FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIA RAQUEL MARQUES FURTADO DE MENDONÇA LOUZEIRO
ASSOCIAÇÃO ENTRE ALGUNS PARÂMETROS HEMOSTÁTICOS E DISTRIBUIÇÃO DE GORDURA AVALIADA CLINICAMENTE E ATRAVÉS DE DENSITOMETRIA
CORPORAL EM MULHERES COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS
ASSOCIATION BETWEEN SOME HEMOSTATIC PARAMETERS AND FAT DISTRIBUTION AS EVALUATED CLINICALLY AND BY BODY DENSITOMETRY IN
WOMEN WITH POLYCYSTIC OVARY SYNDROME
CAMPINAS 2017
ASSOCIAÇÃO ENTRE ALGUNS PARÂMETROS HEMOSTÁTICOS E DISTRIBUIÇÃO DE GORDURA AVALIADA CLINICAMENTE E ATRAVÉS DE DENSITOMETRIA
CORPORAL EM MULHERES COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS POLICÍSTICOS
ASSOCIATION BETWEEN SOME HEMOSTATIC PARAMETERS AND FAT DISTRIBUTION AS EVALUATED CLINICALLY AND BY BODY DENSITOMETRY IN
WOMEN WITH POLYCYSTIC OVARY SYNDROME
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde, na área de concentração em Fisiopatologia Ginecológica
Thesis submitted to the Postgraduate Program in Obstetrics and Gynecology, School of Medical Sciences, University of Campinas (UNICAMP) for the purpose of obtaining the title of PhD in Health Sciences, with a focus on Gynecologic Pathology
ORIENTADA PELA PROFª. DRª. CRISTINA LAGUNA BENETTI PINTO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
MARIA RAQUEL MARQUES FURTADO DE MENDONÇA LOUZEIRO E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. CRISTINA LAGUNA BENETTI PINTO.
CAMPINAS 2017
MARIA RAQUEL MARQUES FURTADO DE MENDONÇA LOUZEIRO
ORIENTADORA: Profª Drª CRISTINA LAGUNA BENETTI PINTO
MEMBROS:
1. PROFª. DRª. CRISTINA LAGUNA BENETTI PINTO
2. PROF. DR. LUCIANO DE MELO POMPEI
3. PROF. DR. JOSÉ MARIA SOARES JÚNIOR
4. PROF. DR. PAULO CÉSAR GIRALDO
5.PROFª. DRª. CÁSSIA RAQUEL TEATIN JULIATO
Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
À minha querida mãe, Sonia,
que sempre me incentivou na conquista de meus
objetivos pessoais e profissionais, não medindo esforços para que meus sonhos se concretizassem.
Ao meu saudoso pai, Eduardo, fonte de inspiração, estímulo altruísta, forte motivação para meu desenvolvimento profissional, que se ausentou no plano físico, mas que permanece vivo dentro de mim.
Aos meus amados irmãos, Maria Beatriz e Paulo Eduardo, grandes exemplos de perseverança e conquista.
Aos meus tesouros, meus filhos Maria Luiza e Miguel, que chegaram para iluminar a minha vida, e me fizeram refletir sobre a verdadeira felicidade...
fontes de constante alegria ao meu coração.
Ao meu grande amor, Gerson, ajuda constante, apoio incessante, companheiro fiel, grande incentivador deste trabalho.
A Deus, pelo dom da vida, e por me conceder a oportunidade de realizar meus sonhos, fortalecendo-me nos momentos em que mais precisei.
À minha orientadora, Profa. Dra. Cristina Laguna Benetti Pinto, por sua amizade, cohecimentos e dedicação, sempre me orientando de forma carinhosa e encorajadora para a concretização deste trabalho.
Aos professores da Pós-Graduação, Profa. Dra. Eliana Amaral, Prof. Dr. Luiz Carlos Zeferino, Prof. Dr. Luiz Francisco Cintra Baccaro, Prof. Dr. Luiz Gustavo Oliveira Brito, Prof. Dr. Rodolfo de Carvalho Pacagnella, Profa. Dra. Fernanda Garanhani de Castro Surita, pelos seus ensinamentos e contribuição para o conhecimento científico.
Aos membros da banca de Qualificação, Profa. Dra. Cássia Raquel Teatin Juliato, Prof. Dr. Luiz Francisco Cintra Baccaro e Prof. Dr. Luiz Gustavo Oliveira Brito, que muito contribuíram para a elaboração final desta tese.
À Márcia Fatobeni, secretária da Divisão de Ginecologia do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), por sua disponibilidade e solicitude.
À Denise Barbosa Amadio, secretária pro tempore do Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia por todo o empenho em ajudar-me nos trâmites administrativos para a conclusão desta tese.
Ao meu esposo querido, pelo seu companheirismo e infinita compreensão e paciência pelo longo tempo de ausência.
Esta pesquisa recebeu apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – processo número 11707-0/2010.
“Há três coisas que jamais voltam atrás: a flecha lançada, a palavra pronunciada e a oportunidade perdida.”
Introdução: Mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) frequentemente
manifestam fatores de risco tromboembólico como obesidade, hiperandrogenismo e resistência insulínica, evidências indiretas que sugerem maior probabilidade de alterações na coagulação, porém os dados disponíveis acerca de marcadores da hemostasia nesta população, bem como sua relação com a distribuição de gordura, são limitados e por vezes conflitantes. Objetivo: Avaliar alguns marcadores do sistema hemostático e sua associação com parâmetros clínicos e densitométricos de distribuição de gordura em mulheres com SOP. Sujeitos e Método: Estudo transversal incluindo 45 mulheres com SOP atendidas no Ambulatório de Ginecologia Endócrina do Departamento de Tocoginecologia, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, e 45 mulheres com função gonadal normal, pareadas por idade (± 2 anos) e IMC (± 2kg/m2). Para todas, foram
avaliados parâmetros clínicos [circunferência da cintura (CC), circunferência do quadril (CQ), relação cintura-quadril (C/Q)], e dosados marcadores de hemostasia: inibidor do ativador do plasminogênio do tipo-1 (PAI-1), inibidor da fibrinólise ativado pela trombina (TAFI), D-dímero e teste de geração de trombina (TGT). Um subgrupo de 15 mulheres com SOP foi também submetido a densitometria corporal pela técnica de Dual-energy X-ray absorptiometry
(DXA) com avaliação de: massa total, massa gorda, massa magra, percentual de gordura
corporal, percentual de gordura androide, percentual de gordura ginoide e relação androide/ginoide (relação A/G). Os dados foram comparados entre os grupos através dos testes
t Student pareado ou Mann-Whitney. Correlações de Pearson e Spearman foram usadas para
correlacionar parâmetros de hemostasia e composição corporal. O nível de significância foi de 5%. Resultados: As mulheres do grupo SOP e controles eram jovens (26,13±4,31 e 26,22±4,28 anos, respectivamente) e com sobrepeso (29,32±6,37 e 29,25±6,32 kg/m2), sem diferença entre os grupos, porém as mulheres com SOP apresentaram maior relação C/Q (0,79±0,08 e 0,76±0,05, p=0,03), quando comparadas ao grupo controle. Nas mulheres com SOP, os níveis séricos dos marcadores fibrinolíticos PAI-1 e D-dímero correlacionaram-se positivamente com os parâmetros clínicos IMC, CC, CQ e relação C/Q, enquanto que o TAFI correlacionou-se positivamente com IMC, CC e relação C/Q, ressaltando o papel da obesidade central como fator de risco tromboembólico. Os parâmetros IMC e CC também apresentaram correlação positiva com a concentração máxima de trombina e com a área sob a curva ou potencial de trombina endógena, obtidos a partir do TGT. A correlação entre distribuição de gordura corporal avaliada por DXA e parâmetros hemostáticos, em um subgrupo de 15 mulheres, mostrou correlação positiva entre percentual de gordura androide e relação A/G com TAFI, reforçando os achados
particularmente em mulheres jovens e com sobrepeso. Nestas mulheres, a composição corporal afeta diretamente os níveis de TAFI, PAI-1 e D-dímero sugerindo um estado de hipercoagulabilidade com provável elevação do risco tromboembólico.
