4.5.1 Testes manuais
Para a identificação do agente isolado além de se ter em conta as observações macroscópicas (ex: características de colónias nos meios) e microscópicas (ex: características tinturiais e morfológicas), também tem que se ter em consideração alguns testes de identificação. Para identificação do agente etiológico foram realizados os seguintes testes:
4.5.1.1 Teste da catalase
O teste da catalase é realizado utilizando o kit ID color catalase (IS – ASE), que possui peróxido de hidrogénio a 3%. As bactérias que possuem a enzima catalase são capazes de desdobrar o peróxido de hidrogénio originando água e oxigénio.
É realizada colocando numa lâmina uma gota do reagente e em seguida, transferindo uma a duas colónias a testar (figura 7). A presença de uma catalase traduz-se pela emissão imediata de bolhas de oxigénio, indicando uma reacção positiva (32).
2H2O2 ↔ 2 H2O + O2
Figura 7 – Teste da catalase.
Adaptado de : http://umconviteabiomedicina.blogspot.pt/2011/04/identificacao-de-bacterias-catalase-e.html em30 de Abril de 2016 A presença da catalase permite realizar a distinção entre Staphylococcus spp. (catalase positiva) e Streptococcus spp. (catalase negativa).
Devido à existência de catalase nos eritrócitos, a prova deve ser interpretada com cautela quando efectuada a partir de colónias retiradas de meios contendo sangue, pois podem ocorrer falsos positivos.
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4.5.1.2 Teste da coagulase
As estirpes de Staphylococcus aureus caracterizam-se por produzirem uma enzima termoestável denominada coagulase. Existem duas formas de coagulase: ligada à parede celular (Clumping factor-factor de afinidade para o fibrinogénio) e livre.
O teste de identificação das estirpes de Staphylococcus aureus é realizado utilizando o Kit SLIDEX Staph Plus, um teste rápido de aglutinação de partículas de látex.
O reagente deste kit engloba partículas de látex azul sensibilizadas com fibrinogénio humano e anticorpos monoclonais, permitindo a detecção simultânea do clumping factor, da proteína A pelo fragmento das Fc das IgG de rato e de um antigénio de grupo ligado às estruturas periféricas específicas de S. Aureus. Este último, é particularmente importante no caso de estirpes resistentes à meticilina, pois nestas a proteína A e o clumping factor podem ser expressos em menor quantidade.
Relativamente ao teste da coagulase em tubo, no qual é detectada somente a coagulase livre, este método apresenta maior sensibilidade, especificidade e rapidez.
É realizado utilizando dois círculos de uma carta descartável onde se colocam respectivamente uma gota de reagente anti-Staphylococcus aureus e uma gota de controlo negativo (figura 8). São adicionadas colónias suspeitas a ambos os círculos e procede-se à mistura das mesmas com os reagentes, utilizando bastonetes e efectuando um movimento rotativo ligeiro da carta. O resultado é positivo quando se observa aglutinação com o primeiro reagente e ausência de aglutinação no círculo correspondente ao controlo (32).
Figura 8 – Teste da coagulase.
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4.5.1.3 Identificação serológica do Grupo de Lancefield
São utilizados três esquemas diferentes para classificação dos estreptococos: padrão hemolítico, propriedades Bioquímicas e propriedades serológicas. A classificação serológica foi desenvolvida por Rebecca Lancefield (55,56)e baseia-se na existência de antigénios grupo-específicos, na maior parte dos casos hidratos de carbono da parede celular. A identificação serológica dos estreptococos é realizada utilizando o kit SLIDEX Strepto Plus, um teste rápido de aglutinação de micropartículas de látex, que permite a grupagem, inserir num dos grupos, dos estreptococos A, B, C, D, E, F e G (figura 9). Os reagentes são constituídos por partículas de poliestireno sensibilizadas com anticorpos dirigidos contra os antigénios de grupo. A presença de antigénios correspondentes provoca uma aglutinação visível das partículas de látex. O teste é realizado em colónias isoladas e após realizar a extracção do antigénio da parede através de uma enzima contida num reagente específico (57).
Figura 9 – Identificação serológica do grupo de Lancefield. Adaptado de: http://es.slideshare.net/pabloandresriquelme9/em 30 de Abril de 2016
4.5.1.4 Teste da citocromo oxidase
Este teste permite a detecção da enzima citocromo oxidase, uma hemo-proteína que actua como elo final na cadeia respiratória aeróbia, transferindo electrões para o oxigénio, com formação de água.
As bactérias que possuem esta enzima oxidam o reagente fenilenodiamina formando um composto colorido violeta, o indofenol.
O ácido ascórbico incorporado no reagente actua como agente redutor limitando a auto- oxidação e melhorando a estabilidade do reagente.
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O teste é efectuado colocando uma gota do reagente num disco impregnado, ao qual se adiciona, por espalhamento, uma colónia. O aparecimento em 10 segundos de uma coloração que vai de violeta a púrpura indica um teste positivo (figura 10).
Este método permite diferenciar Neisseria spp. e a maioria das espécies de Pseudomonas, que são oxidase-positivas das enterobactérias que são oxidase-negativas (32).
Figura 10 – Teste da citocromo oxidase.
Adaptado de : http://www.slideshare.net/DanaSinzianaBreharCi/neisseriaceae-45658928em 30 de Abril de 2016
4.5.1.5 Teste de sensibilidade à optoquina
A optoquina é uma substância que inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae, provocando uma halo de inibição da cultura em placa. Os restantes estreptococos, sobretudo os -hemolíticos, são resistentes.
O teste consiste em seleccionar uma colónia suspeita isolada e semeá-la em estrias apertadas em direcções perpendiculares numa placa de gelose de sangue, de modo a obter- se colónias confluentes. No centro da área semeada coloca-se o disco com optoquina e procede-se à incubação na estufa, durante 24h a 37ºC e em atmosfera enriquecida em CO2.
Após incubação deve medir-se o halo de inibção existente (figura 11) e caso este seja superior a 15 mm significa a presença eventual de Streptococos pneumoniae (20,32).
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Figura 11 – Teste da optoquina.
Adaptado de: http://slideplayer.com.br/slide/5975188/ em 30 de Abril de 2016
4.5.1.6 Prova de Filamentação ou Blastese
A prova da filamentação permite distinguir a Candida albicans de outras leveduras. Nesta prova uma colónia de fungos é inoculada em cerca de 500 µL de soro humano, e a suspensão é incubada durante 2 horas, a 37ºC. Passado esse tempo retira-se uma gota e observa-se ao microscópio. Nessa análise podemos observar os seus tubos de germinação (figura 12). Deste modo, podemos a partir destes determinar se se trata de Candida albicans ou não. Se se tratar de Candida albicans, então os tubos de germinação formar- se-ão com formato de dedos de luva, sem segmentações. Se, pelo contrário, possuírem essas segmentações, apenas se pode afirmar que é negativo para Candida albicans (8).
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Figura 12 – Formação do tubo germinativo na levedura Candida albicans. Adaptado de: http://laboratoriohallazgo.blogspot.pt/ em 1 de Maio de 2016
4.6 CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO