Trabalho enviado para Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (Brazilian Journal of Veterinary and Animal Science), ISSN 0102-0935 (impresso) e 1678-4162 (on-line).
Normas de publicação disponível em www.abmvz.org.br.
Caracterização do crescimento folicular de borregas Santa Inês pré-púberes portadoras do gene FecGE.
Characterization of follicular growth on prepuberal Santa Inês ewe lambs with gene FecGE.
MonteiroToma, C.D.1; Bicudo, S.D.1; Rodello, L.1; Toma, H.S. 1,3; Macedo, F.G. 1; Gasparino, E.2; Macedo F.A.F. 2.
1-Department of Animal Reproduction- School of Veterinary Medicine and Animal Science - UNESP – Botucatu – SP – Brazil.
2-Departament of Animal Production – School of Veterinary Medicine – UEM – Maringá – PR – Brazil.
3- School of Veterinary Medicine – UNIC Cuiaba – MT - Brazil. E-mail: claudiadiasmonteiro@hotmail.com
Visou-se estudar em borregas Santa Inês de 20-24 semanas de idade, portadoras do gene FecGE, o desencadeamento da puberdade, crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com progesterona (CIDR®). As borregas experimentais Santa Inês de 20-24 semanas de idade possuíam 60% do peso adulto, e foram divididas em dois grupos, não portadoras (n=9, Grupo FecGE-) ou portadoras (n=7, Grupo FecGE+) do gene FecGE. Foram avaliados o desencadeamento da puberdade, crescimento folicular, ovulação e atividade lútea após tratamento com progesterona (CIDR®) por 12 dias em ambos os grupos. A condição pré-púbere das fêmeas foi detectada pela ausência de ciclicidade através de duas quantificações de progesterona pareadas com intervalo de sete dias. Durante o experimento as fêmeas foram submetidas a exames ultrassonográficos para avaliação do desenvolvimento do trato reprodutivo pela obtenção do maior diâmetro uterino, comprimento e largura dos ovários e crescimento folicular. A ciclicidade pós tratamento foi contatada pela avaliação do perfil de progesterona. Monitorou-se o desenvolvimento corporal através do peso, escore de condição corporal (ECC) e índice de massa corpóreo (IMC). Após estímulo com progesterona, 57% das borregas portadoras do gene FecGE passaram a ciclar, não houve diferença (P>0,05) entre o número total de folículos, número de folículos maiores
do que 3mm, tamanho do maior folículo aferido, comprimento e largura dos ovários e diâmetro maior dos cornos uterinos.
Palavras-chave: fêmeas ovinas, FecGE, progesterona, pré-puberdade.
1- Introdução
Em sistemas de produção que visem animais com aptidão para produção de carne, os cordeiros machos logo após o desmame ou com pouco tempo de confinamento são encaminhados ao abate, as fêmeas jovens de acordo com a época de nascimento permanecem no rebanho sendo alimentadas e manejadas até a estação de acasalamento no ano seguinte com idade superior a um ano, o que pode representar uma desvantagem econômica significativa (VILLAS BÔAS et al., 2003).
Métodos de seleção visando alterar a herdabilidade de características reprodutivas podem ser significativamente eficazes principalmente quando realizados com associação de genes e ou suas mutações (NOTTER, 2008).
O fator de crescimento e diferenciação (GDF9) e a proteína morfogenética do osso 15 (BMP15) são fatores de crescimento sintetizados no oócito, e estão associados a um aumento da taxa de ovulação em ovelhas. Cinco mutações no BMP15 e uma em GDF9 foram identificadas em ovelhas prolíficas Inverdale, Hanna, Belclare, Cambridge e Lacaune. Todas estas mutações apresentam o mesmo padrão; fêmeas heterozigotas são prolíficas e mutantes homozigotos são estéreis (MELO et al., 2008).
