CARACTERIZAÇÃO DO CRESCIMENTO FOLICULAR,
OVULAÇÃO E ATIVIDADE LÚTEA APÓS TRATAMENTO
COM PROGESTÁGENOS DE BORREGAS
PRÉ-PÚBERES SANTA INÊS PORTADORAS DO GENE FecG
E.
Claudia Dias Monteiro Toma
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO DO CRESCIMENTO FOLICULAR,
OVULAÇÃO E ATIVIDADE LÚTEA APÓS TRATAMENTO
COM PROGESTÁGENOS DE BORREGAS
PRÉ-PÚBERES SANTA INÊS PORTADORAS DO GENE FecG
E.
Claudia Dias Monteiro Toma
Orientador: Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo
BOTUCATU – SP
2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Toma, Claudia Dias Monteiro.
Caracterização do crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com progestágenos de borregas pré-púberes Santa Inês portadoras do gene FecGE / Claudia Dias Monteiro Toma. – Botucatu : [s.n.], 2012
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu
Orientador: Sony Dimas Bicudo Capes: 50504002
1. Ovino - Reprodução. 2. Puberdade. 3. Santa Inês (Raça de ovino). 4. Reprodução animal. 5. Ovulação.
Nome do autor: Claudia Dias Monteiro Toma
Título: Caracterização do crescimento folicular, ovulação e atividade
lútea após tratamento com progestágenos de borregas pré-púberes
Santa Inês portadoras do gene FecG
E.
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo
Presidente e Orientador
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ Unesp Botucatu
Prof. Dra. Eunice Oba
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ Unesp Botucatu
Prof. Dra. Maria Denise Lopes
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ Unesp Botucatu
Prof. Dr.
Daniel Bartoli Sousa
Departamento de Reprodução Animal
Universidade Federal de Goiás - Jataí
Prof. Dra. Claudia Fernades Barbosa
Departamento de Reprodução Animal
FMVZ USP São Paulo
Epígrafe
‘’Existem apenas duas maneiras de ver a vida. Uma é pensar que não existem milagres, a outra é pensar que tudo é um milagre. ’’
Dedicatória
Aos meus amados, José Roberto e Angelina meus pais, Eduardo e Fábio meus
irmãos, razões de minha vida e luta.
Aos primos, afilhada Gabrielle, sobrinho Pedro otávio, cunhadas, tios e avós, em
especial ao José, meu ídolo, meu orgulho!
Aos amigos e padrinhos Carolina e Marcel.
Aos animais, motivo principal de minha felicidade.
Ao Pufi e Bud.
Ao Toddy, meu melhor amigo.
Agradecimentos
Ao Professor Sony pela orientação, ajuda na execução do experimento,
paciência e principalmente amizade ao longo de todos estes anos.
À Professora Eunice Oba pela disponibilidade do laboratório para
dosagem hormonal e pela amizade.
Aos professores Papa, João, Meira, Marco, Fernanda, Nereu e Denise,
funcionários Valter, Edílson, Cristina e Raquel, e colegas de pós-graduação do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária.
À seção de pós-graduação da FMVZ Unesp-Botucatu, em especial ao Zé
Lalla.
Aos colegas de laboratório, Renan Denadai, Hyago Ramalho, Tácia
Bergstein, Filipe Macedo e Letícia Crocomo.
A todos os estagiários que passaram pelo laboratório durante meu
experimento.
À FAPESP pela bolsa e pelo apoio financeiro (2009/15270-8 e
2009/18419-2).
Aos amigos Marcel Farrás, pela amizade e paciência, Carol Otoni, Bruno
Avanzi, Renata Ramos, grandes colegas e amigos, Eduardo Fioratti, Ana Izabel,
Rodrigo, Carlos Renato, Heverton, Ana Augusta, Sabrina Sakashita, Rosiára
Maziero, Priscila, Danilo Otávio, Bianca Santarosa, Carmo entre outros que me
ajudaram de alguma forma durante o doutorado.
À Faculdade Estadual de Maringá, principalmente aos professores
necessário, com os animais experimentais, em especial à Clínica de Grandes
Animais e à residente e amiga Bianca.
Ao colega, confidente, companheiro de viagem e experimento, amigo,
Leandro Rodello, sem sua ajuda esta tese não seria possível; a você meu eterno
agradecimento.
Ao Bud pela inspiração.
Ao Toddy pelo companheirismo.
A todos os animais envolvidos, principalmente à Vitória, Catarina, Aleluia,
Exótica, Delícia, Lilica, Empanada, Bela, Marlene e Mamute, pela companhia e
por terem feito parte do meu experimento e da minha vida.
À minha família pela torcida, apoio e amor incondicional.
Ao Hugo pela ajuda na execução dos meus projetos durante toda minha
vida acadêmica, dedicação ao nosso casamento, paciência com minhas
expectativas e amor.
A Deus, mestre maior.
Lista de Tabelas
TABELA 1 - Médias ± desvios padrão (dp) do Peso, Escore de Condição Corporal (ECC) e Índice de Massa Corporal (IMC) dos Grupos experimentais de borregas em M0 e M2 do Experimento I ...51
TABELA 2 - Médias ± dp dos diâmetros médios (Ø) ultrassonográficos dos cornos uterinos das borregas dos 3 grupos experimentais, nos momentos experimentais (M0, M1 e M2). ...52
TABELA 3 - Médias ± dp das dimensões ultrassonográficas (comprimento e largura) dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, antes (M0) do estímulo com progestágeno (Crestar®)...53
TABELA 4 - Médias ± dp das dimensões ultrassonográficas (comprimento e largura) dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, após (M1) o primeiro estímulo com progestágeno (Crestar®)...53
TABELA 5 - Médias ± dp das dimensões ultrassonográficas (comprimento e largura) dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, após (M2) o segundo estímulo com progestágeno (Crestar®)...53
TABELA 6 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame laparoscópico do diâmetro dos cornos uterinos e do comprimento dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, antes (M0) do estímulo com progestágeno (Crestar®)...54
TABELA 7 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame laparoscópico do diâmetro dos cornos uterinos e do comprimento dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, após (M1) o primeiro estímulo com progestágeno (Crestar®)...55
TABELA 8 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame laparoscópico do diâmetro dos cornos uterinos e do comprimento dos ovários das borregas dos três grupos experimentais, após (M2) o segundo estímulo com progestágeno (Crestar®).......55
TABELA 9 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame ultrassonográfico do número de folículos ovarianos e diâmetro médio dos folículos ovarianos das borregas dos três grupos experimentais, após (M1) o primeiro estímulo com progestágeno (Crestar®)...56
TABELA 10 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame ultrassonográfico do número de folículos ovarianos e diâmetro médio dos folículos ovarianos das borregas dos três grupos experimentais, após (M2) o segundo estímulo com progestágeno (Crestar®)...56
borregas dos três grupos experimentais, antes (M0) do estímulo com progestágeno (Crestar®)...57
TABELA 12 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame laparoscópico do número de folículos ovarianos e diâmetro médio dos folículos ovarianos das borregas dos três grupos experimentais, após (M1) o primeiro estímulo com progestágeno (Crestar®)...57
TABELA 13 - Médias ± dp das dimensões aferidas pelo exame laparoscópico do número de folículos ovarianos e diâmetro médio dos folículos ovarianos das borregas dos três grupos experimentais, após (M2) o segundo estímulo com progestágeno (Crestar®)...58
TABELA 14 - Peso das ovelhas doadoras de embriões durante o período de adaptação à alimentação e ambiente do Laboratório...60