Palavras-chave: síndrome do ovário policístico, hemostasia, composição corporal, obesidade
Introduction: Women with polycystic ovary syndrome (PCOS) often present with thromboembolic risk factors such as obesity, hyperandrogenism and insulin resistance, indirect evidence suggestive of a greater probability of coagulation disorders; however, the data available on hemostatic markers in this population, as well as its relation with fat distribution, are limited and sometimes conflicting. Objective: To evaluate some markers of the hemostatic system and their association with fat distribution, assessed clinically and by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), in women with PCOS. Subjects and Methods: This cross-sectional study included 45 women with PCOS receiving care at the Gynecological Endocrinology clinic, Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medical Sciences, University of Campinas (UNICAMP) and 45 women with normal ovarian function paired by age (± 2 years) and body mass index (BMI; ± 2 kg/m2). Clinical parameters (waist circumference [WC], hip circumference [HC],
and waist-hip ratio [WHR]) were measured in all cases, and the following hemostatic markers were assessed: plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), D-dimer, and thrombin generation test (TGT). A subgroup of 15 women with PCOS was also submitted to DXA to evaluate total body mass, fat mass, lean mass, body fat percentage, android fat percentage, gynoid fat percentage and android/gynoid fat ratio (A/G ratio). The data were compared between groups using Student’s t-test for paired samples or the Mann-Whitney test. Pearson’s and Spearman’s correlations were used to assess the relationship between hemostatic parameters and body composition. Significance level was 5%. Results: The women in both groups were similarly young and overweight, with a mean age of 26.13 ± 4.31 years in the PCOS group and 26.22 ± 4.28 years in the control group, and mean BMI of 29.32 ± 6.37 and 29.25 ± 6.32 kg/m2, respectively, without difference between the groups, however WHR was greater in the women with PCOS compared to the control group (0.79 ± 0.08 and 0.76 ± 0.05; p=0.03). In the PCOS group, there was a positive correlation between the fibrinolytic markers PAI-1 and D-dimer and BMI, WC, HC and WHR, and between TAFI and BMI, WC and WHR, highlighting the role of central obesity as a thromboembolic risk factor. A positive correlation was also found between BMI and WC and peak thrombin generation and the area under the thrombin generation curve or endogenous thrombin potential, obtained from the TGT. The correlation between body fat distribution evaluated by DXA and hemostatic parameters in a subgroup of 15 women showed positive correlation between android fat percentage and the A/G ratio and TAFI, reinforcing the clinical findings. Conclusion: In PCOS, not only obesity, but particularly fat distribution with a predominance of android fat appears to directly influence some hemostatic parameters, particularly in young and overweight women. In these
Keywords: polycystic ovary syndrome; hemostasis; body composition; abdominal obesity; venous thromboembolism; fibrinolysis.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AUC – Area under curve
CAISM – Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti – Centro de
Atenção Integral à Saúde da Mulher
CC – Circunferência de cintura CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
cm – Centímetro(s)
Cmáx – Concentração máxima de trombina / pico de trombina gerada CNS – Conselho Nacional de Saúde
CQ – Circunferência de quadril DCV – Doença cardiovascular DM2 – Diabetes mellitus tipo 2
DXA – Dual-energy X-ray absorptiometry et al. – e colaboradores
ETP – Potencial de trombina endógena (Endogenous thrombin potential) FCM – Faculdade de Ciências Médicas
HDL – HDL colesterol
HOMA-IR – Índice de HOMA (Homeostatic model assessment of insulin resistance) IFG – Índice de Ferriman-Gallwey
IMC – Índice de massa corporal
Kg – Quilograma(s)
Kg/m² – Quilograma(s) por metro quadrado
µUI/ml – Microunidades internacionais por mililitro
mA – Miliabsorbância
mA/min – Miliabsorbância por minuto mg/dL – Miligrama(s) por decilitro mg/L – Miligrama(s) por litro
ml – Mililitro(s)
ng/mL – Nanograma(s) por mililitro(s) p – Nível de significância
PAI-1 – Inibidor do ativador do plasminogênio-1 (Plasminogen activator inhibitor-1)
PDF – Produto de degradação da fibrina pg/mL – Picograma(s) por mililitro
Relação C/Q – Relação cintura-quadril RI
rpm
– Resistência insulínica – Rotações por minuto
s – Segundo(s)
SM – Síndrome metabólica
SOP – Síndrome dos ovários policísticos
T lag – Tempo para o início da geração de trombina
TAFI – Inibidor da fibrinólise ativado pela trombina (Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor)
TCLE – Termo de consentimento livre e esclarecido
TEV – Tromboembolismo venoso
Tmáx – Tempo para o pico de geração de trombina
t-PA – Ativador do plasminogênio do tipo tecidual (Tissue-type plasminogen activator)
TT – Testosterona total
TVP – Trombose venosa profunda U/ml – Unidade(s) por mililitro
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
u-PA – Ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (Urokinase-type plasminogen activator)
1. INTRODUÇÃO ... 18 2. OBJETIVOS... 31 2.1. Objetivo Geral ... 31 2.2. Objetivos Específicos ... 31 3. METODOLOGIA ... 32 3.1. Desenho ... 32 3.2. Tamanho amostral ... 32 3.3. Variáveis ... 32 3.3.1. Variáveis independentes ... 32 3.3.2. Variáveis dependentes ... 34 3.3.3. Variáveis de controle ... 35
3.4. Seleção dos sujeitos ... 36
3.4.1. Critérios de inclusão ... 37
3.4.1.1. Grupo de mulheres com SOP ... 37
3.4.1.2. Grupo de mulheres com função gonadal normal ... 37
3.4.2. Critérios de exclusão para o grupo de mulheres com SOP e para o grupo de mulheres com função gonadal normal ... 37
3.5. Técnicas, Testes e Exames ... 37
3.5.1. Exames laboratoriais ... 37
3.5.2 Técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) ... 42
3.6. Instrumento para coleta de dados ... 43
3.7. Coleta de dados ... 43
3.8. Processamento e análise dos dados ... 44
3.9. Aspectos éticos ... 45
4. RESULTADOS ... 47
Artigo 1: Android fat distribution affects some hemostatic parameters in women with polycystic ovary syndrome matched for age/body mass index to healthy controls ... 48
Artigo 2: Android fat distribution as evaluated clinically and by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) may directly affect thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) levels in women with polycystic ovary syndrome... 66
5. DISCUSSÃO GERAL ... 83
8.1. Apêndice 1 – Técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) ... 98
9. ANEXOS ... 102
9.1. Anexo 1 – Ficha de Coleta de Dados ... 102
9.2. Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ... 105
1. INTRODUÇÃO
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é referida como a principal endocrinopatia ginecológica, sendo diagnosticada em 5% a 10% das mulheres na menacme (1,2), número extremamente significativo se considerarmos sua associação com doenças metabólicas como hipertensão arterial e diabetes.
Apesar de descrita há muitos anos por Stein & Leventhal (3) e de sua alta prevalência, ainda há muita discussão em torno dos critérios a serem indicativos de seu diagnóstico. Nesses últimos anos, vários documentos, entre Consensus, Guidelines,
Position Statement e Practice Bulletin, foram elaborados por sociedades médicas com a
finalidade de uniformizar os critérios diagnósticos da síndrome. Em uma definição clínica e prática, o National Institutes of Health estabeleceu a SOP como consequente a um quadro de anovulação crônica hiperandrogênica, definida pela presença de disfunção menstrual e excesso androgênico de ordem clínica ou laboratorial. Porém, este critério eminentemente clínico foi contestado (4,5).
Dentre os documentos científicos mais recentes e utilizados na literatura científica, está o Consenso Internacional de Roterdã, de 2003, que determinou que, para o seu diagnóstico, as pacientes devem apresentar pelo menos duas das três seguintes características: oligomenorreia e/ou anovulação, sinais clínicos e/ou bioquímicos de hiperandrogenismo e ovários policísticos ao ultrassom (presença de 12 ou mais folículos em cada ovário, medindo de 2mm a 9mm e/ou aumento ovariano >10cm³), sendo necessária a exclusão de outras causas de hiperandrogenismo que apresentam quadro clínico similar: hiperplasia adrenal congênita, síndrome de Cushing e tumores secretores de andrógenos, além de outras endocrinopatias, como hiperprolactinemia e hipotireoidismo antes da conclusão do diagnóstico (6).
