Modelagem molecular da proteína HBx por homologia

Através do programa BLASTp foi possível encontrar uma proteína com estrutura tridimensional resolvida por cristalografia de raios-X, que apresentou 25% de identidade com o fragmento da proteína mini-HBx(-Cys)(7-91). A proteína lipoamida desidrogenase (LipDH) (código de acesso no PDB: 3lad) foi utilizada como “ molde” para a construção do modelo do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91). A proteína LipDH pertence à família das dissulfeto oxidoredutases da qual também faz parte a enzima glutationa redutase, uma enzima ativa na forma dimérica que contém uma ponte de dissulfeto envolvida na catálise (Mattevi et al., 1991).

O alinhamento da seqüência primária e da predição de estrutura secundária do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) com a proteína “ molde” LipDH foi manualmente refinado (Figura 65), e cinco modelos foram gerados utilizando-se o programa MODELLER. Os cinco modelos gerados para o fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) foram avaliados pelo pacote de programas PROCHECK, e apenas um modelo apresentou mais de 88% dos resíduos nas regiões mais favorecidas no gráfico de Ramachandran (Figura 66). Outros parâmetros foram avaliados pelo PROCHECK (Figura 67) e o modelo da proteína foi visualizado pelo programa InsightII (Figura 68).

Mini-HBx(-Cys): 7 SSGRPFSGSLGTLSSPSPSAVP-TDHGAHLSLRGLPVSAFSSAGPSALRF-TSARRMETTV 66

LipDH:388 ASGRAMAAN-DTAGFVKVIADAKTDRVLGVHVIGPSAAELVQQGAIAMEFGTSAEDLGMMV 447

Mini-HBx(-Cys): 67 NAHRMLPKVLHKRTLGLSAMSTTDL 91

LipDH: 448 FAHPALSEALHEAALAVSGHAIHVA 472

Figura 65 - Alinhamento refinado manualmente das seqüências primárias do fragmento

mini-HBx(-Cys)(7-91) e da proteína LipDH(388-472), indicando as regiões com estrutura secundária. Em vermelho estão representadas as regiões com estrutura secundária em alfa-hélice e, em azul, as regiões em folha beta. A identidade entre as seqüências primárias é de 25% e a similaridade é de 36%.

 

Figura 66 - Gráfico de Ramachandran que avalia a qualidade esteroquímica do modelo

do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) gerado através do programa MODELLER. Cerca de 60 resíduos de aminoácidos (88,2%) estão nas regiões mais favorecidas, 8 resíduos (11,8%) estão nas regiões adicionais permitidas, e nenhum resíduo está nas regiões proibidas. O número total de resíduos de aminoácidos do modelo do fragmento mini- HBx(-Cys)(7-91) é de 84.

 

Figura 67 – Parâmetros das propriedades dos resíduos do modelo do fragmento mini-

HBx(-Cys)(7-91) gerado através do programa MODELLER e analisado pelo pacote de programas PROCHECK. A) Assinalamento da estrutura secundária do fragmento mini-

HBx(-Cys)(7-91), indicando as regiões de maior acessibilidade ao solvente (regiões azuis mais claras) e as mais “ escondidas” (regiões azuis mais escuras). B) Detalhamento do

gráfico de Ramachandran, indicando os resíduos localizados nas regiões mais favorecidas (triângulos azuis), regiões permitidas (quadrados verdes) e generosamente permitidas (retângulo lilás).

A

B

Figura 68 – Superfície de acessibilidade ao solvente e representação em fita do modelo

do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) gerado através do programa MODELLER e visualizado pelo programa InsightII. Em (A) está representado um lado da superfície

acessível ao solvente, e em (B) a sua rotação em 180 graus no eixo y. Estão destacados os

resíduos de fenilalanina (em amarelo), metionina (em vermelho), leucina e valina (em laranja).



A representação da superfície de contorno do modelo do fragmento da proteína mini-HBx(-Cys)(7-91) indicou que os resíduos das 3 fenilalaninas (em amarelo), das 11 leucinas e 4 valinas (em laranja) e das 3 metioninas (em vermelho) encontravam-se próximos, formando uma superfície com caráter hidrofóbico (Figura 68). Através do programa WebLab Viewer foi possível visualizar a superfície eletrostática do modelo do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91), e observou-se que as cargas positivas (em azul) estavam distanciadas das cargas negativas (em vermelho) (Figura 69).

A

B

Figura 69 – Superfície eletrostática do modelo do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91)

gerado através do programa MODELLER e visualizado pelo programa WebLab Viewer. Em (A) está representada superfície eletrostática do modelo gerado, mostrando as cargas

positivas (em azul) e negativas (em vermelho). Em (B) a representação em fita do modelo

do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) inserido na superfície eletrostática.

Os resíduos Ser2, Ser37 e Ser45 presentes na seqüência primária do fragmento mini-HBx(-Cys)(7-91) foram substituídos por resíduos de cisteína para gerar a seqüência primária do fragmento mini-HBx(7-91), e esta seqüência foi alinhada com a proteína LipDH(388-472). O alinhamento foi submetido ao programa MODELLER, que gerou

cinco modelos do fragmento mini-HBx(7-91) e, após avaliação pelo pacote de programas PROCHECK, apenas um modelo apresentou mais de 86% dos resíduos nas regiões mais favorecidas no gráfico de Ramachandran, e nenhum resíduo na região proibida (dados não mostrados). O modelo da proteína mini-HBx(7-91) foi visualizado pelo programa InsightII (Figura 70), e observou-se que os resíduos de fenilalanina, metionina, leucina e valina formam uma superfície hidrofóbica.

A

B

Figura 70 – Superfície de acessibilidade ao solvente e representação em fita do modelo

do fragmento mini-HBx(7-91) gerado através do programa MODELLER e visualizado pelo programa InsightII. Em (A) está representado um lado da superfície acessível ao

azul claro), fenilalaninas (em verde), metioninas (em azul royal), leucinas e valinas (em amarelo).

Entretanto, observou-se que no modelo do fragmento mini-HBx(7-91) (Figura 70) os resíduos de cisteína (Cys2, Cys37 e Cys45) estavam orientados para fora, de modo que os resíduos de cisteína Cys37 e Cys45 encontravam-se na região de alfa-hélice (Figura 70, em azul claro). Estes resíduos de cisteína poderiam formar pontes de dissulfeto com outros resíduos de cisteína presentes na outra parte da proteína HBx (que não está presente no modelo gerado), ou com outros resíduos de cisteína de outras proteínas, formando dímeros, trímeros ou oligômeros.

Os resíduos de cisteína Cys2, Cys37 e Cys45 presentes no fragmento mini- HBx(7-91) correspondem aos resíduos Cys26, Cys61 e Cys69 da proteína HBx(1-154) completa. É interessante notar que, além de estarem numa região do modelo que apresenta estrutura secundária em alfa-hélice, os resíduos Cys61 e Cys69 são conservados em várias proteínas HBx de vários hepadnavírus que infectam mamíferos (Gupta et al., 1995).

Os fragmentos mini-HBx(-Cys)(7-91) e mini-HBx(7-91) que foram modelados a partir da proteína LipDH(388-472) compreendem os resíduos de aminoácidos 25 a 108 da proteína HBx(1-154) completa. Como estes resíduos estão contidos na região responsável pela atividade de trans-ativação da proteína HBx (Kumar et al., 1996), sua localização topológica nos modelos gerados poderia fornecer um embasamento para o fato da proteína HBx interagir com uma grande variedade de proteínas celulares, seja através da formação de pontes de dissulfeto, ou através do contato com as variadas proteínas através de sua superfície hidrofóbica.