismos que não estejam presentes na amostra do doente. Para tal, temos de fazer o teste da esterilidade, para ver se ocorre ou não crescimento bacteriano, em que a placa fica a 37ºC durante 48h. São ainda realizados controlos de esterilidade na câmara de segurança biológica (câmara de fluxo laminar) e na suspensão utilizada no sistema

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Relatório de Estágio

Vitek®_{2, com uma periodicidade mensal e semanal, respectivamente. Semanalmente são} testadas estirpes com vista ao controlo dos testes de sensibilidade aos antibióticos e mensalmente, ou quando se inicia novo lote de reagente, são controladas as cartas de identificação de microrganismos.

2.2 CONTROLO QUALIDADE EXTERNO

O Controlo Qualidade Externo (CQE) consiste numa avaliação dos resultados do laboratório por um organismo exterior. Este fornece amostras aos laboratórios participantes, em determinado programa de controlo externo, que têm de ser tratadas como amostras normais, apresentando no final um relatório no qual se introduz os resultados. A Avaliação Externa da Qualidade permite avaliar a exactidão das técnicas. Os resultados obtidos no CQE são comparados com a média dos resultados enviados por outros laboratórios participantes, que utilizam o mesmo método e o mesmo equipamento. O laboratório participa no programa da Sociedade Española de Bioquímica Clínica Y Patologia Molecular (SEQC), programa da Sociedad Española de Hematologia y Hemoterapia (SEHH) e UK NEQAS (United Kingdom National External Quality Assessment Services – Bacteriologia). Este controlo permite uma avaliação independente da qualidade técnica do laboratório, promovendo a comparibilidade entre os laboratórios e a harmonização de procedimentos e critérios.

Todos os resultados do Controlo da Qualidade Interna (CQI) e AEQ são compilados pelo coordenador de Controlo da Qualidade, que elabora um relatório mensal a ser avaliado pela Direcção técnica do laboratório, com conhecimento da Administração (8–12) .

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Relatório de Estágio

3 GESTÃO DE RESÍDUOS HOSPITALARES

A crescente produção de resíduos hospitalares e complexidade da sua composição, a existência de novos conceitos de gestão de resíduos, nomeadamente no que respeita à valorização de alguns materiais, a maior percepção do risco inerente aos resíduos hospitalares, o desenvolvimento de novas tecnologias de tratamento, entre outros aspectos, conduziriam à publicação do Despacho n.º 242/96, publicado a 13 de Agosto, do Ministério da Saúde (13,14).

Assim sendo, a triagem e armazenamento dos resíduos hospitalares obedecem ao Decreto-Lei n.º 73/2011, de 17 de Junho (figuras 2, 3 e 4). O actual decreto-lei alterou o regime geral da gestão de resíduos e transpôs a Directiva n.º 2008/98/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 19 de Novembro, relativa aos resíduos (13,14).

Figura 2 – Gestão de resíduos dos grupos I, II, III e IV

Adaptado de:http://www.apambiente.pt/_zdata/Politicas/Residuos/Planeamento/PERH/PERH_2011_2016.pdf em 9 de Novembro de 2015

• São resíduos equiparados a urbanos não apresentam exigências especiais no seu tratamento

• (I) e resíduos hospitalares não sujeitos a tratamentos específicos, podendo ser equiparados a urbanos

• (II). Depositam– se nos sacos de plástico preto e destinam– se à lixeira comum. A título de exemplo, invólucros de vários materiais em papel plastificado, papel autocolante, papel encerado, papel metalizado, toalhetes de papel, material de escritório.

Resíduos dos

grupos I e

II(resíduos não

perigosos)

• São resíduos de risco biológico: resíduos contaminados ou suspeitos de contaminação, suscetíveis de incineração ou de outro pré– tratamento eficaz, permitindo uma posterior eliminação como resíduo urbano (III) e resíduos hospitalares específicos; resíduos de vários tipos de incineração obrigatória (IV). São depositados nos contentores de polietileno, de cor preta, e destinam– se à incineração. Encaixam– se nessa categoria: tubos já analisados, frascos de reagentes vazios, calibradores vazios, controlos utilizados, monovettes utilizadas, compressas, qualquer material que teve contacto com os produtos biológicos.