TABELA 15 - Parâmetros macroscópicos e microscópicos e cinética espermática, avaliados no sistema computadorizado e morfologia dos espermatozóides no sêmen do reprodutor portador do gene FecGE na avaliação de sua higidez
reprodutiva....61
TABELA 16 - Valores dos parâmetros do sêmen in natura do reprodutor portador do gene FecGE+HE utilizado nas inseminações artificiais em cada período...61
TABELA 17 - Médias dos parâmetros de cinética espermática avaliados no sistema computadorizado e morfologia dos espermatozoides no sêmen do reprodutor portador do gene FecGE+HE utilizado para realização das inseminações artificiais em cada período...62
TABELA 18 - Dados de recuperação e qualidade dos corpos lúteos e dos embriões obtidos por MOET de cada doadora...63
TABELA 19 - Parâmetros de avaliação da MOET das doadoras portadoras do gene FecGE agrupadas de acordo com a idade (G1<4 anos; n=6 e G2> 4 anos;
n=5)...64
TABELA 20 - Parâmetros observados nas receptoras distribuídos segundo o diagnóstico de prenhez aos 45 dias pós-coleta...64
TABELA 21 - Características qualitativas e quantitativas dos embriões transferidos e resultado do diagnóstico de gestação aos 30 e 45 dias...65
TABELA 22 - Acompanhamento dos parâmetros da condição corporal das receptoras prenhes (n=24)...66
TABELA 24 - Evolução do peso (Kg) durante o período de crescimento (em mês) das borregas nascidas em janeiro de 2012...68
TABELA 25 - Evolução do Índice de maça corpórea (IMC) durante o período de crescimento (mês) das borregas provenientes da MOET...69
TABELA 26 - Médias ± dp dos diâmetros (Ø) ultrassonográficos dos cornos uterinos das borregas dos 2 grupos experimentais, nos períodos experimentais (PRE e POS)...71
TABELA 27 - Médias ± dp das medidas ultrassonográficas (mm), largura dos ovários direito e esquerdo, comprimento dos ovários direito e esquerdo, e maior folículo aferido nos ovários direito e esquerdo das borregas do grupo FecGE-
(n=9), no período pré-estímulo (PRE). ...72
TABELA 28 - Médias ± dp das medidas ultrassonográficas (mm), largura dos ovários direito e esquerdo, comprimento dos ovários direito e esquerdo, e maior folículo aferido nos ovários direito e esquerdo das borregas do grupo FecGE+ (n=7), no período pré-estímulo (PRE). ...73
TABELA 29 - Médias ± dp das medidas ultrassonográficas (mm), largura dos ovários direito e esquerdo, comprimento dos ovários direito e esquerdo, e maior folículo aferido nos ovários direito e esquerdo das borregas do grupo FecGE- (n=9), no período pós-estímulo (POS). ...74
TABELA 30 - Médias ± dp das medidas ultrassonográficas (mm), largura dos ovários direito e esquerdo, comprimento dos ovários direito e esquerdo, e maior folículo aferido nos ovários direito e esquerdo das borregas do grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS)...75
TABELA 31 - Médias ± dp do Índice de massa corporal das borregas do Experimento II no período experimental...79
Lista de Figuras
FIGURA 1- Fluxograma...39
FIGURA 2- Escala milimétrica adaptada ao interior de uma bainha IMV® para inseminação de bovinos...39
FIGURA 3- Protocolo para superestimulação, coleta e transferência de embriões nas doadoras ...40
FIGURA 4- Protocolo para sincronização e inovulações das receptoras...42
FIGURA 5- Linha Temporal do Experimento II...44
FIGURA 6- Gráfico dos valores de peso em Kg ao longo de 5 meses de crescimento monitorados das borregas Santa Inês oriundas da MOET...69
FIGURA 7- Gráfico dos valores de IMC ao longo de 5 meses de crescimento monitorados das borregas Santa Inês oriundas da MOET...69
FIGURA 8- Gráfico das médias do número total de folículos constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pré-estímulo (PRE), P>0,05 teste de Kruskal-Wallis. ... 76
FIGURA 9- Gráfico das médias do número total de folículos3,0 mm constatados
no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pré-estímulo (PRE), P>0,05 teste de Kruskal-Wallis...76
FIGURA 10- Gráfico das médias do número total de folículos constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS), P>0,05 teste de Kruskal-Wallis...77
FIGURA 11- Gráfico das médias do número total de folículos 3,0 mm
constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS), P>0,05 teste de Kruskal-Wallis...77
FIGURA 12- Gráfico da distribuição dos valores de progesterona das borregas Santa Inês do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS)...80
Sumário
Resumo...1
Abstract...3
1 - Introdução...5
2 - Revisão de Literatura...8
2.1 - Desenvolvimento folicular ovariano em ovelhas...9
2.1.1- Fase antral do desenvolvimento dos folículos ovarianos em ovelhas...11
2.1.2 - Fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9)...14
2.1.3 - Proteína morfogenética óssea 15 (BMP15)...16
2.2 - Controle endócrino e fatores moduladores das fases pré-puberdade /puberdade...20
2.2.1 - Neuropeptídeo Y, Leptina e nutrição...23
2.3 - Bases genéticas da prolificidade em ovinos...25
2.4 - Ciclicidade e atividade luteal...29
2.5 - A progesterona exógena ...30
2.6 - Indicadores do desenvolvimento corporal...31
3 - Objetivos...34
4 - Material e Métodos...36
4.1 - Experimento I - Obtenção de parâmetros de diâmetro uterino e resposta ovariana após tratamento com CRESTAR® em borregas Santa Inês pré-púberes de 20 a 24 semanas de idade...37
4.2 - Experimento II - MOET de animais portadores do gene FecGE e acompanhamento do desenvolvimento corporal das borregas obtidas...39
4.2.1 - MOET para obtenção das borregas do Experimento III...39
4.2.2 - Superestimulação...40
4.2.3 - Colheita do sêmen e inseminação das doadoras...41
4.2.4 - Colheita dos embriões...41
4.2.5 - Sincronização das receptoras e inovulações...42
4.2.6 - Monitoramento da gestação e parto das receptoras e do crescimento das borregas...43
4.3 - Experimento III - Efeitos do estímulo com progesterona exógena sobre o desenvolvimento folicular e ciclicidade de borregas Santa Inês portadoras do gene FecGE...44
4.3.1 - Animais Experimentais...44
4.3.2 - Caracterização dos grupos experimentais...44
4.3.3 - Caracterização dos momentos experimentais ...45
4.4 - Critérios de avaliação...45
4.5 - Metodologia...46
4.5.1 - Pesagem dos animais...46
4.5.2 - Índice de massa corpórea...46
4.5.3 - Escore de condição corporal...47
4.5.4 - Dosagem hormonal...47
4.5.5 - Exames ultrassonográficos...48
4.5.6 - Laparoscopia/Laparotomia minimamente invasiva...48
4.5.7 - Alimentação...49
4.6 - Análise estatística...49
5.1 - Experimento I - Obtenção de parâmetros de diâmetro uterino e resposta ovariana após tratamento com CRESTAR® em borregas Santa Inês pré-púberes
de 20 a 24 semanas de idade...51
5.2 - Experimento II - MOET de animais portadores do gene FecGE e acompanhamento do desenvolvimento corporal das borregas obtidas...60
5.3 - Experimento III - Efeitos do estímulo com progesterona exógena sobre o desenvolvimento folicular e ciclicidade de borregas Santa Inês portadoras do gene FecGE...71
6 - Conclusões...87
7 - Referências...89
MONTEIRO TOMA, C.D. ''Caracterização do crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com progestágenos de borregas pré-púberes Santa Inês portadoras do gene FecGE.''