A Embrapa Cenargen detectou uma mutação nova (FecGE) que leva a uma substituição de uma fenilalanina por uma cisteína (F345C) no peptídeo da proteína GDF9. Esta mutação, quando em homozigose leva a um aumento na taxa ovulatória em ovelhas da raça Santa Inês (MELO et al., 2008).
Para melhor elucidação de eventos relacionados ao crescimento folicular, desenvolvimento final do trato reprodutivo de borregas Santa Inês e desencadeamento da puberdade em fêmeas ovinas Santa Inês portadoras do gene FEcGE este estudo foi desenvolvido.
2- Material e Métodos
Fizeram parte do experimento 16 borregas da raça Santa Inês, sendo 9 não portadoras do gene FecGE e 7 portadoras e, com idade entre 150 e 170 dias, peso entre
29,5±4,6 kg e IMC (MONTEIRO et al., 2010) 97,4±6,0 no grupo FecGE- e 36,4±2,9 kg e IMC 91,9±4,1 no grupo FecGE+ , no início do experimento.
Caracterização dos grupos experimentais
- Grupo FecGE-: fêmeas não portadoras do gene (n=9) submetidas por 12 dias a implantes intravaginais impregnados de progesterona (CIDR®).
- Grupo FecGE+: fêmeas ortadoras do gene (n=7) submetidas por 12 dias a implantes intravaginais impregnados de progesterona (CIDR®).
FIGURA 1- Linha Temporal do Experimento.
Caracterização dos momentos experimentais
Para avaliação dos efeitos do estímulo com a progesterona exógena sobre o desenvolvimento folicular e ciclicidade das fêmeas jovens, 3 momentos experimentais foram caracterizados:
- Período pré estímulo (PRE): biometria corporal para cálculo do IMC, coletas pareadas de sangue dos dois grupos para avaliação das concentrações plasmáticas de progesterona das borregas antes da administração hormonal exógena e exames seriados de ultrassonografia a cada 12 horas por 7 dias.
- Período de estímulo (EST):período de exposição à progesterona exógena, biometria
corporal para cálculo do IMC, mensuração do maior diâmetro uterino na ultrassonografia e coletas de sangue dos dois grupos, no início e fim do estímulo.
- Período pós estímulo (POS): exames seriados de ultrassonografia a cada 12 horas
por 6 dias, biometria corporal para cálculo do IMC, 3 coletas pareadas de sangue dos
CIDR US / 12h US / 12h P4 IMC P4 P4 P4 IMC D7 D14 D25 D26 D31 D0 D33 P4 UM IMC P4 UM IMC
dois grupos para avaliação das concentrações plasmáticas de progesterona das borregas após a administração hormonal exógena.
Critério de avaliação
Presença de atividade luteal: valores 1ng/mL de progesterona plasmática das fêmeas ovinas jovens dos três grupos em uma das dosagens pareadas dos 3 diferentes momentos: pré-estímulo (PRE), de estímulo (EST) e pós-estímulo (POS) foram considerados indicadores da funcionalidade luteal.
Dosagem hormonal
As colheitas de sangue foram realizadas por venopunção jugular, em tubos heparinizados, mantidos sob refrigeração até o momento de centrifugação a 1.200xg por dez minutos com separação do sobrenadante. O plasma assim obtido foi mantido sob congelação a 30ºC negativos até a quantificação hormonal.
As dosagens plasmáticas de progesterona foram realizadas por radioimunoensaio em fase sólida utilizando-se kits comerciais (DPC- Med Lab – Diagnostic Products Corporations) seguindo-se as recomendações do fabricante, sendo a leitura efetivada em um sistema automatizado de medida gamma (Gamma Count mod.5500, Beckman- USA). O erro intra-ensaio foi calculado a partir da inserção de três repetições em duplicatas, no inicio meio e fim do processo de dosagem, de uma amostra controle.
A precisão intra-ensaio foi determinada por cálculo probabilístico obtendo-se índice de reatividade (IR)= 58,50%; erro intra-ensáio (EIE)= 3,68%; dose mínima detectável (DMD)= 0,02ng/mL; coeficiente de correlação médio da curva de determinação (r)= 0,9981.
