Purificação e análise de proteína recombinante

3.4.1 Purificação das proteínas por cromatografia de afinidade

A purificação das proteínas de fusão baseou-se em dois sistemas de cromatografia de afinidade: o sistema His-tag, para a purificação das proteínas em fusão com a cauda de poli-histidina, e o sistema GST, para a purificação das proteínas fusionadas à proteína glutationa-S-transferase (GST).

26 _{meio DME/SGH: Dulbecco`s Modified Eagle`s Médium acrescido de 10% de soro fetal bovino, 2 mM de}

glutamina e 250 µg/mL de higromicina

3.4.1.1 Proteínas em fusão com a cauda de poli-histidina

As proteínas fusionadas à cauda de poli-histidina presentes nas frações insolúveis dos lisados bacterianos foram solubilizadas em tampão de extração28, antes de serem purificadas em coluna de afinidade, à temperatura ambiente, utilizando-se a resina comercial Ni-NTA (Nitrilo triacetato) Agarose Beads. Os protocolos detalhados estão descritos no manual de instrução que acompanha o produto (QIAExpressionist Ni-NTA

Protein Purification System – QIAgen).

As amostras de proteínas 6xHis-HBx(1-154), 6xHis-mini-HBx(19-142) e 6xHis- mini-HBx(-Cys)(19-142) foram filtradas (0,22 µm) e degaseadas antes da purificação. A purificação foi realizada em condições desnaturantes (uréia 8 M), e os tampões utilizados foram previamente filtrados antes de serem degaseados em bomba de vácuo por 15 minutos. Aplicou-se 1 mL de resina de Ni-NTA à coluna de vidro, para cada litro de cultura induzido, utilizando-se um FPLC/AKTA Purifier para o empacotamento da resina, que foi equilibrada com o tampão de extração. Após a aplicação da fração insolúvel do lisado (proteínas desnaturadas), lavou-se a coluna com o tampão de extração no pH 6,3. As proteínas de fusão foram eluídas com o tampão de extração no pH 4,5, e coletadas em

eppendorfs de 1,5 mL, para posterior análise das frações através de SDS-PAGE e de Western blot.

3.4.1.1.1 Renaturação das proteínas recombinantes

As frações oriundas da purificação (sob condições desnaturantes) das proteínas HBx foram dialisadas contra 500 mL de diferentes tampões renaturantes (Tabela 8), utilizando membranas semi-permeáveis de 12000 Da. As diálises foram realizadas sob agitação lenta, a 4 oC, com pelo menos de 2 a 5 trocas de tampão a cada 8-12 horas (Rudolph et al., 1998).

As diálises contra os tampões D, F, H e I foram seqüenciais, de modo que concentrações decrescentes de uréia (6, 4, 3, 2, 1, e 0,1 M) foram adicionadas aos tampões durante as trocas consecutivas (Rudolph & De Bernardez Clark, 1999). No caso dos outros tampões listados na tabela 8, as diálises foram realizadas de forma direta, sem a adição de uréia. Após as diálises diretas ou seqüenciais, as proteínas foram clareadas

por centrifugação a 2000 x g e utilizadas nos ensaios de interação proteína- oligonucleotídeo de RNA (item 3.5.1) e nos ensaios espectroscópicos (item 3.6).

Tabela 8 – Tampões utilizados para a renaturação das proteínas HBx em fusão com a

cauda de poli-histidina. Tampão Composição A água, pH 6,0 B 10 mM Pipes, pH 6,0 C 10 mM Pipes, pH 7,0 D 10 mM Pipes, 1 mM DTT, pH 7,0

E PGDE (25 mM Pipes, 50 mM KCl, 80 mM NaCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2- mercaptoetanol, 0,1% Triton X-100, 5% glicerol), pH 6,0

F 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 8,0

G 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM NaH2PO4, pH 8,5

H 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM NaH2PO4, 1 mM DTT, pH 8,5

I 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2-mercaptoetanol, pH 8,0

J 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0,2 mM GSSG, pH 8,0

K Acetato de sódio/ácido acético, pH 5,6

3.4.1.2 Proteínas em fusão com a proteína GST

As proteínas GST, GST-HBx(5-154), GST-HBx(5-78), GST-HBx(80-142), GST- p53(1-393), provenientes da fração solúvel do lisado de bactérias, foram purificadas por cromatografia de afinidade, à temperatura ambiente, utilizando-se a resina comercial

glutatione sepharose 4B.