Botucatu, 2012. 120p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
Resumo
Visou-se caracterizar em borregas Santa Inês de 20-24 semanas de idade, o desenvolvimento final do trato reprodutivo, desencadeamento da puberdade, crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com progestágenos. Para tanto foram realizados 3 experimentos. No primeiro objetivou-se determinar os efeitos de estímulos subsequentes de progestágenos sobre o desenvolvimento uterino em borregas, Santa Inês independente da constatação da presença de gene de prolificidade. A condição impúbere das fêmeas foi detectada pela ausência de ciclicidade por meio de duas quantificações de progesterona pareadas com intervalo de sete dias. Posteriormente foram formados três grupos de 6 animais. O primeiro grupo (G1) foi submetido a um período de 12 dias de estímulos com progestágeno
(1,5 mg de norgestomet/1/2 implante subcutâneo Crestar®), o segundo (G2) a
dois períodos, com intervalo de 5 dias entre eles, de 12 dias de estímulos com
progestágeno (1,5 mg de norgestomet/1/2 implante subcutâneo Crestar®) e o
terceiro (G Controle) permaneceu como controle, não recebendo estímulo hormonal exógeno e mantido em isolamento social das fêmeas dos outros grupos. Em todos os animais (n=18) o desenvolvimento do trato reprodutivo e a resposta ovariana foram avaliados por meio da obtenção do diâmetro uterino médio, comprimento e largura do ovário e mensuração dos folículos ovarianos por exames ultrassonográficos seriados e laparoscopia em 3 momentos. Após os estímulos, um de 12 (G1) e dois de 12 dias (G2), as borregas tratadas apresentaram maior diâmetro médio uterino que aquelas do grupo controle, não se constatando diferença no maior diâmetro dos cornos uterinos entre os animais dos grupos tratados. O comprimento e largura do ovário e tamanho médio de folículos ovarianos não apresentaram diferença entre os momentos e grupos. No segundo experimento realizou-se a MOET (múltipla ovulação e
visando a obtenção de borregas com idade homogênea e portadoras do gene
FecGE à comporem o Experimento III. Com a MOET foram obtidas 9 borregas
(7 portadoras e 2 não portadoras do gene) que tiveram seu desenvolvimento ponderal acompanhado do nascimento aos 5 meses de idade. No terceiro experimento estudou-se em borregas Santa Inês de 20-24 semanas de idade
com 60% do peso adulto, não portadoras (n=9, Grupo FecGE-) ou portadoras
(n=7, Grupo FecGE+) do gene FecGE, o desencadeamento da puberdade,
crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com
progesterona (CIDR®) por 12 dias. A condição impúbere das fêmeas foi
detectada pela ausência de ciclicidade através de duas quantificações de progesterona pareadas com intervalo de sete dias. Durante o experimento foram realizados exames ultrassonográficos para avaliação do desenvolvimento do trato reprodutivo pela obtenção do maior diâmetro uterino, comprimento e largura dos ovários e a atividade ovariana. A ciclicidade pós tratamento foi constatada pela avaliação do perfil de progesterona. Após estímulo com progesterona, não houve diferença (P>0,05) entre o número total de folículos ovarianos, número de folículos maiores do que 3mm, tamanho do maior folículo aferido, comprimento e largura dos ovários e diâmetro maior dos cornos uterinos entre os animais de ambos os grupos; entretanto, 57,1% (4/7)
das borregas portadoras do gene FecGE+ e 22,2% (2/9) das borregas FecG
E-(P<0,05) ovularam após o estímulo.
MONTEIRO TOMA, C.D. ''Characterization of follicular growth, ovulation and luteal activity after progestogens treatment of prepuberal Santa Inês ewe lambs with the gene FecGE.'' Botucatu, 2012. 120p. Tese (Doutorado) -
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
Abstract
The aim is the studied in Santa Inês lambs of 20-24 weeks of age, suffering
gene FecGE, onset of puberty, follicular growth, ovulation and luteal activity after
treatment with progesterone (CIDR®). For this purpose three experiments were
performed. In the first the objective was to determinate the effects of subsequent stimulation of progestogens on uterine development in ewe lambs, regardless of the finding of gene prolificacy. The pré-puberal condition of females was detected by the absence of cyclicity by means of two measurements of progesterone paired with an interval of seven days. Subsequently three groups were formed of 6 animals. The first group (G1) was submitted for a period of 12 days with progestogen stimulus (1.5 mg
norgestomet/1/2 subcutaneous implant Crestar®), second (G2) to two periods
separated by 5 days, 12 days of stimulation with progestogen (1.5 mg
subcutaneous implant norgestomet/1/2 Crestar®) and third (G control) was the
control, receiving no exogenous hormone stimulation and kept in isolation from females of other social groups. In all animals (n = 18) the development of the reproductive tract and ovarian response were evaluated obtaining the average uterine diameter by serial ultrasound examinations and laparoscopy in 3 times. After the stimulation of 12 or 24 days, the treated lambs had higher uterine diameter than those in the control group, no difference was verified in diameter of the uterine horns between animals treated groups. The second experiment was carried out MOET (multiple ovulation and embryo transfer) of adult sheep
carriers FecGE gene order to obtain ewe lambs carriers of the FecGE gene to
compose Experiment III. Was monitored during this experiment body development, across weight, body condition score (BCS) and body mass index (BMI) of lambs during the growth phase. In the third experiment studied in Santa Inês lambs of 20-24 weeks of age with 60% of mature weight, non
carriers (n = 9, GroupFecGE-) or carriers (n = 7, Group FecGE+) gene FecGE,
treatment with progesterone (CIDR®) for 12 days. The condition pre-puberal of females was detected by the absence of cyclicity by means of two measurements of progesterone paired with an interval of seven days. During the experiment ultrasonographic examinations were performed to evaluate the development of the reproductive tract obtaining greater uterine diameter, length and width of the ovaries and ovarian activity. The cyclicity post treatment was contacted by assessing the profile of progesterone. After stimulation with progesterone, there was no difference (P> 0.05) between the total number of follicles, number of follicles larger than 3 mm, size of the largest follicle measured length and width of the diameter of the ovaries and uterine horns between animals in both groups, however, 57.1% (4/7) of lambs carrying the
gene FecGE+ and 22.2% (2/9) of ewe FecGE- (P <0.05) after stimulation
ovulated.
1- Introdução
Durante o primeiro ano de atividade reprodutiva a fertilidade de borregas é baixa comparada à de ovelhas adultas. Uma série de indicativos demonstra que as fêmeas ovinas continuam sexualmente imaturas por algum tempo após atingirem a puberdade, quando definida como a ocorrência do primeiro estro. A imaturidade é caracterizada por eventos que incluem estro de curta duração e a baixa intensidade de sua manifestação (SASA et al., 2002), bem como a presença de ovulações sem manifestação de estro e de ciclos estrais irregulares ou longos (BATHAEI, 1996).
Na fase pré-púbere neurônios pré-sinápticos não possuem habilidade em transmitir a informação adequada para liberação de gonadotrofinas ao hipotálamo. A função destes parece ser influenciada por diversos fatores como: plano nutricional, relações sociais, genética, entre outros (SENGER, 2003)
O melhoramento genético contribui diretamente com o aumento da produtividade da criação de ovinos. Um critério de seleção estudado é a detecção da presença de genes relacionados à prolificidade (DELGADO, 2000).
Métodos de seleção visando alterar a herdabilidade de características reprodutivas podem ser significativamente eficazes principalmente quando realizados de maneira associada a genes e/ou suas mutações (NOTTER, 2008).
Nos ovinos, existem várias raças com alta prolificidade, esta característica é determinada por mutações nos genes de fatores de crescimento da superfamília do fator de crescimento transformante beta (TGF -
ȕ) ou de seus receptores (SHIMASAKI et al., 2004).
Foi detectada em ovinos Santa Inês uma mutação nova (FecGE) que leva a uma substituição de uma fenilalanina por uma cisteína (F345C) no peptídeo da proteína codificada pelo gene GDF9. Esta mutação, quando em homozigose leva a um aumento na taxa ovulatória em ovelhas da raça Santa Inês (MELO et al., 2008).
Durante as últimas três décadas, houve um notável progresso em muitos aspectos dos estudos de biologia dos ovários devido aos avanços da ultrassonografia em tempo real, que permite de maneira não invasiva, o monitoramento repetitivo de estruturas ovarianas em animais conscientes e não anestesiados (BARTLEWSKI et al., 2011).
Em pequenos ruminantes, o acompanhamento ultrassonográfico do crescimento dos folículos ovarianos é tecnicamente desafiador devido ao porte dos animais, localização e posição do aparelho genital, e o tamanho dos ovários e suas estruturas (SCARAMUZZI et al., 2011).
Assim, este estudo foi desenvolvido para melhor compreensão, em borregas Santa Inês, de eventos relacionados ao desenvolvimento final do aparelho reprodutivo e desencadeamento da puberdade em fêmeas portadoras
2- Revisão de Literatura
2.1 Desenvolvimento folicular ovariano em ovelhas
Muitas raças ovinas apresentam um modelo de reprodução sazonal com incidência de ciclos estrais concentrados durante o outono e inverno (SASA et al, 2001). Um dos principais fatores reguladores da estacionalidade é a variação do período de luminosidade/escuridão ao longo do ano, que apresenta interdependência, diretamente proporcional a latitude (CHAMINEAU et al, 2008).
O ovário mamífero é um órgão dinâmico encarregado de proporcionar um ambiente ideal para a produção de hormônios e liberação dos gametas femininos. No ovário estão contidos milhares de folículos ovarianos que constituem sua unidade básica estrutural e funcional. A foliculogênese ovariana é um processo complexo que consiste do desenvolvimento de folículos primordiais até o estágio de folículo pré-ovulatório, durante o qual ocorre o crescimento oocitário e intensa proliferação das células da granulosa. Vários fatores de crescimento produzidos pelas células foliculares, frequentemente, atuam modulando os efeitos das gonadotrofinas FSH e LH, controlando, assim, a foliculogênese (LEITÃO et al., 2009).