Tal conceito logo gerou discussão, pois alguns autores consideram necessária e imprescindível a presença do hiperandrogenismo (clínico e/ou laboratorial), que deve estar associado a uma das duas outras características imputadas à síndrome, quais sejam, a oligoanovulação e/ou a imagem ecográfica de ovários policísticos, mantendo, porém, a recomendação de exclusão de outras desordens relacionadas ao hiperandrogenismo (7). Este grupo de autores publicou suas conclusões sob a denominação de posição da “Sociedade de Excesso de Androgênios”.
Ainda sem unanimidade, em 2012, após uma nova rodada de discussão em reunião estabelecida em Amsterdã, buscando uma posição mais consensual, foram reforçados os
critérios diagnósticos para SOP estabelecidos em 2003, em Roterdã, acrescentando recomendações ou conhecimentos sobre aspectos da saúde de mulheres com SOP de um ponto de vista mais global, repetindo, introduzindo ou ressaltando aspectos associados ao diagnóstico de SOP. Assim, neste documento, foram enfocados pontos como adolescência, hirsutismo, acne, contracepção, anormalidades do ciclo menstrual, qualidade de vida, etnicidade, complicações gestacionais, saúde cardiovascular e metabólica a longo prazo e risco de câncer (8).
Mas o assunto parece longe de esgotar-se. Recentemente, em 2015, foi publicada uma revisão sobre “as melhores práticas na avaliação e tratamento da SOP” por renomadas entidades, a Associação Americana de Endocrinologistas Clínicos e a Sociedade de Excesso Androgênico e SOP, que retomou os critérios de Roterdã para o diagnóstico da SOP, mas reitera que ele ainda gera discussões, em especial quando se consideram as mudanças tecnológicas recentes, tais como metodologia de diagnóstico hormonal, aparelhos de ultrassonografia modernos e com maior sensibilidade (9). À parte das diferenças conceituais, este documento discute manifestações na adolescência e recomenda que sejam incluídos, além do tratamento do hirsutismo, também os da alopecia e acne (9).
Independente de toda essa discussão científica, tradicionalmente as mulheres com SOP continuam produrando os serviços médicos devido à irregularidade menstrual, hirsutismo ou infertilidade (10, 11). Compete aos médicos a investigação e identificação de distúrbios metabólicos, frequentemente observados em mulheres com SOP, tais como obesidade, hiperinsulinemia, resistência insulínica (RI), diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de início precoce, dislipidemia e síndrome metabólica (SM), com repercussões clínicas desfavoráveis ao longo da vida (12-16).
A associação entre alguns distúrbios metabólicos, tais como a obesidade central ou abdominal, hipertensão arterial, glicemia de jejum alterada ou DM2, hipertrigliceridemia e HDL colesterol diminuído, constitui a SM (17). A prevalência da SM em mulheres com SOP, nos Estados Unidos, é ao redor de 43% a 46%, maior do que na população feminina sem SOP. Sabe-se que ela varia no mundo provavelmente devido a fatores genéticos, estilo de vida e hábitos alimentares. Um estudo realizado na Universidade do Rio Grande do Norte com 102 mulheres brasileiras com SOP mostrou prevalência de 28,4% de SM (18).
Sabe-se que pessoas portadoras da SM têm maior possibilidade de desenvolver doença cardiovascular (DCV) por apresentarem fatores de risco como
obesidade abdominal, HDL colesterol diminuído, hipertensão arterial, alteração do metabolismo da glicose, e estado pró-inflamatório alterado, mostrando aumento sérico de proteína C reativa e de fatores pró-trombóticos (como fibrinogênio e hiperagregabilidade plaquetária). Estima-se que haja duas vezes mais risco de DCV e cinco vezes mais risco de desenvolvimento de DM2 em mulheres com SM (17). São considerados fatores de risco para DCV a obesidade, excesso de bebida alcoólica, colesterol elevado, sedentarismo, DM2, estresse excessivo, etnia, hipertensão arterial, idade mais avançada, história familiar de DCV e tabagismo (14). Apesar da maior prevalência de fatores de risco cardiovascular na SOP, os estudos têm falhado em demonstrar aumento da mortalidade cardio e cerebrovascular nestas mulheres em comparação com a população saudável (17). Considere-se também que a SOP está associada à obesidade e à RI (10). A obesidade nessas pacientes possui papel fundamental no desenvolvimento da RI e do estado pró-inflamatório que fazem parte da SM. Pacientes com SOP, independentemente de seu índice de massa corporal (IMC), apresentam aumento da razão cintura/quadril, o que se traduz no aumento da circunferência abdominal e, consequentemente, reflete o aumento da adiposidade visceral (19). O tecido adiposo visceral produz citocinas pró-inflamatórias e promotoras da resistência à insulina, fator de necrose tumoral alfa e interleucina-6 (20).
Mulheres com SOP apresentam aumento da resistência à insulina, similar às pacientes com DM2. O mecanismo envolvido relaciona-se ao prejuízo da ação do hormônio na periferia, levando a uma consequente hiperinsulinemia. Como consequência do hiperinsulinismo, alguns tecidos têm sua função estimulada, como as células da teca ovariana, que passam a produzir andrógenos em demasia. Estima-se que 53% a 76% das mulheres com SOP tenham RI (21).
A disfunção das células β e a RI são anormalidades metabólicas inter-relacionadas na etiologia do DM2. Além disso, a RI, dificultando que a insulina exerça seu papel antilipolítico, e o aumento da testosterona, diminuindo a atividade da lipase, geram um componente aterogênico que está representado pelo aumento dos triglicerídeos, LDL colesterol e pela diminuição do HDL colesterol (22). Assim, a dislipidemia na SOP apresenta pelo menos dois fatores desencadeantes e agravantes: a RI e o hiperandrogenismo. A hipertensão arterial, também frequente na SOP, pode ser atribuída à hiperinsulinemia a partir de múltiplos mecanismos fisiopatológicos: aumento da volemia, redução da excreção renal de sódio e água, menor vasodilatação resultante da depleção de óxido nítrico e disfunções relacionadas à alteração do sistema renina-angiotensina-aldosterona (22, 23).
Desta forma, considerando a existência de todos estes fatores de risco, mulheres com SOP apresentam mais predisposição à DCV, com risco relativo estimado em 7,4 para doença coronariana quando comparado a mulheres sem SOP (22, 23), ressaltando a importância de avaliação clínica destinada a prevenir consequências a longo prazo (24). Considerando todas estas evidências de risco, é provável que a falta de comprovação do aumento da mortalidade cardiovascular associada à SOP deva-se ao uso de dados retrospectivos nos estudos, a viés de seleção e a inclusão de mulheres relativamente jovens nos estudos prospectivos de seguimento por curto prazo (23).
Sabe-se ainda que anormalidades na coagulação e deficiência da capacidade fibrinolítica também são fatores que contribuem para o desenvolvimento de DCV (25, 26), indicando estudos mais aprofundados nos mecanismos de hemostasia.
Hemostasia é um mecanismo de defesa complexo responsável pelo controle da perda de sangue resultante de uma lesão vascular. É um processo multifuncional finamente regulado que envolve a participação de vários componentes fisiológicos celulares e acelulares, incluindo a resposta vascular, a agregação plaquetária e o sistema de coagulação. Os mecanismos envolvidos no processo de coagulação, constituintes do sistema hemostático, devem ser regulados para, simultaneamente, contrapor-se à perda excessiva de sangue e evitar a formação de trombos intravasculares, decorrentes de formação excessiva de fibrina (27).
O sistema hemostático é representado por um conjunto de processos coordenados para agir com máxima eficiência, com componentes que incluem a parede vascular, as estruturas e os agentes vasoativos envolvidos na vasoconstrição e na vasodilatação da parede do vaso lesado, os fatores que levam à adesão e à agregação das plaquetas circulantes, formando o tampão hemostático, e a ativação dos fatores da cascata de coagulação, que levam à formação de coágulos de fibrina (28). Na regeneração total do tecido danificado, os coágulos são subsequentemente degradados pelo sistema fibrinolítico. O equilíbrio funcional dos diferentes componentes da hemostasia é garantido por uma variedade de mecanismos, envolvendo interações entre proteínas, respostas celulares complexas, e regulação de fluxo sanguíneo (27, 28). Portanto, a hemostasia é composta por dois sistemas antagônicos, coagulação e fibrinólise, responsáveis pela formação e dissolução do coágulo de fibrina, respectivamente. Em situações em que qualquer componente desses mecanismos esteja alterado, a hemostasia é comprometida e o resultado pode ser tanto trombose como hemorragia.