Análise estatística
Os dados são apresentados por meio da estatística descritiva e, para análise da distribuição dos valores de P4 foi utilizado o Rank test, Milcoxon com 5% de
ultrassonográfico não apresentaram distribuição normal pelo teste Kolmorogov-Smirnov e a distribuição dos dados não eram exatos, portanto foi utilizada a análise de variância (ANOVA), seguido do teste Kruskal-Wallis com significância de 5% com o programa Graphpad Prism® .
3- Resultados e Discussão
Os resultados referentes aos dados obtidos nos exames ultrassonográficos em relação ao diâmetro maior dos cornos uterinos nos períodos experimentais PRE e POS Estão dispostos na tabela a seguir (Tab. 1).
TABELA 1- Médias ± dp dos diâmetros (Ø) ultrassonográficos dos
cornos uterinos das borregas dos 2 grupos experimentais, nos períodos experimentais (PRE e POS).
Diâmetro do Corno Uterino (cm) PRE POS
Grupo Esquerdo Direito Esquerdo Direito
FecGE- 0,77±0,06 0,75±0,08 0,88±0,09b 0,89±0,09b FecGE+ 0,84±0,09 0,84±0,07 0,85±0,09b 0,83±0,11b
Média 0,81±0,05 0,80±0,06 0,87±0,02 0,86±0,04
Os resultados referentes aos dados obtidos nos exames ultrassonográficos em relação ao número e diâmetro máximo dos folículos ovarianos estão dispostos em forma de gráficos a seguir (Fig. 2-5).
FIGURA 2- Gráfico das médias do número total de folículos constatados
no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pré-estímulo (PRE).
FIGURA 3- Gráfico das médias do número total de folículos3,0 mm
constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pré-estímulo (PRE).
FIGURA 4- Gráfico das médias do número total de folículos
constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS).
FIGURA 5- Gráfico das médias do número total de folículos 3,0 mm
constatados no exame ultrassonográficos dos ovários das borregas do grupo FecGE- (n=9) e grupo FecGE+ (n=7), no período pós-estímulo (POS).
Não houve diferença estatística (P>0,05) entre e nos grupos dentro e entre os dias de exames em relação ao número total de folículos e número de folículos maiores do que 3mm aferidos na ultrassonografia, porém os gráficos sugerem o crescimento do número e de tamanho dos folículos ovarianos em ondas. O padrão de ondas é iniciado antes do início da puberdade em borregas e em ovelhas sexualmente maduras é interrompido apenas durante a gestação e período pós-parto (BARTLEWSKI et al., 2011).
TABELA 2- Médias ± dp do Índice de massa corporal das borregas do
no período experimental. IMC PRE POS Grupo D0 D7 D10 D18 I 97,36±5,99 103,42±5,66 101,38±6,36 106,68±6,30 II 91,91±4,08 100,45±4,36 100,15±4,37 102,87±5,83 Média 94,64±3,84 101,93±2,09 100,77±0,87 104,73±2,75 (P>0,05)
Não houve diferença estatística (P<0,05) entre e nos grupos dentro e entre os momentos PRE E POS, em relação ao IMC indicando a similaridade no desenvolvimento corporal dos dois grupos. Os valores de IMC obtidos são ligeiramente superiores aos obtidos por Monteiro et al (2010) em borregas mestiças que
desencadearam puberdade após tratamento com progestágenos. A nutrição adequada aumenta o número de pequenos e médios folículos responsivos a gonadotrofinas, e reduz a atresia entre folículos grandes dependentes de gonadotrofinas sem mudança no FSH, sugerindo que a nutrição influencia o número de folículos ovulatórios por aumentar o tamanho do grupo de folículos que respondem a gonadotrofina (MORRISON et al., 2002, SENGER, 2003; SCARAMUZZI et al., 2011).
