Experimento I Obtenção de parâmetros de diâmetro uterino e

resposta ovariana após tratamento com CRESTAR® _{em borregas Santa}

Inês pré-púberes com 20 a 24 semanas de idade

Este experimento foi realizado para a obtenção de parâmetros de diâmetro uterino e resposta ovariana ao tratamento com progestágeno em borregas Santa Inês pré-púberes de 20 a 24 semanas de idade, independentemente do genótipo, quanto à presença do gene FecGE.

Como Etapa I, foram utilizadas 18 borregas da raça Santa Inês pré- púberes com idade entre 20-24 semanas e peso mínimo equivalente a 60% do peso em adulto e escore de condição corporal •2,5 adquiridas em propriedades da região de Botucatu. A saúde dos animais foi controlada com a realização de exames físicos e de OPG além de vacinações e vermifugações previamente e durante o experimento. Houve a preocupação de se utilizar animais com desenvolvimento corporal e peso homogêneos, e idades próximas.

As borregas foram submetidas a colheitas de sangue pela venopunção jugular, em tubos a vácuo e heparinizados, mantidos sob refrigeração até o momento de centrifugação a 1200.g/10 minutos com separação do sobrenadante. O plasma assim obtido foi mantido sob congelação a 30ºC negativos até o momento da quantificação hormonal de progesterona (P4).

Após um período de adaptação, de 30 dias, à alimentação e instalações as borregas foram subdivididas randomicamente em três grupos experimentais previstos, os quais foram submetidos aos tratamentos como se segue:

- Grupo 1 (n=6): submetidas por uma vez à estímulo com 1,5 mg norgestomet

(½ implante subcutâneo Crestar®_{) por 12 dias (Fig.1).}

- Grupo 2 (n=6): submetidas a dois períodos de 12 dias (separados por 5 dias)

à estímulo com 1,5 mg norgestomet (½ implante subcutâneo Crestar®) (Fig.1). - Grupo Controle (n=6): serviram como controle e permaneceram em

isolamento social em relação às fêmeas dos Grupos 1 e 2 e sem receber o tratamento hormonal de progestágeno (Fig.1).

O período experimental compreendeu 3 momentos:

- M0 (momento 0): nos animais dos três grupos, duas coletas de sangue

pareadas em sete dias para quantificação de progesterona, pesagem, determinação do ECC, biometria corporal, um exame ultrassonográfico e um exame laparoscópico antes do estímulo com progestágeno (Crestar®)

- M1 (momento 1): após o primeiro período de estímulo com progestágeno

(Grupos 1 e 2), foram realizadas nos animais dos três grupos por cinco dias consecutivos, coletas de sangue para quantificação de progesterona e exames seriados de ultrassom (US) a cada 24 horas, pela manhã, seguidos no último dia por um exame laparoscópico.

- M2 (momento 2): após o segundo período de estímulo com progestágeno

(Grupos 2), foram realizadas nos animais dos três grupos por cinco dias consecutivos, coletas de sangue para quantificação de progesterona, pesagens, determinações do ECC, biometrias corporal e exames seriados de US a cada 24 horas, pela manhã, seguidos no último dia por um exame laparoscópico.

Objetivando-se a comparação entre os valores obtidos no ultrassom, a mensuração dos diâmetros dos cornos uterinos e comprimento dos ovários foi realizada também na laparoscopia. Como referencial para as mensurações das estruturas genitais, utilizou-se escala milimétrica (Fig. 2), adaptada ao interior de uma bainha descartável de inseminação de bovinos (IMV®_{). O aplicador}

universal de sêmen (IMV®_{), com a bainha adaptada era introduzido ao abdome}

em acesso laparoscópico. Com o auxílio de bastão de manipulação laparoscópico (Laparoscopy Palpation Probe Storz®_{- ref. 26175T) e pinça de}

preensão (Storz®_{, ref. 25216) o útero e ovário eram posicionados e então}

* coleta de material para posterior dosagem de progesterona plasmática

FIGURA 1- Fluxograma

FIGURA 2- Escala milimétrica adaptada ao interior de

uma bainha e aplicador universal de inseminação artificial de bovinos (IMV®).