Progressos significativos ocorreram nas últimas décadas, concernentes à fisiologia desse sistema e dos mecanismos que o regulam (29, 30). Tais conhecimentos tiveram fundamental importância para a melhor compreensão da fisiologia da hemostasia e do papel das reações hemostáticas em doenças hemorrágicas e trombóticas (27).
Após a ocorrência de uma lesão vascular, três processos principais evitam a perda descontrolada de sangue: vasoconstrição, que limita o aporte de sangue para o local da lesão; agregação plaquetária, que forma o primeiro tampão no local da lesão; e coagulação sanguínea, que, pela ativação sequencial de fatores presentes no plasma, forma o coágulo de fibrina responsável pela sustentação e forma do coágulo final. A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre proteases plasmáticas e seus cofatores que culminam na gênese da enzima trombina, que, por proteólise, converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel (31).
Fibrinólise pode ser definida como a degradação da fibrina, mediada pela plasmina. O principal papel do sistema fibrinolítico é remover a fibrina dos vasos sanguíneos, tecidos, ductos e líquidos orgânicos. Quando ocorre a conversão do fibrinogênio em fibrina, paralelamente há a ativação da fibrinólise, com a conversão do plasminogênio em plasmina, para rápida remoção da fibrina, de modo a prevenir complicações trombóticas. Assim sendo, a fibrinólise pode ser considerada um mecanismo essencial de defesa do organismo contra a oclusão vascular pelo coágulo de fibrina formado (32, 33).
O sistema fibrinolítico ou sistema plasminogênio/plasmina é composto por diversas proteínas (proteases séricas e inibidores), que regulam a geração de plasmina, uma enzima ativa, produzida a partir de uma proenzima inativa (plasminogênio), que tem por função degradar a fibrina e ativar metaloproteinases de matriz extracelular (32).
As enzimas do sistema fibrinolítico são todas serinoproteases, ao passo que os inibidores da fibrinólise são membros da superfamília de proteínas designadas serpinas (inibidores de proteases séricas). São conhecidos dois ativadores fisiológicos do plasminogênio: o ativador do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA, tissue-type
plasminogen activator) e o ativador do plaminogênio do tipo uroquinase (u-PA, urokinase-type plasminogen activator). Os dois ativadores têm alta especificidade de ligação com seu
substrato (plasminogênio) e promovem hidrólise de uma única ponte peptídica, que resulta na formação da plasmina (28).
Embora a plasmina degrade não somente a fibrina, mas também o fibrinogênio, fator V e fator VIII, em condições fisiológicas, a fibrinólise ocorre como processo
que é altamente específico para a fibrina, portanto de ativação localizada e restrita, e não sistêmica, cumprindo, assim, sua função de remover o excesso de fibrina do intravascular de modo equilibrado. Esta especificidade dependente de fibrina é resultado de interações moleculares específicas entre os ativadores do plasminogênio, o plasminogênio, a fibrina e os inibidores da fibrinólise (28, 31).
A inibição do sistema fibrinolítico ocorre em nível dos ativadores do plasminogênio mediante a ação de inibidores específicos (plasminogen activator inhibitors- PAIs), cujo principal representante é o PAI-1, e diretamente sobre a plasmina, função inibitória exercida pela α2 – antiplasmina (27) (Figura1).
O PAI-1 é considerado o inibidor mais importante do t-PA, apesar de apresentar uma concentração plasmática muito baixa. Esse inibidor é uma glicoproteína produzida pelas células endoteliais. Além disso, está presente nas plaquetas, sendo liberado em grandes quantidades quando essas são ativadas. A deficiência de PAI-1 foi descrita como associada a um quadro clínico hemorrágico, e os níveis elevados, com o risco de trombose (34-37).
Figura 1. Representação esquemática do sistema fibrinolítico. Setas tracejadas: inibição; setas
contínuas: ativação. PAI-1: inibidor do ativador do plasminogênio do tipo 1; t-PA: ativador do plasminogênio do tipo tecidual; u-PA: ativador do plasminogênio do tipo uroquinase; α2-AP: alfa2-antiplasmina; PDF: produtos de degradação de fibrina.(Adaptado de Franco, 2001) (27).
Há poucos anos, um novo componente do sistema fibrinolítico foi identificado e designado TAFI (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, inibidor da fibrinólise ativado pela trombina). O TAFI é um zimogênio plasmático sintetizado pelo fígado,
uma enzima tipo carboxipeptidase , que ocupa o importante papel na hemostasia funcionando como um potente inibidor da fibrinólise. O TAFI é ativado pela trombina, tripsina e plasmina, e regula a fibrinólise pela remoção dos sítios de lisina carboxi-terminal da fibrina. Esses sítios são essenciais para a ligação do plasminogênio e do t-PA à fibrina; portanto, sua remoção acarreta inibição da lise da fibrina (38, 39). Curiosamente, a principal via de ativação do TAFI é dependente da ligação do fator IIa (trombina) à trombomodulina (complexo que exerce também a função de ativar a via anticoagulante da proteína C). Dessa forma, a molécula do TAFI representa um ponto de conexão entre os sistemas de coagulação e fibrinólise (40, 41). Recentemente, níveis elevados de antígenos de TAFI foram associados a um risco aumentado de trombose venosa profunda (TVP) (42, 43) (Figura 2).
Figura 2. Representação esquemática do ponto de conexão entre o sistema de coagulação e de
fibrinólise (TAFI), intermediado pelo complexo trombina/trombomodulina. Setas tracejadas: inibição; setas contínuas: ativação. II: protrombina; IIa: trombina; PC: proteína C; PCa: proteína C ativada; IIa-TM: trombina-trombomodulina; TAFI: thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (inibidor da fibrinólise ativado pela trombina);TAFIa: thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor ativado; PLG: plasminogênio; Pn: plasmina; PDF: produtos de degradação de fibrina. (Adaptado de Bajzar, 2000)(40).
Há algumas evidências de que mulheres com SOP podem apresentar distúrbios da fibrinólise devido ao desequilíbrio entre o ativador do plasminogênio e o PAI-1, principal regulador deste sistema (40, 41).
Já foi demonstrado que a hiperinsulinemia contribui para um estado protrombótico, reduzindo a fibrinólise e elevando os níveis de PAI-1 (44).
O D-dímero é um produto de degradação da fibrina e considerado um marcador de hipercoagulabilidade, sendo, dentre todos os marcadores, o mais amplamente utilizado. Durante a formação de um trombo, os polímeros da fibrina são degradados pela plasmina e passam a dar origem a produtos de degradação de diferentes pesos moleculares. O menor e melhor caracterizado destes produtos é o D-dímero, sendo este constituído por duas subunidades idênticas derivadas de duas moléculas de fibrina. Apresenta uma meia-vida de aproximadamente 8 horas, sendo excretado por via urinária. Assim, a partir do reconhecimento do D-dímero como o mais específico marcador para trombose e fibrinólise fisiológica, sua principal aplicação clínica diz respeito à possibilidade de exclusão diagnóstica de eventos tromboembólicos quando os seus resultados são normais (<500ng/mL), ou seja, tem alto valor preditivo negativo (45, 46). Portanto, embora baixos níveis de D-dímero possam ser detectados na circulação de indivíduos saudáveis, seus níveis aumentam significativamente nos pacientes com TVP, embolia pulmonar, coagulação intravascular disseminada, infarto do miocárdio, câncer, complicações da gravidez, pós cirúrgicos, sepse, entre outros. Assim, embora não específico, por ter alta sensibilidade para o diagnóstico de TVP e embolia pulmonar, é rotineiramente utilizado no diagnóstico de tromboembolismo venoso (TEV) clinicamente suspeito e tem sido advogado na avaliação de risco de TEV recorrente (47, 48). Muitos estudos prospectivos têm relatado associações entre níveis de D-dímero com o risco de doença cardíaca coronariana, sugerindo papéis para a ativação da coagulação e distúrbios endoteliais (49). Alguns estudos prospectivos têm associado níveis de D-dímero com o aumento do risco de acidente vascular encefálico e com doença arterial periférica e uma revisão sistemática associou os níveis de D-dímero com elevação do risco de eventos trombóticos arteriais em pacientes com doença arterial periférica (50).