Estima-se que o período de crescimento folicular da fase primordial para o estágio pré-ovulatório em ovelhas excede 6 meses, iniciando com folículos primordiais com cerca de 0,2mm de diâmetro e cerca de 130 dias, a partir daí, 24-35 dias são necessários para os folículos atingirem 0,5 mm de diâmetro e, mais 5 dias, para atingirem 2,2 milímetro de diâmetro; já o tamanho pré-ovulatório é atingido cerca de 4 dias mais tarde (BARTLEWSK et al., 2011).
O oócito segrega fatores de crescimento que desempenham um papel central na regulação da foliculogênese, células da granulosa e diferenciação das células do cumulus, taxa de ovulação e quantidade de fetos (SCARAMUZZI et al., 2011).
proliferação de células do folículo, atividade realizada principalmente pela GDF-9 durante as fases iniciais da foliculogênese e BMP-15 durante fases mais avançadas (ZUCOTTI et al., 2011).
O oócito é um importante regulador pré-antral e de crescimento folicular precoce antral, afetando a taxa de ovulação, a diferenciação e o metabolismo do cumulus oophorus, incluindo sua capacidade de expansão e capacidade de desenvolvimento do oócito (SCARAMUZZI et al., 2011).
No início do estádio de crescimento dos folículos, são necessários receptores de FSH na célula da granulosa e receptores de LH não surgem até que os folículos atinjam diâmetro de três milímetros ou mais. O desenvolvimento de receptores ao LH é modulado pela ação do estradiol, FSH e do próprio LH, e por fatores parácrinos e autócrinos produzidos localmente como as IGF (fator de crescimento semelhante a insulina), IGFBP (proteínas transportadoras de IGF), inibina e ativina (WEBB & ENGLAND, 1982).
Nos estágios iniciais da foliculogênese, fatores de crescimento produzidos localmente, tais como a ativina, o Kit Ligand (KL), o fator de crescimento epidermal (EGF) e as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), exercem um papel determinante na manutenção da viabilidade e do crescimento folicular. As interações parácrinas entre o oócito e as células somáticas mediadas pelos fatores de crescimento são cruciais para assegurar o perfeito desenvolvimento destes dois tipos celulares ao longo da foliculogênese (MATZUK et al., 2002).
Os folículos podem ser classificados em: primordial, "comprometido" (não retornam ao estádio primordial), responsivo a gonadotrofinas, dependente de gonadotrofinas e ovulatório (SCARAMUZZI et al., 1993).
O limiar de FSH necessário para o surgimento de folículos dependentes de gonadotrofinas varia entre os indivíduos de acordo com a época e idade (SCARAMUZZI et al., 2011).
Os primeiros eventos detectáveis na transformação de um folículo primordial para "comprometido" são: síntese de RNA pelo oócito (alguns destes RNA codificam os genes que controlam a síntese de proteína na zona pelúcida), o alargamento do oócito, atividade mitótica (timidina) em células da pré-granulosa, desenvolvimento cubóide de células da pré-granulosa e a formação de uma zona pelúcida. Quando 2-3 camadas de células granulosas são formadas, as células da teca se diferenciam do estroma circundante com um alinhamento concêntrico. Evidências de estudos em ratos sugerem que neste primeiro diferencial tecal, as células expressam receptores de LH. Pensa-se também que as células da granulosa de folículos comprometidos expressam receptores de FSH. Porém, os folículos comprometidos podem continuar a crescer independentemente das gonadotrofinas pituitárias (SCARAMUZZI et al., 1993).
Nos ovinos, os folículos comprometidos apresentam diâmetro de 0,03 a 0,1 mm e contêm cerca de 100000 células da granulosa com diâmetro de 0,1 mm. Estas estruturas são comumente referidas como folículos pré-antrais (SCARAMUZZI et al., 1993).
O número de folículos pequenos (2 a 3,5 mm), médios (4-5 mm) e grandes (maior de 5 mm) não diferem entre o início, meio e final da estação de monta. Além disso, são semelhantes durante a primeira e segunda onda ovulatória (TAKADA et al., 2012).
2.1.1 Fase antral do desenvolvimento dos folículos ovarianos em ovelhas
A ultrassonografia transretal em ovelhas adultas demonstra que o crescimento folicular ocorre como padrão em onda. Além disso, os folículos emergem a partir de uma ''pool'' de folículos de 2-5-mm de diâmetro (RAWLINGS et al, 2003; TAKADA et al., 2012).
Em ovinos, 90% ou mais das células da granulosa são recrutadas no epitélio de superfície e folículos primordiais contêm em média 16 (intervalo 3-52) células da granulosa. Em ovinos e bovinos, o crescimento folicular é iniciado antes dos últimos folículos primordiais serem formados e depois continua por toda a vida fetal, neonatal e adulto (SCARAMUZZI et al., 2011).
Três dias após a emergência, um ou alguns desses folículos podem alcançar o ''status'' de folículo ovulatório (diâmetro 5-8mm na ovelha, 15-18mm na vaca) através do desenvolvimento de receptores de LH em suas células da granulosa e tornar-se independente de FSH e dependentes de LH. Eles também secretam grandes quantidades de estradiol, androstenediona e inibina A (SCARAMUZZI et al., 2011).
O estro, em ovelhas, varia de 20 a 36 horas, com média de 26 horas (LINDSAY, 1991; JAINUDEEN & HAFEZ, 1993). A ovulação é espontânea e ocorre no final do estro, cerca de 24-27 horas após o início. Ovulações duplas e triplas são frequentes e ocorrem dentro de 2 horas após a primeira ovulação (LINDSAY, 1991).
É provável que em ovelhas existam diferenças entre raças com diferentes taxas de ovulação em termos de tamanho de folículos que adquirem a capacidade de responder a estímulos hormonais (BARTLEWSKI et al., 2011). Os folículos de duas ondas consecutivas de crescimento podem sofrer ovulação juntos, principalmente em ovelhas prolíficas e após ondas foliculares induzidas. Além disso, estudos recentes sobre o controle hormonal do ovário em ovelhas fornecem evidência da existência de um ritmo endógeno na secreção dos picos de FSH, cuja peridiocidade e duração podem ser modificados pela progesterona luteal em fêmeas cíclicas (BARTLEWSKI et al., 2011).
Em ovelhas, o IGF-I é um potente estimulador do crescimento folicular e secreção de estradiol folicular, estimula a proliferação de células da granulosa nos folículos pequenos (1-3 mm diâmetro), e a secreção de progesterona pelas
células da granulosa de folículos grandes in vitro (4-5mm de diâmetro). Para o
sistema biológico in vivo, o estradiol folicular e a inibina na ovelha são
diferenciadas de células da granulosa, dependendo da fase de desenvolvimento do folículo (SCARAMUZZI et al., 2011).
O número de folículos gonadotrofina-responsivos por ovelha é relativamente grande, cerca de 25 folículos entre 1 e 2,5 mm de diâmetro. Embora estes folículos formem um pool do qual os folículos ovulatórios vão se desenvolver, a maioria é imatura para ser dependente de gonadotrofinas e ovular, na ausência de gonadotrofinas exógenas (SCARAMUZZI et al., 1993).
O folículo dominante em descrição morfológica refere-se ao maior folículo. No entanto, este conceito tem duvidosa relevância fisiológica em pequenos ruminantes, pois o maior folículo não é necessariamente o folículo ovulatório (SCARAMUZZI et al., 2011).
O CL da ovelha é composto de quatro principais tipos de células: pequenas células luteais, grandes células luteais, fibroblastos e células endoteliais. Pequenas e grandes células luteais esteroidogênicas derivam de células da teca e granulosa, respectivamente. Pequenas e grandes células contribuem para o incremento na massa total lútea durante o início e meados da fase luteal do ciclo estral. Grandes células luteais aumentam de tamanho entre os dias 4 e 12 do ciclo (dia 0 = aparecimento de cio), mas o seu número permanece relativamente constante até o início da luteólise. Já as pequenas não mudam de tamanho mas aumentam em número entre os dias 4-8 do ciclo (BARTLEWSKI et al., 2011).
As concentrações de LH são baixas durante a maior parte do ciclo estral e o padrão de secreção se caracteriza por pulsos infrequentes. Durante a luteólise, como a concentração de progesterona diminui, a secreção de LH aumenta devido a uma maior frequência de pulsos. Isto culmina na onda pré-ovulatório de LH cerca de 4 dias após a luteólise (SCARAMUZZI et al., 1993).
pelos folículos dominantes, que restringem o crescimento dos outros folículos (LINDSAY et al, 1991).