4.2 Experimento II - MOET de animais portadores do gene FecGE e

acompanhamento do desenvolvimento corporal das borregas obtidas. 4.2.1 MOET

A MOET (múltipla ovulação e transferência de embriões) foi realizada em animais Santa Inês cedidos temporariamente, oriundos da Universidade Estadual de Maringá, 11 ovelhas já genotipadas para o gene FecGE, sendo 10 heterozigotas e 1 homozigota, além de um carneiro heterozigoto.

No "Laboratório de estudos em biotecnologia aplicada à reprodução de ovinos e caprinos'' da FMVZ UNESP Botucatu, os animais (11 fêmeas e 01 macho FecGE+ e 03 fêmeas FecGE-) permaneceram em período de adaptação.

Como controle sanitário, no “Laboratório” foram realizados exames clínicos rigorosos, exames parasitológicos com contagem de ovos por grama de fezes (OPG) seguido de desverminação (Ripercol®) e vacinação contra

Laparoscopia Laparoscopia Laparoscopia

Grupo 1

Grupo 2

Grupo Controle

clostridiose (Sintoxan®_{). Estimou-se a idade dos animais pela análise da}

dentição e foi realizada a pesagem.

Como controle reprodutivo, as ovelhas foram submetidas a exame ginecológico e realização de exame ultrassonográfico transretal para avaliação das condições uterinas e ovarianas. Neste exame constatou-se ausência de gestação e normalidade de útero e ovários das ovelhas.

O reprodutor foi submetido à exame andrológico, com constatação de sua higidez reprodutiva.

Para otimizar o procedimento os animais foram divididos randomicamente em 2 grupos de doadoras (n=7).

4.2.2 Superestimulação

O protocolo (Fig.3) utilizado para as doadoras (n=14) foi realizado em 22 dias, sendo que no Dia zero (D0) foram desverminadas e introduzidos os dispositivos intravaginais de 0,33 gramas de progesterona (CIDR®) a serem substituídos no D7 juntamente com a aplicação de 0,125 mg de de cloprostenol sódico (0,5 mL) por via intramuscular (Ciosin®). No D12 pela manhã e a tarde foram aplicados 48 mg (2,4 mL) de FSHp (Foltropin®) seguidos por doses decrescentes de 36 (1,8 mL), 24 (1,2 mL) e 20 mg (1,0 mL) desta gonadotrofina pela manhã e tarde dos dias 13 a 15 do protocolo. Na tarde do D14 foi retirado o segundo CIDR® e administradas 200 UI (1,0 mL) de eCG (Gonadotrofina Coriônica Equina - Novormon® ) por via intramuscular. No D15 à tarde as fêmeas foram colocados em jejum para a realização das inseminações artificiais em D16 pela manhã e a tarde.

FIGURA 3- Protocolo para superestimulação, coleta e transferência de

4.2.3 Colheita do sêmen e Inseminação das doadoras

O sêmen do reprodutor FecGE+HE foi colhido pela manhã e pela tarde nos dois dias de inseminação artificial; utilizou-se o sêmen a fresco, diluído em GGL5% (RODELLO et al., 2011) em palhetas de 0,25 mL na concentração de 500x106 _{espermatozóides viáveis por corno uterino em cada inseminação}

artificial (IA) totalizando em cada IA, 1x109 _{espermatozóides viáveis por}

ovelha.

O cio das doadoras e receptoras foi constatado com a utilização de reprodutores impedidos de copularem pelo emprego de dispositivo preso ao abdômen recobrindo o pênis e prepúcio. A cada 6 horas até o término de todos os estros, os reprodutores eram colocados, com as fêmeas em grupos de cinco, permanecendo em observação por 20 minutos. Foi considerada em cio a fêmea que apresentava como sinal a receptividade e imobilidade à tentativa de monta pelo reprodutor.

4.2.4 Colheita dos embriões

No D21 do protocolo de MOET os animais foram colocados em jejum para colheita e transferência de embriões em D22. Foram realizadas as colheitas de embriões de 7 doadoras por dia. Para cada grupo de 7 doadoras havia 20 receptoras com os ciclos sincronizados aos das doadoras. Como sistemática de trabalho optou-se em realizar todos os procedimentos de colheita, seguindo-se concomitantemente à avaliação e classificação dos embriões segundo as técnicas descritas por Baldassarre (2008). A fim de minimizar o período de manutenção extra útero, a inovulação da totalidade dos embriões foi realizada, de maneira randômica quanto ao estádio e classificação, respeitando-se a ordem das colheitas e a identificação das doadoras e receptoras. A duração dos procedimentos foi de sete horas em cada dia.