Estados de hiper ou hipocoagulabilidade podem ocorrer em decorrência de um grande número de doenças. Na literatura, existem diversos testes laboratoriais que tentam identificar a causa básica, contudo ainda não se conhece um único parâmetro de laboratório que esteja aumentado em todas as formas de hipercoagulabilidade e, do mesmo modo, esteja diminuído em todas as formas de hipocoagulabilidade. Tal ensaio seria extremamente útil para a detecção da tendência tromboembólica e para a descoberta de hipocoagulabilidade induzida por drogas (51).
Em 1986, Hemker e colaboradores introduziram o uso de um substrato cromogênico da trombina para avaliação da geração de trombina em amostras desfibrinadas (52). No entanto, o método permaneceu dependente de subamostragem manual, o que limitava seu uso a laboratório de pesquisa. Em 1993, o mesmo grupo de pesquisadores introduziu novas modificações importantes no ensaio, que permitiram a mensuração contínua da geração de trombina com substratos cromogênicos, que, no entanto, apresentavam baixa reatividade e maior especificidade para a trombina. Estes autores introduziram o termo Endogenous Thrombin Potential ou ETP, que representaria a capacidade total do plasma em formar trombina depois da indução da coagulação. A quantidade de trombina gerada era calculada ao longo do tempo para a construção de uma curva de geração de trombina, conhecida como trombograma. Os autores também desenvolveram um programa de computador que permitiu calcular os parâmetros que caracterizam esta curva. Assim, o endogenous thrombin potential (ETP), ou teste de geração de trombina, passou a ser considerado um bom indicador de coagulabilidade. Ele está reduzido entre 15% e 35% em pacientes que fazem uso de anticoagulantes orais ou de heparina, e aumentado em pacientes com deficiência congênita de antitrombina, em pacientes com mutação da protrombina de Leiden ou no fator V, e em mulheres que fazem uso de contraceptivos hormonais orais. Em pacientes portadores de doença tromboembólica foi verificado aumento dos níveis de ETP entre 29,4% e 53,0% (53).
Na Figura 3 podem-se ver os principais parâmetros obtidos no teste de geração de trombina.
Figura 3.Os principais parâmetros obtidos no trombograma são mostrados na figura. (a) Intervalo ou
“lag” (T lag): corresponde à fase de iniciação da coagulação, em que as concentrações de trombina são ainda indetectáveis. (b) Pico máximo de geração de trombina (Cmáx): corresponde ao pico de geração de trombina que ocorre durante a fase de amplificação. (c) Tempo para pico (Tmáx): é o tempo para obtenção do pico. (d) Área sob a curva (AUC) ou “Endogenous thrombin potential” (ETP): expressa toda a fase pró-coagulante da reação (iniciação, amplificação e propagação). É a área sob a curva de geração de trombina. (Adaptado de Hemker, 2003) (53).
Ainda não há consenso quanto aos distúrbios da hemostasia na SOP devido ao pequeno número de estudos na literatura. Yildiz e colaboradores (54) relataram que a capacidade fibrinolítica estava diminuída em mulheres com SOP, enquanto Slopien e associados (55) não encontraram diferença na capacidade fibrinolítica entre mulheres obesas com SOP e mulheres não obesas. Por outro lado, Kellye e colaboradores (56) verificaram que a concentração do ativador do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA) foi significativamente mais elevada em mulheres com SOP, em comparação ao grupo controle. Para outros fatores, como o de von Willebrand, atividade do fator VII, proteína C, proteína S, antitrombina III, resistência à proteína C, plasminogênio e α2 antiplasmina, os níveis parecem manter-se em valores normais em mulheres com SOP (26, 57).
Tais dados são particularmente importantes considerando-se que, recentemente, foi demonstrado que mulheres com SOP possuem um maior risco de DCV (58) e de TEV (59, 60) e que esses riscos são exacerbados pelo aumento do IMC e por algumas estratégias atuais no manejo da SOP (8).
Acredita-se que desordens do sistema hemostático e alterações da coagulação possam contribuir para o aumento do risco de eventos cardiovasculares em mulheres com
Área sob curva de geração de trombina (AUC) (d)
Pico máximo de geração de trombina (Cmáx) (b)
Tempo para pico (Tmáx) (c) Tempo para pico (Tmáx) (c)
SOP, embora as evidências sejam conflitantes e baseadas em um pequeno número de estudos na literatura (25, 26, 41, 57, 61). O desconhecimento do comportamento dos marcadores do sistema hemostático em mulheres com SOP impede que se atue na prevenção de fenômenos tromboembólicos, o que poderia reduzir a incidência de doença coronariana e da morbidade relacionada a eventos da coagulação neste grupo de mulheres. Sobrepeso e obesidade pertencem ao grupo de doenças crônicas em que há um aumento substancial do risco de incidentes tromboembólicos. Desordens de hemostasia, incluindo a ativação excessiva do sistema de coagulação e/ou a inibição da fibrinólise parecem ter um papel decisivo para o seu desenvolvimento. As alterações na coagulação de pessoas obesas são complexas, incluindo, dentre outras, aumento na concentração e atividade de fatores de coagulação do sangue, hiperfibrinogenemia e hiperatividade das plaquetas. Por outro lado, fibrinólise normal ou deficiente também ocorre em pessoas obesas (62).
Estudos recentes utilizando análise de aleatorização mendeliana forneceram evidências para uma relação causal entre IMC elevado e risco de TEV (63, 64). Mulheres com SOP apresentam geralmente mais sobrepeso ou obesidade quando comparadas à mulheres sem o diagnóstico de SOP, e a incidência e gravidade dessa síndrome aumenta com a elevação do peso corporal (65). A obesidade exacerba tanto a RI quanto o hiperandrogenismo. Embora alguns estudos tenham evidenciado níveis de insulina anormais e RI somente em mulheres com SOP obesas (66), a maioria tem demonstrado perfis metabólicos anormais também em mulheres magras (67, 68). Dois terços das mulheres com SOP não obesas possuem gordura corporal excessiva e adiposidade central, induzindo elevação da RI (69).
Em nosso estudo de 2013, concluímos que a geração de trombina é mais rápida em mulheres jovens com SOP, quando comparadas a mulheres jovens com mesmo IMC, mas sem SOP, sugerindo um aumento no risco de hipercoagulabilidade (70). Além desse trabalho, existem outros poucos na literatura, mas o desconhecimento é grande quanto à influência da composição corporal ou da centralização de gordura nos marcadores hemostáticos em mulheres com SOP.
A distribuição de gordura corporal é avaliada clinicamente por meio das medidas da cintura e do quadril. Também se valoriza a relação cintura-quadril, obtida a partir da relação entre as medidas da circunferência da cintura abdominal e a circunferência do quadril resultando em duas categorias: normal (<0,8) e obesidade androide ou central (≥ 0,8) (19).
Mais recentemente, métodos de maior acurácia foram introduzidos para mensurar a composição corporal: a ressonância nuclear magnética (RNM) e a técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (Dual-energy X-ray absorptiometry – DXA). Em 2016, Neeland e colaboradores (71) compararam a RNM e DXA para avaliação da medida da massa de gordura visceral em uma coorte multiétnica de 2693 sujeitos de ambos os sexos (“the Dallas Heart Study”) e concluíram que a quantificação dessa gordura pela técnica de DXA foi acurada e válida. Afirmaram também que, devido ao fato da RNM não ser um método tão disponível na prática clínica, a DXA aparece para contornar as limitações da RNM (71), com baixa exposição à radiação, rápida e de fácil aplicabilidade (72).
Assim, a técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) com exposição a dois diferentes níveis de energia, 70 e 140 kilovolts, trata-se de um método de grande acurácia, com boa precisão e reprodutibilidade para avaliar a composição corporal (73). Baseia-se na atenuação de raios em diferentes níveis de energia e permite realizar a mensuração corporal total e por segmentos. O princípio básico é a utilização de uma fonte de raios X com um filtro que converte um feixe de raios X em picos fotoelétricos de baixa e alta energia que atravessam o corpo de indivíduo. A obtenção dos compartimentos corporais é feita pela medida e atenuação desses picos fotoelétricos. Os fótons de raios X emitidos passam pelos segmentos corpóreos e são analisados por meio de um software que emprega um algoritmo para dividir as medidas do corpo em áreas correspondentes a cabeça, tronco, braços e pernas (73).