• Resíduos corto– perfurantes Deu– se a colocação destes resíduos (exemplos: lâminas, agulhas e restante material corto– perfurante que constituem um risco potencial de ocorrer acidentes

Resíduos dos

grupos III e IV

(resíduos

perigosos)

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Relatório de Estágio

Figura 3 – Contentor para materiais corto-perfurantes.

Adaptado de: NORMAX em 9 de Novembro de 2015

Figura 4 – Contentores para lixo de risco biológico.

Adaptado de: NORMAX em 9 de Novembro de 2015

3.1 ENQUADRAMENTO LEGISLATIVO

Nos últimos anos, o quadro jurídico aplicável aos resíduos sofreu profundas alterações que se consubstanciam, desde logo, ao nível do regime geral da gestão dos resíduos, aprovado pelo Decreto-Lei n.º 73/2011, de 17 de Junho, e nos seus diplomas complementares.

A alteração do sistema jurídico de gestão dos resíduos em Portugal que decorreu desde 1999 conduziu à revogação de muitos diplomas legais que estiveram na base da estratégia do anterior PERH (Plano Estratégico dos Resíduos Hospitalares 2011 – 2016 (PERH 2011 – 2016). A Figura 5 pretende esquematizar os principais diplomas revogados (assinalados a verde) e os que permanecem em vigor (assinalados a azul e a preto), em que estes últimos configuram o enquadramento legislativo do PERH 2011 – 2016.

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Relatório de Estágio

Figura 5 – Quadro Legislativo no período de 1999 a 2009, com expressão no PERH Adaptado de: http://apambiente.pt/index.php em 9 de Novembro de 2015

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Relatório de Estágio

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Relatório de Estágio

4 VALÊNCIA DE MICROBIOLOGIA 4.1 INTRODUÇÃO

O laboratório de Microbiologia fornece informação crucial para o diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas. Deste modo, o laboratório de Microbiologia tenta conjugar a necessidade de resposta rápida e assertiva com as rigorosas normas de orientação técnica utilizadas,desde a colheita das amostras até à identificação e estudo da resistência dos agentes infeciosos aos antibióticos (TSA). Nesta valência são desenvolvidas outras, tais como bacteriologia geral, micobacteriologia, micologia e parasitologia. Da micobacteriologia fazem parte a recuperação e identificação de micobactérias, assim como no uso de métodos rápidos para estabelecer o seu diagnóstico. Na micologia é feita a identificação e isolamento de fungos usando o meio Sabouraud sendo semeado algumas vezes por repicagem de uma GS. No que concerne à Parasitologia o laboratório de Microbiologia encontra-se apto na pesquisa e identificação/diferenciação de parasitas como nemátodos, céstodos, tremátodos nas suas diferentes formas como ovos e quistos em amostras fecais como de parasitas sanguíneos em amostras de sangue (15–49). Este trabalho é realizado recorrendo a Kits de testes rápidos e a observação de lâminas ao microscópio (9,15,50).

Do laboratório de Microbiologia fazem parte os seguintes equipamentos:

 Microscópio óptico NiKon 003750 – Labophot – 2  Mini Api®

 Bact/ALERT_{3D –}_{select link}_{– Biomérieux para hemoculturas e micobactérias}  Vitek_{2 – BioMérieux}

 Vitek – MS (lab.Soprelab) – BioMérieux  ABACUS GenomEra CDX™ _System

 Câmara de segurança biológica (Classe II) – Tellstar

 Estufas Binder a 30ºC ( fungos filamentosos e leveduras) e a 37ºC (outros m.o) Para cada técnica e para cada aparelho os controlos devem ser colocados mediante as especificações respectivas.

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4.2 RESUMO DAS ANÁLISES EFECTUADAS NA SECÇÃO DE MICROBIOLOGIA 1) Teste de identificação microbiológica;

2) Teste de sensibilidade/antibiograma;

3) Hemocultura – aerobiose (exame cultural);

4) Hemocultura – anaerobiose (exame cultural);

5) Urina asséptica (exame citobacteriológico/cultural); 6) Exsudado vaginal (exame directo/cultural);

7) Exsudado faríngeo (exame cultural);

8) Exsudado nasal (exame cultural);

9) Expectoração (exame directo/cultural); 10) Exsudado auricular (exame directo/cultural); 11) Espermocultura (exame directo/cultural); 12) Coprocultura (exame cultural);

13) Exame micológico (exame cultural); 14) Exsudado uretral (exame directo/cultural)

15) Pesquisa de ovos, quistos e parasitas (técnica de concentração em tubo de solução conservante);

16) Pesquisa de ovos, quistos e parasitas (técnica de concentração em recipiente limpo e vedado);

17) Pesquisa de sangue oculto (ICR); 18) Estudos de colonização;

19) Pesquisa de dermatófitos.