A técnica de exposição uterina, compreendendo laparoscopia, para a avaliação da resposta ovariana foi seguida de laparotomia minimamente invasiva. Os procedimentos de colheita seguiram as recomendações de descritas por Baldassarre (2008).

Durante os procedimentos de colheita de embriões foram obtidos dados referentes às doadoras quanto ao número e escore qualitativo dos corpos lúteos (OLIVEIRA, 2009), número e classificação de embriões obtidos, relacionando-os à duração do estro.

4.2.5 Sincronização das receptoras e inovulações

Antes dos procedimentos de sincronização do estro estimou-se a idade dos animais pela análise da dentição e aferiu-se o Escore de Condição Corporal (ECC) e o Índice de Massa Corporal (IMC), (BICUDO & SARTORI FILHO, 1995; MONTEIRO et al., 2010) das ovelhas que serviriam como receptoras.

Para as receptoras o protocolo foi realizado em 22 dias, sendo no D0 introduzidos os implantes intravaginais de progesterona (CIDR®), no D14 os dispositivos foram retirados e foi aplicado 2,5 mL de eCG (Novormon®). No D15 e D16 as receptoras em cio (marcadas pelos rufiões) foram separadas para a inovulação dos embriões no D22 (Fig.4).

FIGURA 4- Protocolo para sincronização e inovulações das

receptoras.

Os procedimentos de inovulação dos embriões foram realizados segundo as técnicas descritas por Baldassarre (2008), por meio de laparoscopia.

Após 30 dias da TE foi realizado o primeiro diagnóstico ultrassonográfico de gestação das receptoras, e repetido aos 45 dias após a TE.

Durante o processo de TE foram coletados dados da duração do estro, número e qualidade (escore 1-3) de corpos lúteos sendo escore 3 para um corpo lúteo com ótimo aspecto macroscópico de coloração (avermelhada, indicando vascularização) e tamanho, 2 para um corpo lúteo de bom aspecto (coloração ainda avermelhada) e escore 1 para aqueles que apresentavam

D0 D7 D10 D12 D14 D16 Colocação CIDR® Retirar CIDR® Novormon N D 15 e D 16 Receptoras em cio D22 TE

coloração amarelada, pálida e tamanho reduzido, sinalizando uma possível regressão da estrutura, nas receptoras e duração do estro, número e qualidade de corpos lúteos (escore 1-3) nas doadoras, número, estádio e qualidade de embriões, prenhez por doadora e por receptora.

Foi realizado o acompanhamento da condição corporal das receptoras com confirmação de prenhez e avaliação do número de fetos.

4.2.6 Monitoramento da gestação e parto das receptoras e do crescimento das borregas

As receptoras prenhes com embriões provenientes da MOET das ovelhas e carneiros FecGE+ foram acompanhadas até o parto.

Aos 60 e 120 dias de gestação foi realizada a biometria corporal para cálculo do IMC.

Cerca de 30 dias antes da data prevista de início dos nascimentos foi adquirido 15 litros de colostro bovino visando a formação de um ''banco de colostro'' para ser fornecido a cordeiros que por algum motivo não realizassem espontaneamente a ingestão na mama da receptora.

As cordeiras nascidas, em janeiro de 2012, foram genotipadas e acompanhadas mensalmente com IMC até as 20 semanas de idade.

Todos os partos foram assistidos através do revezamento da equipe do Laboratório que permaneceu no laboratório 24 horas por dia até o fim dos nascimentos, o que ocorreu em 12 dias.

O sistema de creep-feeding com ração peletizada, com 18% de proteína, foi instalado a partir da segunda semana de vida dos cordeiros.

A partir de 62 dias de idade iniciou-se o processo de desmama, separando-se os cordeiros das mães durante o dia e unindo-os durante a noite por duas semanas, seguindo-se a desmama total. Após a desmama total foi realizado jejum alimentar de 48 horas nas receptoras visando a brusca diminuição na produção de leite.

As cordeiras permaneceram no laboratório e foram vacinadas, desverminadas e acompanhadas em relação a seu crescimento até as 20 semanas de idade.

4.3 Experimento III - Efeitos do estímulo com progesterona exógena sobre