Na literatura, localizamos apenas três estudos que utilizaram a técnica de DXA para estudar a associação entre hemostasia e composição corporal em mulheres com SOP (74-76). Dois deles estudaram a relação com o PAI-1 (74, 76) e o terceiro, a relação da composição corporal com o ETP (75). González e colaboradores mostraram que dentre as mulheres com SOP, as obesas apresentaram níveis de PAI-1 mais elevados e uma forte correlação positiva entre gordura androide e PAI-1 comparado aos controles pareados por IMC (74). Em concordância, Aziz e associados demonstraram que mulheres com SOP, com sobrepeso ou obesas, portadoras de RI, apresentaram níveis de PAI-1 mais elevados e observaram que RI, IMC e obesidade estavam associados como marcadores de risco para DCV em mulheres com SOP (76). Em outro estudo, em 2015, Aziz e colaboradores concluíram que mulheres com SOP, obesas e com RI apresentaram níveis de ETP mais elevados, correspondendo a aumento do risco de DCV (75). Achado semelhante já havíamos demonstrado em nosso estudo de 2013, onde mulheres jovens e com sobrepeso
portadoras de SOP apresentaram geração de trombina mais rapidamente, sugerindo um aumento do risco de hipercoagulabilidade (70).
Embora muitos avanços tenham ocorrido com relação ao diagnóstico, tratamento, e prevenção de TEV algumas perguntas permanecem sem resposta, especialmente aquelas relacionadas à patogênese e a fatores de risco (77). Tal preocupação é particularmente importante em populações predispostas a apresentar fatores de risco, como são as mulheres com SOP. Assim, este estudo se propôs a avaliar a relação entre a distribuição de gordura e alguns parâmetros hemostáticos em mulheres com SOP, avaliando esta distribuição através de medidas clínicas, como habitualmente é feito, e utilizando a avaliação da composição corporal por densitometria. A identificação de fatores predisponentes ao TEV e a outras doenças cardiovasculares na SOP é aconselhável porque poderia direcionar estratégias terapêuticas, reduzindo morbidades e os altos custos destinados ao seu tratamento.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar alguns marcadores do sistema hemostático e sua associação com parâmetros clínicos e densitométricos de distribuição de gordura em mulheres com SOP.
2.2. Objetivos Específicos
Correlacionar os marcadores de fibrinólise (TAFI, D-dímero e PAI-1) com parâmetros clínicos de distribuição de gordura de mulheres com SOP comparativamente a mulheres de mesma idade e IMC e sem diagnóstico de SOP.
Correlacionar o teste de geração de trombina com parâmetros clínicos de distribuição de gordura de mulheres com SOP comparativamente a mulheres de mesma idade e IMC e sem diagnóstico de SOP.
Correlacionar os marcadores de fibrinólise (TAFI, D-dímero e PAI-1) com parâmetros densitométricos de composição corporal e distribuição de gordura de mulheres com SOP.
Correlacionar o teste de geração de trombina com parâmetros densitométricos de composição corporal e distribuição de gordura de mulheres com SOP.3. METODOLOGIA
3.1. Desenho
Estudo de corte transversal.
3.2. Tamanho amostral
O tamanho da amostra foi baseado na diferença entre as médias de TAFI, D-dímero e PAI-1, entre mulheres com SOP e mulheres com função gonadal normal, usando por base estudo de Oral e colaboradores, de 2009 (78).
Baseado nas diferenças apresentadas na tabela 1, em um nível de significância de 5%, um poder do teste de 80% e no teste T de Student pareado (79, 80), o tamanho de amostra necessário para encontrar diferença significativa para as três medidas foi de n = 45 em cada grupo. Por não haver dados disponíveis para o cálculo do ETP, considerou-se o tamanho da amostra calculado em n = 45 em cada grupo, com número total de sujeitos de 90 para a realização do estudo.
Tabela 1. Tamanho da amostra por variável
Medida SOP
(média ±DP)
Controle
(média ±DP) Tamanho da amostra
TAFI (%) 93.8 ± 30.6 79.8 ± 22.4 40
D-dímero (ng/ml) 280.6 ± 64.9 227.6 ± 73.9 21
PAI-1 (ng/ml) 70.3 ± 59.1 45.6 ± 36.9 45
Fonte: Oral B, Mermi B, Dilek M, Alanoğlu G, Sütçü R. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and other hemostatic parameters in patients with polycystic ovary syndrome. Gynecol Endocrinol. 2009 Feb;25(2):110-6 (78).
3.3. Variáveis
3.3.1. Variáveis independentes
Foram consideradas como variáveis independentes a distribuição de gordura corporal, avaliada através de parâmetros clínicos (medida da cintura, medida do quadril e relação cintura/quadril) e densitométricos pela técnica de DXA (massa total, massa gorda, massa magra, percentual de gordura corporal, percentual de gordura androide, percentual de gordura ginoide e relação androide/ginoide), sendo descritas como:
→ Parâmetros Clínicos:
Medida da cintura: medida da circunferência da cintura abdominal ao nível da cicatriz umbilical, utilizando-se fita métrica decimal e inextensível de 150 cm de
comprimento, com precisão de uma casa decimal, com o sujeito em posição ortostática, usando apenas roupa íntima, estando o abdômen relaxado, braços ao lado do corpo e os pés unidos. A fita circundou o local a ser medido com firmeza, sem compressão de tecido subcutâneo e a leitura foi feita no centímetro mais próximo, no ponto de cruzamento da fita: expressa em centímetros (cm).
Medida do quadril: medida da circunferência do quadril, ao nível das cristas ilíacas, utilizando-se fita métrica decimal e inextensível de 150 cm de
comprimento, com precisão de uma casa decimal, com o sujeito em posição ortostática, usando apenas roupa íntima, estando o abdômen relaxado, braços ao lado do corpo e os pés unidos. A fita circundou o local a ser medido com firmeza, sem compressão de tecido subcutâneo e a leitura foi feita no centímetro mais próximo, no ponto de cruzamento da fita: expressa em centímetros (cm).
Relação cintura-quadril: relação entre as medidas obtidas para a circunferência da cintura e a circunferência do quadril (ambas expressas em centímetros): avaliada como variável contínua e categorizada em normal (<0,8) e obesidade androide ou central (≥ 0,8) (19).
→ Parâmetros Densitométricos de composição corporal e distribuição de gordura [avaliados pela técnica de Dual-energy X-ray absorptiometry (DXA)]
Massa total: medida obtida diretamente pelo software após passagem dos fótons de raios X pelos segmentos corpóreos: expressa em quilogramas (Kg). Também denominada massa corporal total.
Massa gorda: medida obtida diretamente pelo software após passagem dos fótons de raios X pelos segmentos corpóreos: expressa em quilogramas (Kg).
Massa magra: medida obtida diretamente pelo software após passagem dos fótons de raios X pelos segmentos corpóreos: expressa em quilogramas (Kg).
Percentual de gordura corporal: medida definida como (massa gorda x 100%)/ (massa total) obtida diretamente pelo software após passagem dos fótons de raios X pelos segmentos corpóreos: expressa em percentagem (%).
Percentual de gordura androide: medida definida pelo software fornecido pelo fabricante. A região androide teve como limite inferior a linha da pelve, os limites
laterais foram as linhas dos braços, e o limite superior 20% da distância entre a pelve e a linha do pescoço: expressa em percentagem (%).
Percentual de gordura ginoide: medida definida pelo software fornecido pelo fabricante. A região ginoide teve o limite superior abaixo da linha da pelve 1,5 vezes a altura da região androide. A altura da região ginoide foi igual a 2 vezes a altura da região androide e os limites laterais foram os cortes exteriores das pernas: expressa em percentagem (%).
Relação androide/ginoide: relação entre as medidas obtidas para o percentual de gordura androide (central) e o percentual de gordura ginoide (ambas expressas em milímetros).