As amostras de proteína e os tampões utilizados na purificação foram previamente filtrados (0,22 µm) e degaseados em bomba de vácuo por 15 minutos. Aplicou-se 1 mL de resina à coluna de vidro, para cada litro de cultura induzido, utilizando-se um FPLC/AKTA Purifier para o empacotamento da resina, que foi equilibrada com o tampão PBS15_{. Após a aplicação da fração solúvel do lisado, as proteínas em fusão com a}

proteína GST foram eluídas com o tampão PBS contendo 10 mM de glutationa reduzida. As frações da purificação foram coletadas em eppendorfs de 1,5 mL, para posterior análise através de SDS-PAGE e de Western blot.

3.4.2 Análise de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Alíquotas das frações solúveis e insolúveis dos lisados bacterianos e das frações purificadas (em coluna de Ni-NTA ou de glutathione sepharose 4B) foram analisadas por SDS-PAGE, em géis de poliacrilamida a 10% ou 12,5%. As amostras foram diluídas na proporção de 1:1 com tampão de amostra24, e foram desnaturadas a 95 oC, por cinco minutos, antes de serem aplicadas nos géis. As eletroforeses foram corridas à temperatura ambiente a 25 mA, por cerca de 1 hora, utilizando como tampão de corrida o tampão Tris-glicina29_{. Após a eletroforese, os géis de poliacrilamida foram corados por 20}

minutos em uma solução de Coomassie Blue Staining30_{, e descorados em solução de 5%}

de ácido acético e 12,5% de metanol.

3.4.2.1 Western blot

As amostras de proteína foram separadas em géis de poliacrilamida a 10% ou a 12,5%. Após a eletroforese, o gel a ser transferido foi incubado na solução Ânodo II31 por cinco minutos. A membrana de PVDF ImmobilonTM_{-P foi pré-incubada em metanol e}

lavada com água estéril antes do uso.

Utilizou-se o sistema Semi-Dry Blotting System para a transferência das proteínas contidas no gel para a membrana de PVDF. Em contato com o ânodo do aparelho de transferência, foram colocados dois papéis (Whatman 3MM) embebidos na solução Ânodo I32, e sobre estes um papel embebido na solução Ânodo II. Seguindo a montagem do “sanduíche”, colocou-se a membrana (pré-incubada em metanol e lavada com água estéril), o gel de poliacrilamida a ser transferido e três papéis embebidos no tampão Cátodo33, que foram colocados em contato com o pólo negativo do aparelho de transferência. O tempo de transferência variou entre 1 hora e 1 hora e 30 minutos, a 50 mA por membrana.

29 _{Tris-glicina: 25 mM Tris base; 250 mM glicina; 0,1% (w/v) SDS}

30 _{solução de Coomassie Blue Staining: 50% (v/v) metanol, 10% (v/v) ácido acético e 0,25% (v/v)}

Commassie Blue

31 _{solução Ânodo II: 25 mM Tris-HCl pH 8, 20% metanol}

32 _{solução Ânodo I: 300 mM Tris-HCl pH 8,0, 20% metanol}

Após a transferência, o “sanduíche” foi desmontado e a membrana foi bloqueada com uma solução contendo 5% de BSA e 0,1% de Tween-20 em tampão TBS 1X34 e incubada à temperatura ambiente por 3 horas, ou a 4 oC por 18 horas. Depois da incubação em BSA, a membrana foi lavada três vezes com TBS 1X, antes da sua incubação, à temperatura ambiente, com os anticorpos primários anti-GST ou anti-penta His (diluídos 1:3000 em TBS 1X) ou com o anti-soro anti-HBx (diluído 1:100 em TBS 1X). Após duas horas de incubação, a membrana foi lavada três vezes com TBS 1X, e incubada por 2 horas com o anticorpo secundário anti-mouse-IgG (para os anticorpos primários anti-GST ou anti-penta His) ou com o anticorpo secundário anti-rabbit-IgG (para o anti-soro anti-HBx), diluídos 1:5000 em tampão TBS 1X.

Após a incubação com o anticorpo secundário, a membrana foi lavada três vezes com TBS 1X, antes da revelação utilizando o Western Blotting Luminol Reagent, de acordo com as especificações do fabricante. A exposição da membrana ao filme X- OMAT foi feita por intervalos de tempo de 30 segundos a 2 minutos, e depois os filmes foram revelados.