Os resultados dos exames microbiológicos (22) dependem de alguns factores fundamentais, nomeadamente (figura 6) (23,24,32):

 A correcta identificação da amostra;  A qualidade da amostra;

 Técnica de colheita, transporte e processamento adequados;  Informação clínica relevante.

(51)

Relatório de Estágio

No laboratório de Microbiologia clínica as amostras seguem o respectivo fluxograma de trabalho:

Figura 6 – Triagem de amostras biológicas de Microbiologia Clínica Foto tirada no laboraboratório de microbiologia clínica em 19 de Junho de 2015

4.3 MEIOS DE TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO

O processo de diagnóstico começa com a colheita do produto biológico. Deste modo o diagnóstico laboratorial é dividido em várias etapas, desde a avaliação da amostra, análise física, análise química, observação microscópica e cultura da amostra biológica, seguida do teste de sensibilidade aos antibióticos (TSA) ou seja antibiograma no caso de resultado positivo.

Os meios de transporte são utilizados sempre que não é possível processar os produtos biológicos imediatamente após a colheita, permitindo assim a viabilidade dos microrganismos nos produtos biológicos quando não podem ser processados

Exame a fresco e/ou exame pós– coloração Sementeira e incubação Validação da amostra Identificação do agente isolado Execução do antibiograma Leitura e interpretação do Antibiograma Validação e emissão de resultado

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Relatório de Estágio

imediatamente após a colheita, geralmente por 24 horas. Devem ser utilizados de acordo com o produto e os microrganismos que se pretendem pesquisar.

As amostras devem ser transportadas de imediato ao laboratório de Microbiologia, de modo a serem processadas o mais brevemente possível evitando assim, a perda de viabilidade de alguns m.o, ou o sobrecrescimento da flora indígena. Se esta condição não se verificar devem respeitar as normas de conservação definidas pelo laboratório de Microbiologia.

Os recipientes para recolha de produtos biológicos não devem encher-se para além dos 2/3 de capacidade (22,32,51,52).

4.3.1 Meios de STUART

O meio de Stuart, de coloração branca opalescente, é essencialmente uma solução tampão isenta de compostos nitrogenados, formulado para conservar a viabilidade das bactérias durante o transporte. A ausência de uma fonte de nitrogénio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a sua composição em hidratos de carbono permite a sobrevida dos mesmos. Este conserva microrganismos como Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

Composição: Tioglicolato e Glicerolfosfato de sódio, Cloreto de cálcio, Azul de metileno e Agar (32).

4.3.2 Meio de Amies com carvão

O meio de Amies é uma modificação do meio de Stuart contendo tampão fosfato inorgânico. Este meio é utilizado sempre que exista suspeita de Neisseria gonorrhoeae, uma vez que o carvão neutraliza as substâncias inibidoras existentes nas zaragatoas de algodão, nomeadamente os ácidos gordos, que são tóxicos para os gonococos e inibem o seu crescimento posterior nos meios de cultura. É adequado para a conservação de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, S. sorotipo Typhi, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Neisseria meningitidis.

Composição: tampão de fosfato inorgânico, sais de magnésio e cálcio, e cloreto de sódio com um ambiente reduzido devido à presença de tioglicolato de sódio (32).

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Relatório de Estágio

4.3.3 Meio PORTAGERM™

Trata-se de um meio gelosado e tamponado que contém agentes redutores e que pode ser usado para transportar todos os microrganismos, incluindo os anaeróbios.

A pequena quantidade de agar proporciona uma consistência semi-sólida que impede a difusão do oxigénio e o derrame durante o transporte.Os agentes redutores combinam- se com o oxigénio livre para manter a anaerobiose. A reazurina é o indicador de oxido-redução e permite visualizar a presença ou ausência de oxigénio, consoante apresente coloração azul lavanda ou nenhuma coloração (53,54).