Figura 4. Técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) mostrando as regiões especiais de
correspondente interesse com a massa de gordura: distribuição de gordura androide e ginoide.
3.3.2. Variáveis dependentes
Foram consideradas como variáveis dependentes os parâmetros de fibrinólise (TAFI, D-dímero e PAI-1) e o teste de geração de trombina (TGT), assim descritos:
TAFI: dosagem sérica do inibidor da fibrinólise ativado pela trombina, após 12 h de jejum, medido pelo método cromogênico, utilizando-se o Actichrome® TAFI
Activity kit (American Diagnostica, Stamford, CT, USA) e expressa em μg/ml.
Ginoide Androide
20% da distância da pelve para o queixo
D-dímero: dosagem sérica do D-dímero, produto da degradação da fibrina, após 12h de jejum, medido por análise imunoturbidimétrica, utilizando-se o INNOVANCE® D-Dimer kit (Dade-Behring, Newark, DE, USA) e expressa em mg/L.
PAI-1: dosagem sérica do inibidor do ativador do plasminogênio do tipo 1, após 12h de jejum, medido pelo método cromogênico utilizando o kit Berichrom PAI® (Dade-Behring, Newark, DE, USA) e expressa em U/ml.
ETP: teste de geração de trombina, realizado após 12h de jejum, medido pelo método cromogênico, utilizando-se o Endogenous Thrombin Potential® Assay (Dade-Behring, Newark, DE, USA) e expresso em nmol/min.
3.3.3. Variáveis de controle
Idade: número de anos completos até a data da entrevista, segundo referido pelo sujeito.
Índice de massa corporal (IMC): critério de avaliação do grau de obesidade de um indivíduo, calculado pelo pesquisador – peso, em quilogramas, mensurado em uma balança Filizola, dividido pelo quadrado da altura, em metros, expresso em Kg/m2 e categorizado em IMC (19): < 18,5 Kg/m2- Baixo peso
18,5 Kg/m2 a 24,9 Kg/m2 - Normal 25 Kg/m2 a 29,9 Kg/m2 - Sobrepeso ≥ 30 Kg/m2 - Obesidade
Índice de Ferriman-Gallwey: sistema utilizado para avaliação do grau de hirsutismo avaliando 9 regiões do corpo. São cinco categorias graduadas de 0 a 4, numa escala ordinal. O índice final é calculado com a soma dos escores parciais em cada região analisada: escores ≥ 8 indicam hirsutismo (81).
Glicemia de jejum: dosagem sérica da glicemia após 12h de jejum, medida pelo método enzimático colorimétrico utilizando-se o kit ROCHE Glucose GOD-PAP, Indianópolis, USA e expressa em mg/dl.
Insulina: dosagem sérica da insulina após 12h de jejum, medida pelo método imunométrico em fase sólida quimioluminescente de duas voltas utilizando-se o kit LIN1 e LIN2 e expressa em μUI/ml.
HOMA-IR: medida da resistência insulínica, calculado pela multiplicação dos índices de glicemia em jejum (mg/dl) e insulina em jejum (μUI/ml), sendo o
resultado dividido por 405: categorizado em positivo se ≥ 2,7 e negativo se < 2,7 (82, 83).
Testosterona total: dosagem sérica de testosterona total após 12 h de jejum, medida pelo método de eletroquimioluminescência, utilizando-se o sistema COBAS E-411 da ROCHE e expressa em ng/ml.
Testosterona livre: dosagem sérica de testosterona livre após 12 h de jejum, medida pelo método de radioimunoensaio, utilizando-se o sistema Automatic Gamma Counter, USA e expressa em pg/ml.
3.4. Seleção dos sujeitos
→ Grupo de mulheres com SOP (estudo):
Foram avaliadas 45 mulheres com diagnóstico de SOP segundo os critérios de Roterdã, 2003 (6) atendidas e acompanhadas no Ambulatório de Ginecologia Endócrina do Departamento de Tocoginecologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, que preencheram os critérios de inclusão e exclusão.
→ Grupo de mulheres com função gonadal normal (controle):
Foram avaliadas 45 mulheres atendidas e acompanhadas no Ambulatório de Planejamento Familiar do Departamento de Tocoginecologia da mesma Instituição, que preencheram os critérios de inclusão e exclusão. Estas foram pareadas uma a uma às mulheres do grupo SOP por idade em anos completos (± 2 anos) e por IMC (±2Kg/m²). Todas apresentavam ciclos menstruais regulares (24-35 dias) e não estavam utilizando, há pelo menos 3 meses, método contraceptivo hormonal ou qualquer medicação que pudesse alterar o ciclo menstrual. Nenhuma dessas mulheres tinha hirsutismo clínico (avaliado pelo índice de Ferriman-Gallwey) (81) ou alteração dos níveis séricos de testosterona total e livre. Também foram submetidas à ecografia transvaginal sem evidências de ovários policísticos.
3.4.1. Critérios de inclusão
3.4.1.1. Grupo de mulheres com SOP
Idade entre 18 e 35 anos;
Diagnóstico de SOP segundo critérios de Roterdã (2003) (6);
Não utilização de método contraceptivo hormonal há pelo menos 3 meses.
3.4.1.2. Grupo de mulheres com função gonadal normal
Ter ciclos menstruais regulares (entre 24 e 35 dias);
Ser pareada a uma mulher do grupo de estudo (SOP) pela idade (± 2 anos) e IMC (± 2 Kg/m²);
Não utilização de método contraceptivo hormonal há pelo menos 3 meses.
3.4.2. Critérios de exclusão para o grupo de mulheres com SOP e para o grupo de mulheres com função gonadal normal
Estar grávida;
Ser portadora de doenças crônicas como hipotireoidismo, insuficiência renal, insuficiência hepática, antecedente de neoplasia ou de doença tromboembólica.
Fazer uso de medicamentos que possam interferir com a coagulação ou fibrinólise, tais como aspirina, heparina, anticoagulantes, agentes antiplaquetários, hormônios.
3.5. Técnicas, Testes e Exames
3.5.1. Exames laboratoriais
→ Coleta de sangue
Foi realizada a coleta de sangue venoso entre 07:30 e 10:00h (para evitar o efeito da variação diária do sistema hemostático), após pelo menos 12h de jejum, a partir da veia antecubital do braço esquerdo, com mínima ou sem oclusão venosa (oclusão venosa prolongada pode estimular a produção de PAI-1 pelas células endoteliais e alterar os resultados de outros marcadores de hemostasia). A coleta de sangue foi realizada entre
o 3º e 9º dias do ciclo menstrual, ou mais que 60 dias após o último período menstrual para mulheres com SOP e ciclos irregulares.
Foram coletados 14 ml de sangue periférico em citrato de sódio 3,8%, na proporção 9:1 para dosagem dos marcadores de hemostasia. Imediatamente após a coleta, as amostras foram colocadas em uma caixa de isopor com gelo e transportadas até o Hemocentro em até 1h para seu processamento e centrifugação adequada. Em seguida, o sangue foi rapidamente centrifugado a 3500 rpm durante 15 minutos, e o plasma foi dividido em alíquotas de 400µL e armazenado em freezer a -80oC, para realização dos ensaios posteriormente.
Também foram coletados 14 ml de sangue periférico para dosagem bioquímica e hormonal, sendo 4 ml coletados em tubo de citrato de sódio com fluoreto para dosagem da glicemia de jejum e 10 ml coletados em tubo seco, sem EDTA, para dosagem de insulina, testosterona total e testosterona livre.
→ Determinação das concentrações plasmáticas
Para realização das análises laboratoriais as amostras dos marcadores de hemostasia foram descongeladas rapidamente a 37oC em banho-maria. A fim de
minimizar a interferência das variações interensaios na comparação dos resultados, as amostras dos controles e sujeitos foram analisadas concomitantemente.
Dosagem do TAFI
Para avaliar a atividade do TAFI no plasma foi empregado o método cromogênico, utilizando-se o kit Actichrome® TAFI Activity (American Diagnostica, Stamford, CT, USA).
A titulação deste teste foi feita em microplaca. As colunas 1 e 2 da placa foram reservadas para a posterior curva de calibração. Após distribuir 90µL de tampão em metade da placa adicionou-se o plasma diluído 1:25 e foram acrescentados 10µL do TAFI activation enhancer e 15µL do reagente de ativação. Na outra metade da placa foram adicionados 115µL do tampão e 25µL do plasma diluído 1:25 sem os reagentes de ativação, e dessa forma, metade foi usada para controle do plasma inativo. A placa foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador de placas.