Tanto a insulina, IGF-I, fatores parácrinos e autócrinos podem, de uma maneira dose dependente, alterar a sensibilidade de células da granulosa ao FSH estimulando a produção de estradiol, reduzindo o limiar de FSH necessário para a estimulação máxima para produção de estradiol ou inibindo a atividade da aromatase e, assim, aumentando a concentração mínima de FSH necessária para estimular a produção de estradiol (SCARAMUZZI et al., 2011).
A maciça liberação pré-ovulatória de GnRH e subsequentemente de LH e FSH, atingem um pico cerca de 14 h antes da ovulação. Este aumento de gonadotrofinas é provocado e sustentado pela diminuição de progesterona e aumento da secreção de estradiol durante a etapa final do ciclo estral. Pulsos rítmicos de LH gerados por GnRH prevalecem em todos os estados reprodutivos em ovelhas, incluindo os períodos antes, durante e após o aumento pré-ovulatório de gonadotrofinas. Um aumento de frequência e amplitude na secreção de LH anuncia o pico pré-ovulatório (BARTLEWSKI et al., 2011).
Estudos anteriores com o ultrassom demonstraram as diferenças entre raças em relação ao número e tamanho de folículos, e de número e estrutura dos corpos lúteos. A realização de uma base de dados a partir de diferentes raças ovina é muito importante e necessária para a estimativa precisa dos resultados de ultrassom sobre os ovários de ovelhas. Folículos pré-ovulatórios na raça Karakachnska, Merino e Finnish durante a época de reprodução apresentam tamanho médio de 6,2 a 7,6 milímetros (KACHEVA et al., 2008).
2.1.2 Fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9)
Os fatores da família TGFȕ [proteínas morfogenéticas ósseas dos tipos 2
em crescimento ao FSH, enquanto vários outros (BMP-2, 4, 7, 15, GDF-9, ativina-A e TGF-ß) estimulam o crescimento folicular. Em geral, a foliculogênese é regulada por uma complexa interação desses fatores de crescimento com as gonadotrofinas (SILVA et al., 2009).
O fator de crescimento e diferenciação 9 é uma proteína codificada pelo
gene GDF9. O GDF9 é um fator de crescimento da super família beta (TGFȕ) e
desempenha um importante papel no desenvolvimento de folículos primários no ovário (JUENGEL et al., 2004), no crescimento de células da granulosa e teca bem como na diferenciação e maturação do oócito (SU et al., 2004).
Os fatores sintetizados por células ovarianas somáticas afetam diretamente o crescimento e função do oócito. O fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF9) é expresso em oócitos e é indispensável à foliculogênese (MCGRATH et al., 1995).
O receptor de superfície celular através do qual GDF 9 gera um sinal é o receptor da proteína morfogenética do osso tipo II BMPR2 (MAZERBOURG & HSUEH, 2006).
O gene GDF9 codifica uma cadeia polipeptídica de 453 aminoácidos, que depois de processada dá origem a um peptídeo maduro com 135 aminoácidos. Ao se dimerizar, o peptídeo maduro forma o hormônio GDF9 (ÁVILA et al., 2005).
O GDF9 é sintetizado e secretado pelo oócito, está presente no fluído folicular e seus principais alvos são as células da granulosa e do cumulus. Tem efeito mitogênico sobre as células da granulosa e cumulus adjacentes, sendo fundamental para a foliculogênese e o desenvolvimento folicular. Mutações pontuais no gene foram correlacionadas ao aumento da taxa de ovulação em ovelhas de raças européias quando em heterozigose e à infertilidade quando em homozigose (ÁVILA et al., 2005).
Foram identificadas sete mutações no peptídeo GDF9. Seis destas
mutações encontram-se no pré-peptídeo, sendo que três delas são silenciosas
(não resultam numa mudança da sequência de aminoácidos) e uma
conservada (não altera as propriedades da proteína). A principal mutação foi
aminoácido fenilalanina para cisteína. A fenilalanina encontra-se conservada nessa posição em diversos animais, o que sugere sua relevância na estrutura da proteína (ÁVILA et al., 2005).
O gene GDF 9 é constituído de 2 éxons. O segundo éxon contém mais de 70% da seqüência do quadro de leitura da proteína, em que se encontram 135 aminoácidos da porção C – terminal, formadores do peptídeo maduro, cujo processamento e dimerização dão origem ao hormônio GDF9 ativo (CASTRO et al., 2008).
No ovário da ovelha e da vaca, o GDF9 é produzido exclusivamente pelo oócito. Além disso, GDF9 e seu mRNA foram identificadas em oócitos no momento de formação folicular e ao longo de todas as fases do desenvolvimento folicular. Em contraste, BMP15 e seu mRNA foram pela primeira vez identificados em ovelhas, na fase primária de crescimento folicular e em todas as etapas subsequentes (SCARAMUZZI et al., 2011).
Os níveis de expressão da proteína de conversão (PCK6), fator de crescimento e diferenciação celular GDF-9 e AMH, são altos na fase pré-antral, mas diminuem durante a transição para a fase antral PCK6 pode ser considerado um regulador intra-ovariano de atividade de GDF-9 e AMH (ZUCOTTI et al., 2011).
2.1.3 Proteína morfogenética óssea 15 (BMP15)
Evidências de estudos in vitro sugerem que BMP15 e GDF9 cooperam
como um complexo que influencia a proliferação e esteroidogênese das células da granulosa (SCARAMUZZI et al., 2011).
O crescimento adequado do folículo é equilibrado através da regulação
da expressão do Kit Ligand (KL), que é inibida por GDF9 e ativada pelo
BMP15, este último sendo inativado pelo KL. O KL parece ser a ligação que coordena o crescimento do oócito e a proliferação de células da granulosa. Mais tarde, em folículos antrais, este fator regula a expressão de ativina nas células da granulosa e da teca (ZUCOTTI et al., 2011).
proteína podem causar aumento da taxa de ovulação ou infertilidade (MARTINEZ-ROYO et al., 2008).
No ovário da maioria das espécies, a proteína e o mRNA para a BMP15 são encontradas exclusivamente no oócito, sugerindo esta estrutura como fonte primária da BMP15 neste órgão. A proteína foi primeiramente observada nos oócitos de folículos primários de ovinos, humanos, ratos e camundongos e em folículos primordiais de pequenos marsupiais. Em caprinos, a presença da BMP15 foi demonstrada nos oócitos de todas as categorias foliculares, bem como nas células da granulosa de folículos primários, secundários e antrais.
Além do ovário, o RNAm para a BMP15 já foi identificado na hipófise e rede
testis de algumas espécies, indicando possíveis ações desta proteína em
outros órgãos e sistemas (LIMA et al., 2010).
A maioria dos membros da superfamília TGF-ȕ, com exceção da inibina
e da subfamília do fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), exerce seus efeitos sobre as células-alvo por meio da ligação com dois receptores serina/treonina quinase presentes na superfície celular, denominados de receptores Tipo I e Tipo II (CHANG et al., 2002). Até o presente momento, sete receptores Tipo I e cinco receptores Tipo II já foram identificados em
mamíferos. Em ovelhas, a proteína e o RNAm para ALK-6 (Activin receptor-like
kinase 6) e BMPR-II (receptor de BMP II) foram detectados tanto nas células da
granulosa quanto nos oócitos de folículos pré-antrais e na granulosa de folículos antrais (SILVA et al., 2004), sugerindo, assim, um importante papel da BMP15 na regulação da função destes dois tipos celulares durante o desenvolvimento folicular.
Durante sua ação biológica na célula, a BMP15 se liga primariamente ao receptor ALK-6 e, em seguida, promove o recrutamento do receptor BMPR-II para o complexo pré-formado. Este último receptor, por conseguinte, induz à fosforilação do ALK-6 já previamente ligado à proteína, determinando a
fosforilação de moléculas de sinalização intracelular denominadas Smads.
Essas moléculas, classificadas como Smads 1, 5 e 8, interagem com outra
molécula (Smad 4), resultando na formação de um complexo sinalizador que é
A proteína BMP15 tem sido reconhecida ainda como um importante inibidor da expressão do receptor de FSH em células da granulosa, determinando o bloqueio da síntese de progesterona induzida pelo FSH e inibindo também a expressão de proteínas (StAR e P450scc) envolvidas na esteroidogênese e estimuladas por esta gonadotrofina. Essa característica tem sido intrinsecamente relacionada à habilidade da BMP15 em induzir à inibição do processo de luteinização precoce (LIMA et al., 2010).