TABELA 3- Borregas cíclicas nos momentos PRE, EST e POS, após tratamento com
CIDR®.
Grupo Fêmeas cíclicas*
PRE EST POS
FecGE- 0/9 (0%) 9/9 (100%) 2/9 (22%)a
FecGE+ 2/7(28%) 7/7 (100%) 4/7 (57%)b
* P4 plasmática maior que 1 ng/mL em pelo menos uma das dosagens pareadas em cada período experimental. Letras diferentes na linha representam diferença estatística (P<0,05).
Não houve diferença na maioria das mensurações realizadas no exame ultrassonográfico ao longo do experimento entre os grupos e entre os dias experimentais, pois os animais não apresentaram variação significativa nos valores de mensuração do ovário (comprimento e largura) e de folículos (maior folículo, número total de folículos e número de folículos maiores que 3 mm). Porém, apesar desta constatação houve diferença (P<0,05) entre os dois grupos em relação a distribuição dos valores de progesterona no Rank Test com 22% das borregas do grupo FecGE- e 57% do grupo FecGE+ estavam ciclando na última dosagem de progesterona plasmática no POSII.
Na pré-puberdade, apesar do eixo hipotalâmico-hipofisário competente, os folículos não chegam ao estádio pré-ovulatório, pois o perfil de liberação do LH é caracterizado por pulsos de baixa freqüência (SCHILLO et al., 1992). Há duas hipóteses que justificam o bloqueio da atividade gonadal, a “teoria gonadostática”, que enfatiza o exacerbado controle retrógrado negativo que o estradiol provoca no hipotálamo; e a “teoria neural” em que a inibição provocada pelos opióides endógenos suprime o sistema neural dopaminérgico (CARDOSO & NOGUEIRA, 2007). O controle retrógrado negativo exercido pelo estradiol sobre a secreção de gonadotrofinas pela hipófise é diminuído com avançar da idade e proximidade da puberdade (SCHILLO et al., 1992). Sendo assim, animais de raças portadoras de genes de prolificidade, quando
com status corporal adequado, por apresentarem um número maior de folículos recrutados, ou pré-ovulatórios e/ou ovulatórios poderiam apresentar esta fase de transição mais curta, com maior produção de estradiol pelos folículos e desencadear puberdade antes.
Porém neste experimento as borregas não apresentaram variação significativa nos valores de maior folículo, número total de folículos e número de folículos maiores que 3 mm entre o grupo portador e não portador do gene; sendo assim esta diferença na ciclicidade de animais do grupo FecGE+, de maneira precoce (antes do tratamento com progesterona, com 20 semanas de idade) em 2 fêmeas e após tratamento com progesterona em outras 2, pode estar relacionada à aptidão precoce em responder às gonadotrofinas.
Sabe-se que a redução da concentração de BMP15 e GDF9 altera ligeiramente a capacidade de resposta de células da granulosa ao FSH ou LH e que ovelhas de raças prolíficas parecem ter uma sensibilidade reduzida ao feed back negativo de estradiol (SCARAMUZZI et al., 2011). Além disso podem haver alterações na bioatividade do FSH (alterações no peso molecular e afinidade de receptor), de ocorrências individuais, independente do genótipo, associadas com mudanças no padrão de distribuição de isoformas de FSH, no período de desencadeamento da puberdade em ovelhas, coincidentes com alta frequência de liberação de GnRH e crescentes concentrações de estradiol (RAWLINGS et al., 2003).
Para um folículo alterar sua responsividade a gonadotrofina e para ficar maior do que 2,5 mm de diâmetro, é necessária a presença de FSH. As concentrações mais elevadas de FSH estimulam um aumento adicional da atividade da aromatase em células da granulosa. Folículos nesta fase dependente de gonadotrofinas têm uma maior exigência de FSH do que os gonadotrofina responsivos ou ovulatórios, uma característica que os distingue e torna-os mais vulneráveis a atresia. Em parte, isso pode explicar o fato de que o número de folículos maior que 2,5 mm de diâmetro é geralmente baixa e variável (entre 1 e 8). Mecanismos parácrinos e autócrinos parecem melhorar a sensibilidade dos folículos gonadotrofina dependentes ao FSH e resultam na expressão de receptores de LH nas células da granulosa (SCARAMUZZI et al., 1993).
