Expressão em sistemas eucarióticos

Como a proteína HBx em fusão com a cauda de poli-histidina foi expressa predominantemente na fração insolúvel do lisado bacteriano, na forma de corpos de inclusão, resolveu-se testar a expressão da proteína HBx em sistemas eucarióticos com o intuito de obter proteína solúvel. Desta forma, o cDNA da proteína HBx foi clonado no plasmídeo pBSV-8His, para a expressão da proteína HBx em células de inseto Sf9, utilizando o sistema de Baculovírus, e no plasmídeo pPIC9K, para a expressão da proteína HBx em leveduras Pichia pastoris linhagem KM71.

A expressão de proteínas em células de inseto através do sistema de Baculovírus possui inúmeras vantagens quando comparada com a expressão em bactérias, uma vez que muitas modificações pós-traducionais podem ocorrer em Baculovírus como, por exemplo, fosforilação, glicosilação, clivagem proteolítica, entre outras. Além disto, as

proteínas recombinantes são superexpressas na sua forma enovelada, com a formação de ligações de dissulfeto e oligomerizações (O’ Reilly, 1994).

O sistema de Baculovírus consiste na inserção do gene de interesse (cDNA da HBx) no DNA do baculovírus (família Baculoviridae), geralmente no lugar do gene que codifica a proteína polihedrina. Para a produção do vírus recombinante são necessárias duas etapas: a construção do plasmídeo (no caso, o pBSV-8His/HBx) e a produção do baculovírus recombinante. Em seguida, as células de inseto Sf9 (Spodoptera frugiperda) são transfectadas com o vírus recombinante para a sua replicação nas células, uma vez que os insetos são os hospedeiros naturais dos baculovírus (Crossen & Gruenwald, 1998). Neste trabalho, o plasmídeo pBSV-8His foi utilizado para a produção do vírus recombinante porque possui um promotor forte (polihedrin) e uma seqüência que codifica o peptídeo sinal do fator humano H. O peptídeo sinal em fusão com a porção N terminal da HBx permite a secreção da proteína para o meio de cultura (Kühn & Zipfel, 1995).

Após a transfecção das células de inseto Sf9 com o plasmídeo pBSV-8His/HBx(1- 142) (Tabela 9), as células de inseto apresentaram alterações morfológicas indicativas de uma transfecção bem sucedida. Os vírus recombinantes diferem dos vírus selvagens porque aqueles não apresentam corpos de oclusão, de modo que os vírus recombinantes são coletados para a infecção de novas células de inseto Sf9 em larga escala, com o intuito de expressar a proteína HBx recombinante.

Após quatro dias de infecção, as células de inseto Sf9 transfectadas foram lisadas, e as frações solúveis e insolúveis foram analisadas por Western blot anti-His para verificar a presença da proteína 6xHis-HBx(1-142). No entanto, nenhuma banda relativa à proteína de fusão foi observada no WB (dados não mostrados). Provavelmente, a expressão da proteína 6xHis-HBx(1-142) em células de inseto Sf9 tenha sido muito baixa, e uma quantidade maior de vírus recombinante seria necessária para infectar um maior número de células e, assim, obter uma quantidade de proteína HBx detectável.

O próximo passo foi escolher o sistema de expressão em Pichia pastoris com o intuito de obter proteína solúvel e em quantidade, uma vez que a expressão em P.

pastoris é cerca de 10-100 vezes maior do que em E. coli. Outra vantagem do sistema de

número reduzido de proteínas contaminantes (proteínas intrínsecas da levedura), uma vez que a indução da expressão é controlada pela adição de metanol. O plasmídeo pPIC9K foi escolhido para a expressão das proteínas HBx porque as proteínas são secretadas para o meio de cultura, facilitando a purificação das proteínas de fusão 6xHis-HBx(1-154) e 6xHis-mini-HBx(19-142) por cromatografia de afinidade.

Após a transformação das leveduras Pichia pastoris linhagem KM71 com os plasmídeos pPIC9K, pPIC9K/His-HBx(1-154) e pPIC9K/His-mini-HBx(19-142) (Tabela 9), cerca de 137 transformantes cresceram em placas MD e foram selecionados em placas YPD/G418. Os 57 clones selecionados em placas YPD/G418 foram repicados em placas MD e MM, e apenas quatro clones foram selecionados para os testes de indução: clone 14 (plasmídeo vazio pPIC9K), clones 40 e 41 (plasmídeo pPIC9K/6xHis-HBx(1-154)) e clone 48 (plasmídeo pPIC9K/6xHis-mini-HBx(19-142)). A linhagem KM71 foi utilizada como controle negativo, assim como o clone 14 (plasmídeo vazio pPIC9K).

Como o plasmídeo pPIC9K foi utilizado para a expressão secretada das proteínas de fusão 6xHis-HBx(1-154) e 6xHis-mini-HBx(19-142), o tampão BMGY/BMMY se mostrou mais adequado para os testes de indução da expressão das proteínas. O tampão BMGY/BMMY possui extrato de levedura e peptona em sua composição, o que ajuda a estabilizar as proteínas secretadas e diminui e/ou previne a proteólise destas.

Analisando o SDS-PAGE da indução por metanol dos plasmídeos pPIC9K/6xHis- HBx(1-154) (clones 40 e 41) e pPIC9K/6xHis-mini-HBx(19-142) (clone 48) em P.

pastoris, observou-se que não houve indução de proteína HBx na fração solúvel do 2° ao

5° dia de indução (dados não mostrados). Uma mini-purificação da fração solúvel através de cromatografia de afinidade em Ni-NTA seguida de um Western blot anti-His e anti- HBx da mini-purificação não indicou a presença de sinais relativos às proteínas de fusão 6xHis-HBx(1-154) (~18 kDa) e 6xHis-mini-HBx(19-142) (15,6 kDa) na fração solúvel (dados não mostrados).

Como não foi observada a expressão de proteína HBx em células de inseto Sf9 e em leveduras P. pastoris, resolveu-se testar outras condições de indução da expressão de proteína HBx em E. coli com o objetivo de obter proteína na fração solúvel do lisado bacteriano, através da fusão com a cauda de poli-histidina ou com a proteína GST.