Em ovelhas, observou-se que a BMP15 apresenta um papel relevante no desenvolvimento folicular até o estágio ovulatório, sugerindo a efetiva participação desta proteína durante os estágios iniciais e finais da foliculogênese. A imunização passiva contra a BMP15 revela que ovelhas imunizadas apresentam quantidade reduzida de folículos em estágios superiores ao primário e ainda baixa taxa de formação de antro e ovulação (LIMA et al., 2010).
A mutação na BMP15 em algumas raças de ovinos se caracteriza por uma deleção de 17 pares de bases, o que leva a tradução de uma sequência de aminoácidos alterada. Esta mutação, assim como as outras já relatadas em BMP15, está associada com aumento de prolificidade em animais heterozigotos e esterilidade em homozigotos (MARTINEZ-ROYO et al., 2008).
Em ruminantes, as células da teca, uma camada que envolve a membrana basal em folículos primários, são recrutadas a partir do estroma ovariano sob o estímulo de fatores de crescimento parácrinos, tais como o KL e o fator de crescimento fibroblástico básico (FGFb), os quais são sintetizados pelas células da granulosa e pelo oócito, respectivamente, e apresentam atuação mútua neste processo (KNIGHT & GLISTER, 2003).
O KL é capaz de inibir a apoptose nos oócitos de folículos primordiais por meio do aumento na expressão de proteínas antiapoptóticas. Tem-se demonstrado ainda que o KL previne a ocorrência de sinais de degeneração
em oócitos de folículos pré-antrais após cultivo in vitro. Trabalhos utilizando a
BMP-15, por sua vez, também têm verificado seu importante papel na prevenção da atresia em células somáticas foliculares (YOSHINO et al., 2006).
células da granulosa, enquanto o KL inibe a expressão de BMP-15 nos oócitos,
determinando a existência de um sistema de feedback negativo entre estes
dois fatores de crescimento. Além disso, observou-se que as atividades mitóticas tanto da BMP-15 quanto do KL são dependentes deste sistema de comunicação entre oócito e células da granulosa (OTSUKA & SHIMASAKI, 2002).
Apesar de sua importância fisiológica, todas as células alvo de BMP 15 não foram identificadas. Sabe-se de seu papel durante a foliculogênese sobre os folículos regulando sua proliferação e diferenciação (OTSUKA et al., 2000).
O BMP 15 administrado em conjunto com o GDF 9 é muito potente em estimular as células da granulosa com um efeito 3 vezes maior do que em comparação com qualquer fator de crescimento sozinho (MCNATTY et al., 2005).
Ovelhas das raças Inverdale e Hanna, por apresentarem mutações inativadoras da BMP-15 (FecXI e FecXH), constituem modelo interessante para a compreensão do papel desta proteína no controle da foliculogênese, bem como na determinação da fertilidade e da taxa de ovulação. Nestes animais, a mutação em homozigose causa infertilidade com bloqueio da foliculogênese no estágio de folículo primário e, quando em heterozigose, apresentam 0,63 ovulações extras e 0,35 cordeiros adicional por parto (GALLOWAY et al., 2000, LAHOZ ET AL.,2011).
Acredita-se que a ausência de bioatividade da BMP-15 nas ovelhas homozigotas ocorra devido ao comprometimento da proliferação das células da granulosa e o subsequente desenvolvimento folicular, culminando com o bloqueio no estágio de folículo primário. Contudo, nas ovelhas heterozigotas, as maiores taxas ovulatórias possivelmente são resultantes do aumento da sensibilidade ao FSH, já que a BMP-15 inibe a expressão de receptores para essa gonadotrofina. O FSH, por sua vez, atuaria acelerando o desenvolvimento folicular e induzindo à ovulação precoce nos pequenos folículos em crescimento (LIMA et al., 2010).
2.2 Controle endócrino e fatores moduladores das fases pré-puberdade / pré-puberdade
A obtenção de adequados índices de desempenho reprodutivo na criação de ovinos é dependente de vários fatores, entre os quais podem ser citados: precocidade, longevidade reprodutiva, frequência de parições, prolificidade e taxa de sobrevivência de cordeiros. Muito embora esses componentes possam ser influenciados por fatores ambientais a grande influência da hereditariedade sobre eles permite seu aperfeiçoamento pelo melhoramento genético (RIBEIRO et al., 2003).
O início da atividade sexual, tanto em machos quanto em fêmeas, é de grande importância na criação de animais de produção, principalmente para o retorno econômico da atividade, que ocorre somente quando os animais
entram na fase produtiva (SOUZA et al., 2003).
Em sistemas de produção que visem animais com aptidão para produção de carne, os cordeiros machos logo após o desmame ou com pouco tempo de confinamento são encaminhados ao abate, as fêmeas jovens de acordo com a época de nascimento permanecem no rebanho sendo alimentadas e manejadas até a estação de acasalamento no ano seguinte com idade superior a um ano, o que pode representar uma desvantagem econômica significativa (VILLAS BÔAS et al., 2003).
Há várias definições quanto ao início da puberdade, entre elas: idade ao primeiro estro, idade à primeira ovulação, idade na qual a fêmea suporta a prenhez sem efeitos deletérios futuros, este último principalmente relacionado ao peso corporal. A idade à puberdade em borregas está entre 4 e 14 meses (SENGER, 2003).
Vários fatores afetam a idade a puberdade, entre eles: genética, nutrição, época de nascimento, relações sociais, peso corporal, depósito de gordura corporal, concentração de glicose sanguínea e taxas plasmáticas de leptina. Estes e outros modulam, de forma ainda não totalmente conhecida, a liberação, frequência e pulso de gonadotrofinas (SENGER, 2003).
mais lento, como a Merino. O primeiro estro ocorre quando as ovelhas apresentam 30 a 50 kg de peso corporal (JAINUDEEN & HAFEZ, 1993).
Quando com peso corpóreo ideal para atingir a maturidade sexual, o fotoperíodo vai determinar o início da puberdade na estação em que ocorrer a diminuição do comprimento do dia. Somente ovelhas que tenham sido expostas aos dias longos e então dias curtos, podem atingir seu desenvolvimento sexual (JAINUDEEN & HAFEZ, 1993).
Em ovelhas durante a fase de pré-puberdade, o efeito inibitório da dopamina foi mais evidente entre 17 e 22 semanas de idade. A influência do fotoperíodo sobre o ciclo reprodutivo pode modular inter-relações entre a dopamina e opióides endógenos (CARDOSO & NOGUEIRA, 2007).
Após o nascimento ocorre aumento na secreção das gonadotrofinas
cuja função, provavelmente, é estimular o desenvolvimento de um pool de
folículos antrais e uma precoce maturação do eixo hipotalâmico-hipofisário (RAWLINGS et al., 2003).
Em cordeiras, o número de folículos antrais ao nascimento é alto. Esta elevada população se mantém até cerca de 4 a 8 semanas de idade, e então há um declínio. O diâmetro do maior folículo em borregas aumenta de 8 a 14 semanas, recua de 14 a 22 semanas, e finalmente volta a aumentar entre 32 e 38 semanas depois do nascimento (RAWLINGS et al., 2003).
O sistema secretor de LH hipofisário em cordeiras é sensível aos efeitos estimulatórios de estradiol antes da puberdade (MEIKLE et al., 1998).
Em borregas pré-púberes, o eixo hipotalâmico-hipofisário é funcionalmente competente, porém os folículos não chegam ao estadio pré-ovulatório, pois o perfil de liberação do LH é caracterizado por pulsos de baixa frequência (SCHILLO et al., 1992).
A atividade endócrina inicial, com aumento da secreção de gonadotrofina é suprimida posteriormente pelo controle retrógrado negativo do estradiol até que a borrega possua peso corporal ou estado metabólico maturo para se reproduzir (RAWLINGS et al., 2003).
provocada pelos opióides endógenos suprime o sistema neural dopaminérgico. O sistema neural adrenérgico também possui papel estimulatório na secreção de gonadotrofinas (CARDOSO & NOGUEIRA, 2007).
Concentrações baixas de estradiol exercem controle retrógrado negativo na liberação tônica do LH em borregas pré-púberes. Porém, o controle retrógrado negativo exercido pelo estradiol sobre a secreção de gonadotrofinas pela hipófise é diminuído com avançar da idade e proximidade da puberdade. Quando as fêmeas atingem a fase peri-púbere, há aumento na freqüência de pulsos de LH, maturação dos folículos ovarianos e aumento na concentração de estradiol e, consequentemente, estro e pico pré-ovulatório de LH (SCHILLO et al., 1992).