A transformação de um folículo dependente de gonadotrofinas para um capaz de ovular requer uma baixa, mas crítica, concentração de FSH para a indução de maturação final de células da granulosa. A concentração crítica de FSH não é conhecida e é susceptível de variação entre e no mesmo animal (SCARAMUZZI et al., 1993).
A perspectiva tradicional sobre a relação entre oócito e folículo tem sido de que o oócito é passivo e que o seu crescimento e desenvolvimento são ditados pelo sistema endócrino e por células somáticas foliculares. No entanto, agora sabemos que o oócito não é simplesmente um passageiro no processo de foliculogênese. Nos ovinos, por exemplo, produz, pelo menos, dois fatores de crescimento (BMP15 e GDF) que regulam as primeiras fases do desenvolvimento folicular (SCARAMUZZI et al., 2011). Ovelhas portadoras do gene FecGE apresentam mutações pontuais no gene GDF9 que afetam sua atividade.
Sabe-se que em ovinos, raças prolíficas apresentam múltiplas ovulações decorrentes de mutações em genes relacionados a dois fatores de crescimento (BMP15 e GDF9) que regulam as primeiras fases de desenvolvimento folicular, este fato pode ser explicado em diferentes momentos.
Ovelhas de raças prolíficas podem apresentar diferenças na saída do pool de folículos primordiais, controlado por fatores inibitórios (SCARAMUZZI et al., 2011), este parâmetro é de difícil avaliação pois para folículos maiores do que 2 mm de diâmetro, a técnica de ultrassom é precisa, mas, abaixo desse limite, a resolução é insuficiente para fornecer dados de qualidade (BARTLEWSKI et al., 2011; SCARAMUZZI et al., 2011).
É evidente a partir de estudos morfológicos que folículos em algumas mutantes amadurecem e ovulam com diâmetros significativamente menores e com menor número de células da granulosa do que no tipo selvagem. Apesar da mutante homozigótica ovular 5-9 mais folículos em comparação com 1-2 nas do tipo selvagem, as taxas globais de secreção de esteróides e inibina podem ser semelhantes entre esses genótipos. Outra importante e relativamente sutil diferença é que os oócitos em homozigotas, ovelhas FecBB, atingem seu diâmetro maduro de 130 µm durante a fase pré-antral de desenvolvimento e os oócitos no tipo selvagem não atingem este diâmetro até depois da formação do antro. Evidências in vitro sugerem que as células da granulosa de mutantes FecBB desenvolvem antecipada responsividade ao FSH (em relação à síntese de AMP cíclico) e LH em células da granulosa do que em ovelhas selvagens (SCARAMUZZI et al., 2011).
A taxa de ovulação elevada em alguns raças prolíficas pode ser alcançada mediante a ovulação de folículos das duas últimas ondas do intervalo ovulatório. O fato de mais que um folículo adquirir capacidade de atingir tamanho ovulatório em uma única onda e os folículos de duas ondas consecutivas ovularem ao mesmo tempo sugere
que a dominância folicular é fraca na ovelha. Essas observações sugerem a existência de controle rítmico da secreção de FSH nos folículos e na emergência da onda em ovinos (BARTLEWSKI et al., 2011).
Ovelhas prolíficas tendem a produzir mais, mas menor corpo lúteo (CL) que tendem a diminuir as concentrações séricas de progesterona precocemente durante a fase luteal do ciclo estral em comparação com os genótipos menos prolíficos (BARTLEWSKI et al., 2011).