4.4 EXAME MICROSCÓPICO 4.4.1 Exame a fresco

O Exame a fresco baseia-se na observação directa da amostra ao microscópio, preservando a forma natural dos microrganismos.

O exame a fresco permite apreciar a presença de elementos celulares e microrganismos, nomeadamente, bactérias, fungos e parasitas. É executado colocando o produto numa lâmina, cobrindo com uma lamela e observando ao microscópico óptico com objectiva de 40x (32).

4.4.2 Exame corado

O exame pós-coloração (fixação e coloração de microrganismos), facilita a posterior observação microscópica.

Este, permite avaliar as características morfológicas das bactérias no que se refere à sua forma e afinidade para os corantes.

Existem vários tipos de coloração, tendo sido utilizados durante o estágio as seguintes colorações (32)

4.4.2.1 Coloração diferencial – Método de Gram

Certas bactérias, quando tratadas por um corante básico de pararosanilina (ex.: violeta de cristal), e seguidamente pelo iodo, fixam o corante de tal modo que este não é removido pelo diferenciador álcool-acetona. A estas bactérias dá-se o nome de bactérias

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Gram-Relatório de Estágio

positivas, e coram de azul escuro. A parede das bactérias Gram-positivas é constituída por uma camada espessa de peptidoglicano, suficientemente porosa para permitir a passagem de metabolitos para a membrana plasmática. Outras bactérias são descoradas quando é aplicado o diferenciador álcool – acetona, e designadas de Gram-negativas. Estas bactérias apresentam uma fina camada de peptidoglicano na constituição da parede. Para que se possam ver mais facilmente quando observadas ao microscópio, aplica-se um corante de contraste de cor vermelha (fucsina ou safranina).

É a coloração mais recorrente no laboratório de Microbiologia, formando a base para distinguir os grupos mais importantes de bactérias: Gram-positivas e Gram-negativas. É ainda possível observar, através da coloração de Gram, as diferentes morfologias que as bactérias podem apresentar. Deste modo, as bactérias podem apresentar forma esférica (cocos), forma de bastonete (bacilo), forma oval (cocobacilo), forma de vírgula (vibrião), forma ondulada (espirilo), ou em forma de espiral (espiroqueta).

Algumas bactérias formam ainda agregados podendo dispor-se em: diplococos, cachos e cadeias (32,33).

Reagentes:

1) Solução de violeta de cristal (cristal violeta – 18 g, álcool etílico desnaturado – 200 ml, oxalato de amónio – 8 g, água destilada estéril – 800 ml);

2) Solução de lugol (iodo – 13 g, iodeto de potássio – 20 g, PVP – 100 g, água destilada estéril – 970 ml);

3) Descolorante (álcool etílico desnaturado – 500 ml, acetona – 500 ml); 4) Solução de safranina (safranina – 2,4 g; álcool etílico desnaturado – 100 ml,

água destilada estéril – 900 ml). Procedimento:

1) Espalhar em camada fina a amostra a examinar numa lâmina, secar e fixar ao calor;

2) Cobrir o esfregaço com cristal violeta, aguardar 1 minuto e passar cuidadosamente por água;

3) Cobrir com a solução de lugol, deixar em contacto durante 1 minuto e passar com cuidado por água;

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Relatório de Estágio

5) Cobrir com safranina, deixar em contacto durante 1 minuto, passar cuidadosamente por água e secar.

Princípio:

Após a fixação da amostra na lâmina pelo calor, as bactérias são expostas ao cristal violeta (corante primário) e o iodo é adicionado, formando um complexo com o primeiro. Quando é aplicada a solução descolorante, o complexo é retido nas bactérias gram-positivas, mas não nas gram-negativas. Nas bactérias do tipo Gram-positivo o corante fica confinado na camada espessa de peptidoglicano que constitui a parede e estas apresentam uma coloração violeta. Ao invés, as bactérias Gram-negativas como possuem uma camada de peptidoglicano muito fina, não retêm o corante primário aquando da descoloração, sendo necessário realizar uma contra-coloração com safranina, que lhes dá uma aparência avermelhada (32).