Decorrido este tempo, foram adicionados 50µL do TAFI padrão e 250µL do tampão nos poços A1 e A2 e, a partir destes, foram feitas diluições seriadas até os poços E1/E2, removendo de cada poço 150µL e passando para o próximo, sendo que nos poços
E1/E2 foram descartados 150µL, de forma que as concentrações fossem 2, 1, 0,5, 0,25 e 0,125µg/ml. Os poços F1/F2 foram usados para o branco, com 150µL de tampão.
Foram adicionados 50µL do TAFI developer em toda placa e, em seguida, incubada por 30 minutos a 37oC. Após este período, a reação foi paralisada pela adição de 10µL de ácido sulfúrico. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro, em até uma hora, em comprimento de onda de 490nm.
Para determinar a atividade do TAFI nas amostras foi utilizado o seguinte cálculo:
∆Abs490nm (TAFI) = ∆Abs490nm (plasma ativado) - ∆Abs490 nm (plasma inativado)
Posteriormente, os resultados foram interpolados no gráfico e multiplicados pelo fator de diluição.
A atividade do TAFI no plasma estabelecida pelo fabricante é de aproximadamente 12-20µg/ml. O valor de referência do Laboratório de Hemostasia do Hemocentro da UNICAMP foi estabelecido por sua determinação nas amostras controles. Os resultados foram expressos em µg/ml.
Dosagem do D-dímero
A dosagem do D-dímero foi feita pelo método imunoturbidimétrico, utilizando-se o kit INNOVANCE® D-Dimer (Dade-Behring, Newark, DE, USA).
O método baseia-se na agregação de partículas de polistireno covalente revestidas com um anticorpo monoclonal quando misturadas com amostras contendo D-dímero. A região de ligações transversais de D-dímeros possui uma estrutura estereossimétrica, isto é, o determinante antigênico para o anticorpo monoclonal ocorrer duas vezes. Consequentemente, basta um anticorpo para desencadear uma reação de agregação que é depois detectada turbidimetricamente através do aumento na turvação.
O aparelho utilizado para esta dosagem foi o BCS-XP (Siemens). A partir de 9µL de amostra de plasma, foram adicionados 9µL do diluente de D-dímero. Esta mistura foi incubada durante 3 minutos a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 72µL de solução tampão e 27µL de um reagente suplementar. Posteriormente, adicionou-se 72µL do reagente do D-dímero e a leitura realizada em mA/min. Esta reação foi igual tanto para o grupo controle como para as amostras. Os resultados foram expressos em mg/L.
Dosagem do PAI-1
A atividade do PAI-1 no plasma foi determinada pelo método cromogênico utilizando-se o kit Berichrom PAI® (Dade-Behring, Newark, DE, USA).
O método baseia-se na inativação da uroquinase do reagente pela adição do PAI da amostra, restando uma uroquinase residual que é determinada através da transformação do plasminogênio em plasmina. A plasmina resultante é medida a 405 nm, mediante desdobramento de um substrato cromogênico (plasminogenólise reforçada).
O aparelho utilizado para esta dosagem foi o BCS-XP (Siemens). A partir de 50µL da amostra de plasma, foram adicionados 100µL do reagente uroquinase. Essa mistura foi incubada durante 5 minutos a 37oC. Em seguida adicionou-se 200µL do reagente plasminogênio e 200µL de um oxidante. Novamente, esta mistura foi incubada por mais 5 minutos a 37oC. Posteriormente, foram adicionados 500µL do substrato de plasminogênio e a leitura realizada em 60 segundos.
O valor de referência para o teste de acordo com o fabricante foi de 0,3 – 3,5 U/ml. Os resultados foram expressos em U/ml.
Determinação da geração de trombina
Para determinar a geração de trombina foi empregado o teste de geração de trombina ou endogenous thrombin potential (ETP) onde a conversão cinética de um substrato sintético de trombina foi medido pela liberação de um cromóforo na amostra de plasma em um comprimento de onda de 405 nm. A formação de trombina foi iniciada pela adição do reagente Dade Innovin® e cloreto de cálcio. A curva de formação de trombina foi obtida por derivação matemática da medida da cinética de formação cuja integral (descrita como a “área abaixo da curva”) corresponde ao ETP. Adicionalmente, para ser quebrado pela trombina, o substrato foi também dividido resultando no complexo trombina-α2-macroglobulina.
Para determinar o ETP ou potencial endógeno de trombina, o substrato clivado pelo complexo trombina-α2-macroglobulina foi calculado baseado na conversão total e depois subtraído. Os cálculos necessários foram completados automaticamente pelo BCS® System com o software de análise de ETP disponível.
O ensaio foi medido por um período de 20 minutos pelo BCS® System. As dosagens de ETP foram realizadas por lotes. Vinte dosagens de ETP foram processadas simultaneamente em uma centrífuga de cubetas.
A técnica de dosagem do ETP iniciou-se a partir de 40µL de solução tampão que foram adicionadas a 40µL de reagente. Em seguida foram acrescentados 15µL de cloreto de cálcio e 30µL do reagente adicional Dade Innovin®.
Os resultados foram expressos em nmol/min.
Glicemia de jejum
A determinação da dosagem sérica de glicemia foi realizada após coleta de sangue em tubo de 4 ml de citrato de sódio com fluoreto, por meio do método enzimático colorimétrico utilizando-se o kit ROCHE Glucose GOD-PAP, Indianópolis, USA.
O sistema utilizado para aferição foi o MODULAR ACN 249. O intervalo de medição foi de 0,11-25 mmol/L (2-450 mg/dl). Coeficiente de variação interensaio foi de 1,8% e intraensaio de 0,9%. Os resultados foram expressos em mg/dl.
Insulina
Para determinar a dosagem sérica de insulina após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, foi utilizado o método imunométrico em fase sólida quimioluminescente de duas voltas utilizando-se os kits LIN1 e LIN2.
O sistema utilizado para aferição foi o IMMULITE/IMMULITE 1000, SIEMENS, Los Angeles, USA. O intervalo de medição teve como mediana 8,9 mUI/ml e uma faixa de referência de 95% mais baixa até 28,4 mUI/ml. Coeficiente de variação interensaio foi de 6,4% e intraensaio de 0,9%.
Os resultados foram expressos em µUI/ml.
Testosterona total
A dosagem sérica de testosterona total foi realizada após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, por meio do método de eletroquimioluminescência. O sistema utilizado para aferição foi o COBAS E-411 da ROCHE.
Os resultados foram expressos em ng/ml.
Testosterona livre
A dosagem sérica de testosterona livre foi realizada após coleta de sangue em tubo seco sem EDTA, por meio do método de radioimunoensaio de fase sólida. O sistema utilizado foi o contador GAMA (1470 Automatic Gamma Counter, USA).
3.5.2 Técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA)
A composição corporal foi avaliada por absorciometria de corpo inteiro usando-se o modelo GE Lunar DPX-NT, Lunar, Madison, WI, USA (Figura 5). Este exame foi realizado procedendo à varredura total do corpo do paciente, por meio da técnica de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) com exposição a dois diferentes níveis de energia, 70 e 140 kilovolts (73), seguindo as recomendações da Sociedade Internacional de Densitometria Clínica (International Society for Clinical Densitometry – ISCD) (84). Trata-se de um método de grande acurácia, com boa precisão e reprodutibilidade para avaliar a composição corporal. A técnica baseia-se na atenuação de raios em diferentes níveis de energia e permite realizar a mensuração corporal total e por segmentos. O princípio básico é a utilização de uma fonte de raios X com um filtro que converte um feixe de raios X em picos fotoelétricos de baixa e alta energia que atravessam o corpo de indivíduo. A obtenção dos compartimentos corporais é feita pela medida e atenuação desses picos fotoelétricos. Os fótons de raios X emitidos passaram pelos segmentos corpóreos e foram analisados por meio do software enCORE version 13.6, que emprega um algoritmo para dividir as medidas do corpo em áreas correspondentes a cabeça, tronco, braços e pernas (73).