A janela de oportunidade pode ser definida como um período de tempo e / ou de sensibilidade do folículo ao FSH. Esta pode ser alargada se o limiar de FSH no folículo for abaixado, ou com a manutenção da concentração de FSH acima do nível limiar por maior período, sendo assim há mais tempo para a folículos crescerem acarretando em uma taxa de ovulação maior (SCARAMUZZI et al., 1993).
Outra forma que pode incrementar a taxa de ovulação é o aumento do número de folículos ovulatórios potencialmente disponíveis para passar através da ''janela'' do período pré-ovulatório, antes de ser fechada pela supressão de FSH abaixo do seu nível limiar. Neste caso, os níveis de FSH e os mecanismos de feedback são os mesmos em ovelhas com ovulações simples e múltiplas mas nestas, os folículos são mais sensíveis ao FSH e, portanto, se desenvolvem precocemente. Este é o caso para as ovelhas portadoras da mutação Booroola. Na realidade ambos os mecanismos podem operar simultaneamente em algumas raças altamente prolíficas, por exemplo, a raça Landrace finlandesa (SCARAMUZZI et al., 2011).
A média de dias da emergência da onda (definido como o dia em que os folículos em crescimento 5 mm de diâmetro foram detectados com 3 mm de diâmetro) foram: 0, 5, 9 e 12 após a ovulação para ovelhas não-prolíficas e 1, 6, 10 e 13 para as ovelhas prolíficas Finn. Notou-se que, em ovelhas Finn, os folículos antrais alcançam menores tamanhos máximos, e assim todas as anteriores fases do seu desenvolvimento, incluindo o recrutamento de folículos ocorreu com diâmetros menores. Em fêmeas prolíficas os folículos ovulatórios proveniente da penúltima onda parecem surgir cerca de 48 horas depois do que os não ovulatórios na mesma onda. Portanto, é possível que a regressão destes folículos seja impedida pelo próximo aumento sérico nas concentrações de FSH e/ou do aumento gradual da pulsatilidade de LH no pró-estro (BARTLEWSKI et al., 2011).
As concentrações de progesterona obtidas neste experimento são esperadas pois o aumento ocorre em torno de 3-4 dias do ciclo estral, isto é, 2-3 dias após a ovulação,
quando o corpo lúteo novo torna-se ativo. Concentrações máximas são observadas nos dias 10-12 e são mantidos até a luteólise que ocorre nos 14-15 dias. Na luteólise, a progesterona no sangue cai e dentro de 24 h após volta a alcançar os valores mais baixos durante o ciclo. As concentrações permanecem baixas durante todo a fase folicular até 2-3 dias depois da ovulação (SCARAMUZZI et al., 1993).
Concentrações muito baixas de progesterona ocorrem após a ovulação (dia 0) e o período de formação de CL é seguido por aumento nas concentrações entre os dias 3 e 7, com o platô até o dia 12 e, posteriormente, rápida diminuição alcançando um míimo valor antes do estro e da próxima ovulação (BARTLEWSKI et al., 2011).
Estudos recentes em ultrassonografia de ovelhas monitorados revelaram que mudanças no tamanho do CL estão correlacionadas com as concentrações de progesterona sérica apenas durante os pequenos períodos de formação do CL e luteólise (BARTLEWSKI et al., 2011).
Antes da primeira ovulação da estação de monta, as ovelhas exibem um aumento distinto na concentrações circulantes de progesterona, mas estruturas luteais podem não ser detectadas em alguns animais e folículos luteinizados anovulatórios podem ser vistos em outros. O aumento sérico nas concentrações de progesterona que antecedem o início da época de reprodução não altera o padrão de desenvolvimento folicular na onda, portanto, parece ser importante, principalmente para induzir o comportamento de estro, sincronizando-o com o aumento pré-ovulatório de LH, e impedindo luteólise prematura durante a fase lútea (BARTLEWSKI et al., 2011).
Deve-se destacar a importância deste estudo para o estabelecimento de um banco de dados referentes aos valores de comprimento e largura de ovário e acompanhamento da dinâmica folicular em borregas Santa Inês na pré-puberdade e no período de