Alterações na bioatividade do FSH (alterações no peso molecular e afinidade de receptor), associadas com mudanças no padrão de distribuição de isoformas de FSH, no período de desencadeamento da puberdade em ovelhas, coincidentes com alta frequência de liberação de GnRH e crescentes concentrações de estradiol influenciam o aumento do número e diâmetro dos folículos (RAWLINGS et al., 2003).
A exposição à progesterona no primeiro ciclo que culmina em ovulação, acompanhada ou não de cio parece estar envolvida no desenvolvimento final do trato reprodutivo em borregas (RAWLINGS et al., 2003).
Há também diminuição na concentração de receptores ao estradiol no hipotálamo e hipófise, o que permite aumento da frequência dos pulsos de LH e aumento na produção de estradiol pelos folículos ovarianos e com consequente desenvolvimento puberal da genitália (SCHILLO et al., 1992).
Alterações na tuba uterina e corno uterino acontecem histo-morfologicamente durante a transição para a puberdade em ovelhas. Estas mudanças podem ser relacionadas à diminuição de fertilidade associada a borregas quando em sua primeira estação de procriação (LEWIS & BERARDINELLI, 2001).
2.2.1 Neuropeptídeo Y, Leptina e nutrição
Influências nutricionais, seja diretamente por meio de nutrientes da dieta ou através de intermediários metabólicos, afetam a foliculogênese em diversos níveis no eixo hipotálamo-hipófise-ovariano (SCARAMUZZI et al., 2011).
Próximo à primeira ovulação verifica-se aumento na pulsatilidade de LH, através da diminuição de receptores hipotalâmicos de estradiol associado a possíveis neurotransmissores estimulatórios (noraepinefrina, neuropeptídeo Y, aminoácidos excitatórios) com decréscimo da influência neuronal inibitória (opióides, GABA), estabelecendo-se ritmos de liberação de LH, maior produção de esteróides pelos ovários que irá originar uma retroalimentação positiva, gerando onda pré-ovulatória de LH e a primeira ovulação (CARDOSO & NOGUEIRA, 2007).
No hipotálamo, condições resultando em balanço energético negativo como a hipoglicemia, inibem a pulsatilidade de LH em ovinos, bovinos e humanos, provavelmente por haver inibição da secreção de GnRH resultando em uma falha do mecanismo de pico de LH e anovulação (SCARAMUZZI et al., 2011).
Com a função de estimulador do apetite, o neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo de 36 aminoácidos sintetizado nos núcleos arqueados do hipotálamo secretado por terminações nervosas dentro de núcleos paraventriculares. As ações de NPY são mediadas por uma família de subtipos de receptor nomeados Y1 a Y6, com ações de estímulo à ingestão, principalmente mediadas pelos subtipos Y1 e Y5 (EL-HADDAD et al., 2003).
O NPY está associado à percepção do hipotálamo ao estado nutricional, e é influenciado por variações endócrinas, especificamente da leptina e da insulina. O NPY é um potente e crônico inibidor da secreção de LH e também potencial estimulador da secreção de hormônio do crescimento (GH) em ovelhas púberes. Assim, o aumento de NPY que ocorre concomitante com a nutrição reduzida é um significante contribuinte da redução nas concentrações periféricas de LH e elevação nas concentrações periféricas de GH em animais desnutridos (MORRISON et al., 2002).
nas áreas do hipotálamo que regulam o crescimento e a reprodução de borregas. Isto sugere que um aumento no número de neurônios produtores de NPY pode ser resultante dos efeitos nutricionais de dietas com baixos níveis de proteína. Então, o NPY possivelmente é o fator que liga a neuromodulação entre condições nutricionais e hormônios somatotróficos e gonadotróficos no sistema nervoso central em ovelhas (POLKOWSKA & GLADYSZ, 2001).
Barb e Kraeling (2004) propuseram que o NPY funcione como mediador primário da ação da leptina no hipotálamo para regular a secreção dos hormônios LH e GH.
Há evidências que mostram que os efeitos estimulantes da nutrição sobre a foliculogênese são mediados diretamente nos ovários pela glicose, ácidos graxos e várias hormônios metabólicos têm ações diretas sobre o folículo. Porém a exigência de energia para a foliculogênese considerando-se o volume de demanda de todo o corpo é insignificante. Assim, o efeito da energia na foliculogênese é mais reguladora do que fornecedora de combustível metabólico (SCARAMUZZI et al., 2011).
A leptina exerce um efeito trans-sinapse por meio dos neuropeptídeos hipotalâmicos NPY e proopiomelanocortina (POMC). A leptina estimula a expressão do POMC, que por sua vez resulta no aumento da produção de
hormônio alfa melanócito estimulante (Į-MSH), que resulta na saciedade
(SALMAN et al., 2007).
A leptina é uma proteína de 16 Kda constituída por 146 aminoácidos sintetizada principalmente pelo tecido gorduroso e segregada na corrente sanguínea. O hipotálamo parece ser o local fundamental de sua ação, porém, são achados receptores de leptina em outras regiões do cérebro como a hipófise (BARB & KRAELING, 2004).
A síntese da leptina em ruminantes é incrementada em longo prazo com o aumento da camada de gordura no corpo, e pelo tamanho ou número de adipócitos. A leptina “sinaliza” ao hipotálamo a condição corporal do animal e tem fundamental papel no desencadeamento da puberdade, onde um
determinado status corporal precisa ser atingido (SALMAN et al., 2007).
no sangue tais como glicose, ácidos graxos não esterificados, corpos cetônicos, entre outros; e os hormônios, representados pela insulina, GH, catecolaminas e glicocorticóides (SALMAN et al., 2007).
O estradiol parece modular a reposta hipotálamo-hipófise à leptina (BARB & KRAELING, 2004).
O nível de leptina circulante aumenta temporariamente durante tratamento com progestágenos sintético (fluorogestone) em ovelhas (KULCSÁR et al., 2005).
As concentrações plasmáticas de glicose, leptina e insulina são elevadas quando os animais estão em balanço energético positivo, bem como imediatamente após a alimentação (SCARAMUZZI et al., 2011).
A leptina pode ter funções parácrinas e autócrinas em folículos, além das suas funções endócrinas. Estudos de fisiologia sugerem que a leptina exógena estimula a foliculogênese e esteroidogênese folicular em ovelhas (SCARAMUZZI et al., 2011).
A influência inibitória da leptina sobre a secreção de estradiol parece envolver o sistema IGF (SCARAMUZZI et al., 2011).
2.3 Bases genéticas da prolificidade em ovinos
heterozigotos, surpreendentemente, têm maior taxa ovulatória do que ovelhas selvagens (SCARAMUZZI et al., 2011).
O genótipo Booroola (FecB) foi identificado em ovelhas Merino na Austrália, no final da década de setenta, como sendo causado por um gene principal, com efeito aditivo sobre a taxa de ovulação e dominância sobre o tipo de parto. Recentemente este fenótipo foi associado a uma mutação de ponto no domínio da quinase do gene do receptor para proteínas morfogenéticas de osso 1 B (BMPR1B), causada por uma transição de adenina para guanina na posição 746, e uma glutamina por uma arginina na posição 249 (Q249R) da proteína mutante (SOUZA et al., 2003).
A comprovação da origem genética da prolificidade em ovinos através da identificação de mutações nos genes codificadores dos fatores parácrinos do crescimento folicular e ovulações, como as proteínas da família BMPs e seu receptor, possibilitaram o uso de marcadores genéticos de prolificidade (a exemplo do Booroola) como ferramenta de incrementar a prolificidade dos rebanhos. A eficiência da “introgressão” desse gene nos rebanhos ovinos e facilidade no manejo desta característica determinada pela disponibilidade de testes de DNA rápidos e eficazes permitem seu uso em rebanhos comerciais (SOUZA et al., 2003).
O FecB é um gene dominante com amplo efeito na taxa ovulatória. O efeito do FecB é aditivo para a ovulação, sendo que duas cópias de FecB aumentam o número de ovulações em cerca de 1,6 ou cada cópia aumenta o número de ovulações em 90%. Animais com uma cópia da mutação têm entre três e quatro ovulações, enquanto aqueles com duas cópias têm algo em torno de cinco a 14. Há também correlação entre a presença dessa mutação e uma reduzida taxa de atresia folicular (HOLANDA et al., 2006).
