Exames laboratoriais

→ Coleta de sangue

Foi realizada a coleta de sangue venoso entre 07:30 e 10:00h (para evitar o efeito da variação diária do sistema hemostático), após pelo menos 12h de jejum, a partir da veia antecubital do braço esquerdo, com mínima ou sem oclusão venosa (oclusão venosa prolongada pode estimular a produção de PAI-1 pelas células endoteliais e alterar os resultados de outros marcadores de hemostasia). A coleta de sangue foi realizada entre

o 3º e 9º dias do ciclo menstrual, ou mais que 60 dias após o último período menstrual para mulheres com SOP e ciclos irregulares.

Foram coletados 14 ml de sangue periférico em citrato de sódio 3,8%, na proporção 9:1 para dosagem dos marcadores de hemostasia. Imediatamente após a coleta, as amostras foram colocadas em uma caixa de isopor com gelo e transportadas até o Hemocentro em até 1h para seu processamento e centrifugação adequada. Em seguida, o sangue foi rapidamente centrifugado a 3500 rpm durante 15 minutos, e o plasma foi dividido em alíquotas de 400µL e armazenado em freezer a -80oC, para realização dos ensaios posteriormente.

Também foram coletados 14 ml de sangue periférico para dosagem bioquímica e hormonal, sendo 4 ml coletados em tubo de citrato de sódio com fluoreto para dosagem da glicemia de jejum e 10 ml coletados em tubo seco, sem EDTA, para dosagem de insulina, testosterona total e testosterona livre.

→ Determinação das concentrações plasmáticas

Para realização das análises laboratoriais as amostras dos marcadores de hemostasia foram descongeladas rapidamente a 37o_{C em banho-maria. A fim de}

minimizar a interferência das variações interensaios na comparação dos resultados, as amostras dos controles e sujeitos foram analisadas concomitantemente.

Dosagem do TAFI

Para avaliar a atividade do TAFI no plasma foi empregado o método cromogênico, utilizando-se o kit Actichrome® TAFI Activity (American Diagnostica, Stamford, CT, USA).

A titulação deste teste foi feita em microplaca. As colunas 1 e 2 da placa foram reservadas para a posterior curva de calibração. Após distribuir 90µL de tampão em metade da placa adicionou-se o plasma diluído 1:25 e foram acrescentados 10µL do TAFI activation enhancer e 15µL do reagente de ativação. Na outra metade da placa foram adicionados 115µL do tampão e 25µL do plasma diluído 1:25 sem os reagentes de ativação, e dessa forma, metade foi usada para controle do plasma inativo. A placa foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador de placas.

Decorrido este tempo, foram adicionados 50µL do TAFI padrão e 250µL do tampão nos poços A1 e A2 e, a partir destes, foram feitas diluições seriadas até os poços E1/E2, removendo de cada poço 150µL e passando para o próximo, sendo que nos poços

E1/E2 foram descartados 150µL, de forma que as concentrações fossem 2, 1, 0,5, 0,25 e 0,125µg/ml. Os poços F1/F2 foram usados para o branco, com 150µL de tampão.

Foram adicionados 50µL do TAFI developer em toda placa e, em seguida, incubada por 30 minutos a 37oC. Após este período, a reação foi paralisada pela adição de 10µL de ácido sulfúrico. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro, em até uma hora, em comprimento de onda de 490nm.

Para determinar a atividade do TAFI nas amostras foi utilizado o seguinte cálculo:

∆Abs490nm (TAFI) = ∆Abs490nm (plasma ativado) - ∆Abs490 nm (plasma inativado)

Posteriormente, os resultados foram interpolados no gráfico e multiplicados pelo fator de diluição.

A atividade do TAFI no plasma estabelecida pelo fabricante é de aproximadamente 12-20µg/ml. O valor de referência do Laboratório de Hemostasia do Hemocentro da UNICAMP foi estabelecido por sua determinação nas amostras controles. Os resultados foram expressos em µg/ml.

Dosagem do D-dímero

A dosagem do D-dímero foi feita pelo método imunoturbidimétrico, utilizando-se o kit INNOVANCE® _{D-Dimer (Dade-Behring, Newark, DE, USA).}

O método baseia-se na agregação de partículas de polistireno covalente revestidas com um anticorpo monoclonal quando misturadas com amostras contendo D- dímero. A região de ligações transversais de D-dímeros possui uma estrutura estereossimétrica, isto é, o determinante antigênico para o anticorpo monoclonal ocorrer duas vezes. Consequentemente, basta um anticorpo para desencadear uma reação de agregação que é depois detectada turbidimetricamente através do aumento na turvação.