4.4.2.2 Coloração de Ziehl-Neelsen modificado (Coloração álcool-ácido resistente) Certos microrganismos possuem na sua parede ácidos gordos de cadeia longa (ácido micólico), que conferem impermeabilidade ao violeta de cristal e a outros corantes básicos. Calor ou detergentes devem ser usados para permitir a entrada de corantes primários nestas bactérias. Uma vez dentro das células bacterianas, o corante não é eliminado mesmo com solvente álcool-ácido. A coloração Ziehl-Neelsen tem como princípio fundamental a coloração álcool-ácido-resistente de microrganismos e diferencia grupos específicos de bactérias como Mycobacterium spp e Criptosporidium sp.

É utilizada para corar micobactérias e outros organismos álcool-ácido-resistentes. Reagentes:

1) Carbolfucsina (reagente de Kynioun-Biomérieux);

2) Solução ácido-alcoólica (970 ml de álcool etílico 96% + 30 ml de HCl); 3) Solução de azul-de-metileno (Solução de Gabett-Biomérieux).

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Relatório de Estágio

1) Espalhar em camada fina a amostra a examinar numa lâmina, secar e fixar ao calor;

2) Cobrir o esfregaço com solução de carbolfucsina;

3) Aguardar durante 5 minutos, escorrer o corante e lavar cuidadosamente com água;

4) Adicionar a solução ácido-alcoólica, deixar em contacto durante 3 minutos e lavar suavemente com água destilada;

5) Cobrir a lâmina com azul-de-metileno e deixar em contacto durante 1 minuto; 6) Passar por água destilada e deixar secar.

Princípio:

A parede das micobactérias possui cadeias longas de ácidos gordos denominados ácidos micólicos, que tornam a bactéria bastante hidrofóbica e a protegem de ácidos e bases fortes, bem como de agentes tóxicos e antibióticos que necessitam de uma solução aquosa. A coloração de Ziehl-Neelsen modificada a frio utiliza carbolfucsina contendo fenol que solubiliza os lípidos da parede bacteriana e auxilia a penetração do corante. Durante a descoloração com solução ácido-alcoólica os microrganismos que não possuem ácidos micólicos na parede libertam o corante primário, enquanto as micobactérias permanecem coradas de vermelho. Finalmente, realiza-se uma contra-coloração com azul-de-metileno que vai corar o fundo e os restantes microrganismos de azul (32).

4.4.2.3 Coloração com fucsina de Ziehl

É utilizada para identificar colónias suspeitas de Campylobacter spp., através da observação da sua morfologia.

Procedimento:

1) Efectuar esfregaço das colónias suspeitas;

2) Cobrir a Lâmina com fucsina durante 1 a 3 minutos (ou 10 segundos no caso do

Campylobacter spp.);

3) Lavar cuidadosamente com água; 4) Secar.

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Relatório de Estágio

4.5 IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS

4.5.1 Testes manuais

Para a identificação do agente isolado além de se ter em conta as observações macroscópicas (ex: características de colónias nos meios) e microscópicas (ex: características tinturiais e morfológicas), também tem que se ter em consideração alguns testes de identificação. Para identificação do agente etiológico foram realizados os seguintes testes:

4.5.1.1 Teste da catalase

O teste da catalase é realizado utilizando o kit ID color catalase (IS – ASE), que possui peróxido de hidrogénio a 3%. As bactérias que possuem a enzima catalase são capazes de desdobrar o peróxido de hidrogénio originando água e oxigénio.

É realizada colocando numa lâmina uma gota do reagente e em seguida, transferindo uma a duas colónias a testar (figura 7). A presença de uma catalase traduz-se pela emissão imediata de bolhas de oxigénio, indicando uma reacção positiva (32).

2H2O2 ↔ 2 H2O + O2

Figura 7 – Teste da catalase.

Adaptado de : http://umconviteabiomedicina.blogspot.pt/2011/04/identificacao-de-bacterias-catalase-e.html em30 de Abril de 2016 A presença da catalase permite realizar a distinção entre Staphylococcus spp. (catalase positiva) e Streptococcus spp. (catalase negativa).

Devido à existência de catalase nos eritrócitos, a prova deve ser interpretada com cautela quando efectuada a partir de colónias retiradas de meios contendo sangue, pois podem ocorrer falsos positivos.