O gene Booroola (FecB) parece afetar efetivamente tanto a progesterona quanto o FSH, durante o ciclo estral e ao longo da prenhez, sugerindo que a BMP exerça um importante papel na regulação de ambos os hormônios. Em 2003 Campbell e colaboradores evidenciaram, em
experimentos in vivo, que esse gene atua nas gônadas femininas aumentando
Desse modo, os receptores da BMP parecem envolvidos com a regulação parácrina da ação do FSH (HOLANDA et al., 2006).
Foram localizados dentro dos ovários de ruminantes ALK6 (gene que codifica o receptor da BMP15) e seu RNAm em oócitos a partir da fase primordial e nas células da granulosa na fase primária de crescimento e depois ao longo do desenvolvimento folicular. Folículos de mutantes homozigotas Booroola FecBB ovulam com diâmetros significativamente menores e com
menor camada de células da granulosa sugerido em estudos in vitro por uma
antecipação na capacidade de responder ao FSH (SCARAMUZZI et al., 2011). Um critério de seleção que está sendo estudado é a presença do gene Boroola, que em alguns animais caracteriza ganho de peso, podendo influenciar diretamente a idade a puberdade, pois animais que contenham este gene apresentam maior facilidade de ganho de peso e desenvolvem suas atividades sexuais mais cedo (DELGADO et al, 2000).
Ovelhas que carreiam o gene Booroola têm maior número de ovulação, porque mobilizam maior número de folículos primordiais para a ovulação ou porque têm um menor número de atresia (HOLANDA et al., 2006).
Três linhagens de ovelhas prolíficas denominadas Inverdale, Hanna e Booroola, nas quais foi mapeada uma herança mutante na região do cromossomo X (Inverdae e Hanna, FecX) ou no cromossomo 6 (Booroola FecB). Nestes cromossomos foi identificado um ponto de mutação no gene da proteína morfogenética óssea (BMP) (HOLANDA et al., 2006).
As mutações FecX, FecXL e FecXB causam alterações nos aminoácidos das posições 31, 53 e 99, respectivamente, no gene BMP15 (BODIN et al., 2007).
Cinco diferentes alelos mutantes FecX levaram a aumento nas taxas de ovulação em ovelhas heterozigotas e esterilidade em homozigotas. Em particular, as ovelhas heterozigotas com os alelos FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway) ou FecXL (Lacaune) exibiram 1-2 ovulações adicionais em comparação com as não portadoras, enquanto que ovelhas homozigotas eram estéreis (BODIN et al., 2007).
o que prejudica a produção da substância biologicamente ativa BMP 15 (MARTINEZ-ROYO et al., 2008).
Da mesma forma o FecX L alelo (Lacaune) é incapaz de produzir um produto biologicamente ativo de BMP15. A partir destes dados verifica-se que estas mutações induzem a perda de função na atividade da BMP15 (BODIN et al., 2007).
O número de cordeiros nascidos por parto (prolificidade) é uma característica desejável, mas deve estar adequado as condições de criação. A prolificidade em ovinos é determinada principalmente pela taxa de ovulação (TO). Vários polimorfismos têm sido identificados em fatores de crescimento específicos do oócito como o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF9) e que resultam em aumento da TO e da prolificidade dos rebanhos. Através de triagem pelo fenótipo de parto triplo, foi identificado em ovelhas da raça Ile de France um novo alelo do gene GDF9 com uma mutação de ponto (C943T), resultando na mudança não conservativa de um aminoácido (Arg315Cys) no local de clivagem do peptídeo maduro (SOUZA et al., 2011).
O FecGEé um polimorfismo no gene GDF9 que aumenta a taxa
de ovulação em homozigóticos, sem esterilidade, em ovelhas Santa Inês. Foi encontrado em animais com uma mutação que leva a uma substituição de uma fenilalanina por uma cisteína (F345C) no peptídeo da proteína codificada pelo gene GDF9 (SILVA et al., 2010).
O gene FecGE foi detectado em um estudo com 334 ovelhas, a partir de
uma população com fêmeas Santa Inês com histórico de partos múltiplos de 2002 a 2008. Foram investigadas mutações nos genes BMP15 e GDF9. Subsequentemente, o éxon 2 dos genes GDF9 e BMP15 foram rastreados para polimorfismos pelo sequenciamento de DNA utilizando-se os seguintes iniciadores: GDF9 (5'-GGAGAAAAGGGACAGAAGC; 5'-CGACAGGTACA CTTAGT); e BMP15 (5'-GGCTGCTTGTCAGTTTGTAC; 5'-GAGCACTTTCA GATTTAA) (MELO et al., 2008).
A mudança estrutural da mutação FecGE pode reduzir a atividade do
permitir melhor compreensão do mecanismos de controle da ovulação e ovogênese em mamíferos (MELO et al., 2008).
Há evidências de que muitas outras linhagens de ovelhas prolíficas têm segregado estes genes principais. Essas linhagens incluem ovelhas Cambridge (FecC), Thoka (FecI), Javanês (FecJ), Olkuska, Belclare, Lacaune, Woodlands (FecX2) e Han da cauda curta (HOLANDA et al., 2006).
2.4 Ciclicidade e atividade luteal
Níveis plasmáticos de progesterona inferiores a 1 ng/mL por período superior a 7 a 10 dias são característicos de fêmeas em anestro enquanto valores superiores a 3 ng/mL caracterizam a fase de diestro (luteal) ou gestação (MINTON et al., 1990; MONTEIRO et al., 2010; SASA et al., 2002).
Pode-se caracterizar o estro pela observação de fêmeas marcadas por machos vasectomizados com confirmação pela obtenção de concentrações plasmáticas de progesterona inferiores a 1 ng/mL por um período máximo de 48 horas (SASA et al., 2002).
De acordo com Minton e colaboradores (1990), valores plasmáticos de progesterona inferiores a 1 ng/mL podem caracterizar as fases de estro ou de anestro.
Coelho (2000), trabalhando com fêmeas das raças Santa Inês, Romney
Marsh e Suffolk, verificou que as médias de concentrações plasmáticas de progesterona durante as fases do ciclo estral das fêmeas SI, RM e SU foram de 0,45; 0,30 e 0,39 ng/mL no estro, 1,64; 1,91 e 1,88 ng/ mL no metaestro, 4,30; 4,86 e 4,33 ng/mL no diestro e 2,16; 2,33 e 1,47 ng/mL no proestro,
portanto valores sequenciais 1ng/mL caracterizam ciclicidade (SASA et al.,
2002).
Borregas da raça Santa Inês em atividade cíclica reprodutiva apresentam valores de progesterona que variam de 0,08 a 7,36 ng/mL ao longo do ciclo estral (SASA et al., 2002).
ng/mL para RM e 0,10 a 0,47 ng/mL para SU, valores <1ng/mL caracterizando que as fêmeas de ambas as raças encontram-se em anestro (SASA et al., 2002).
2.5 A progesterona exógena
Em 2002, Bicudo e colaboradores relataram o primeiro uso do CIDR em ovelhas no Brasil associado ao eCG na sincronização de estro durante a estação reprodutiva e obtiveram índices semelhantes após inseminações artificiais realizadas no estro sincronizado ou natural.
O pré-tratamento com progesterona pode levar a uma formação normal do corpo lúteo. A exposição por pelo menos 30 horas parece ser necessária, sendo que esta pode ser administrada através de injeções intramusculares, implantes subcutâneos ou esponjas intravaginais. Se tratadas com uma única injeção, a resposta é dependente da dose e da cronometragem da administração. Se for administrada por dispositivos intravaginais, a duração do tratamento é importante (ROSA & BRYANT, 2002).
A progesterona parece ser uma chave endócrina sinalizadora do controle de aumentos séricos periódicos nas concentrações de FSH e no número de ondas foliculares em ovelhas cíclicas (BARTLEWSKI et al., 2011).
A progesterona retarda o pico de LH ocasionando o desenvolvimento de folículos por um período mais longo de exposição à gonadotrofinas, assegurando que eles estejam maduros no momento da ovulação (ROSA & BRYANT, 2002).
O pré-tratamento com progesterona inibe o aumento no número de receptores de ocitocina endometriais e, consequentemente, a secreção de prostaglandina e a regressão prematura do CL. A primeira ovulação será acompanhada de demonstração de estro se a progesterona ou progestágeno forem administrados por 10 dias e a remoção da esponja ou a última injeção seja seguida da colocação do carneiro (COGNIE et al., 1982).