O aparelho utilizado para esta dosagem foi o BCS-XP (Siemens). A partir de 9µL de amostra de plasma, foram adicionados 9µL do diluente de D-dímero. Esta mistura foi incubada durante 3 minutos a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 72µL de solução tampão e 27µL de um reagente suplementar. Posteriormente, adicionou-se 72µL do reagente do D-dímero e a leitura realizada em mA/min. Esta reação foi igual tanto para o grupo controle como para as amostras. Os resultados foram expressos em mg/L.

Dosagem do PAI-1

A atividade do PAI-1 no plasma foi determinada pelo método cromogênico utilizando-se o kit Berichrom PAI® (Dade-Behring, Newark, DE, USA).

O método baseia-se na inativação da uroquinase do reagente pela adição do PAI da amostra, restando uma uroquinase residual que é determinada através da transformação do plasminogênio em plasmina. A plasmina resultante é medida a 405 nm, mediante desdobramento de um substrato cromogênico (plasminogenólise reforçada).

O aparelho utilizado para esta dosagem foi o BCS-XP (Siemens). A partir de 50µL da amostra de plasma, foram adicionados 100µL do reagente uroquinase. Essa mistura foi incubada durante 5 minutos a 37oC. Em seguida adicionou-se 200µL do reagente plasminogênio e 200µL de um oxidante. Novamente, esta mistura foi incubada por mais 5 minutos a 37oC. Posteriormente, foram adicionados 500µL do substrato de plasminogênio e a leitura realizada em 60 segundos.

O valor de referência para o teste de acordo com o fabricante foi de 0,3 – 3,5 U/ml. Os resultados foram expressos em U/ml.

Determinação da geração de trombina

Para determinar a geração de trombina foi empregado o teste de geração de trombina ou endogenous thrombin potential (ETP) onde a conversão cinética de um substrato sintético de trombina foi medido pela liberação de um cromóforo na amostra de plasma em um comprimento de onda de 405 nm. A formação de trombina foi iniciada pela adição do reagente Dade Innovin® e cloreto de cálcio. A curva de formação de trombina foi obtida por derivação matemática da medida da cinética de formação cuja integral (descrita como a “área abaixo da curva”) corresponde ao ETP. Adicionalmente, para ser quebrado pela trombina, o substrato foi também dividido resultando no complexo trombina-α2-macroglobulina.

Para determinar o ETP ou potencial endógeno de trombina, o substrato clivado pelo complexo trombina-α2-macroglobulina foi calculado baseado na conversão total e depois subtraído. Os cálculos necessários foram completados automaticamente pelo BCS® System com o software de análise de ETP disponível.

O ensaio foi medido por um período de 20 minutos pelo BCS® System. As dosagens de ETP foram realizadas por lotes. Vinte dosagens de ETP foram processadas simultaneamente em uma centrífuga de cubetas.

A técnica de dosagem do ETP iniciou-se a partir de 40µL de solução tampão que foram adicionadas a 40µL de reagente. Em seguida foram acrescentados 15µL de cloreto de cálcio e 30µL do reagente adicional Dade Innovin®.

Os resultados foram expressos em nmol/min.

Glicemia de jejum

A determinação da dosagem sérica de glicemia foi realizada após coleta de sangue em tubo de 4 ml de citrato de sódio com fluoreto, por meio do método enzimático colorimétrico utilizando-se o kit ROCHE Glucose GOD-PAP, Indianópolis, USA.

O sistema utilizado para aferição foi o MODULAR ACN 249. O intervalo de medição foi de 0,11-25 mmol/L (2-450 mg/dl). Coeficiente de variação interensaio foi de 1,8% e intraensaio de 0,9%. Os resultados foram expressos em mg/dl.

Insulina

Para determinar a dosagem sérica de insulina após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, foi utilizado o método imunométrico em fase sólida quimioluminescente de duas voltas utilizando-se os kits LIN1 e LIN2.

O sistema utilizado para aferição foi o IMMULITE/IMMULITE 1000, SIEMENS, Los Angeles, USA. O intervalo de medição teve como mediana 8,9 mUI/ml e uma faixa de referência de 95% mais baixa até 28,4 mUI/ml. Coeficiente de variação interensaio foi de 6,4% e intraensaio de 0,9%.

Os resultados foram expressos em µUI/ml.

Testosterona total

A dosagem sérica de testosterona total foi realizada após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, por meio do método de eletroquimioluminescência. O sistema utilizado para aferição foi o COBAS E-411 da ROCHE.

Os resultados foram expressos em ng/ml.

Testosterona livre

A dosagem sérica de testosterona livre foi realizada após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, por meio do método de radioimunoensaio de fase sólida. O sistema utilizado foi o contador GAMA (1470 Automatic Gamma Counter, USA).