PELE DO PEIXE BALISTES CAPRISCUS.
Trabalho a ser enviado para o periódico Food Hydrocolloids, Qualis A2
RESUMO
A pele do peixe é um resíduo comumente descartado. Porém, a gelatina extraída da pele de peixes tem aplicação ampla na indústria de alimentos, farmacêutica, etc. O cangulo (Balistes capriscus) é um peixe de carne bastante apreciada e que possui uma pele diferenciada pela sua rigidez. Nesse estudo, a gelatina da pele do cangulo foi caracterizada quanto a estrutura química e atividades antifúngica, antioxidante e de inibição da enzima acetilcolinesterase. A gelatina extraída da pele do peixe em Soxhlet, com água, apresentou 61% de proteínas, com massas moleculares variando de 37 a 150 KDa. Os grupos amida foram identificados no espectro de IV, e o espectro de RMN1H demonstrou os sinais de prótons atribuídos à ressonância de grupamentos metila correspondentes aos aminoácidos mais abundantes como alanina, treonina, arginina, ácido aspártico, lisina, prolina e fenilalanina. A gelatina demonstrou atividades anticolinesterásica, antifúngica e antioxidante que valorizam este material.
ABSTRACT
Fish skin is a commonly discarded residue. However, gelatine extracted from fish skin has wide application in the food, pharmaceutical industry, etc. The cangulo (Baliste capriscus) presents a meat very appreciated and has a skin differentiated by its rigidity. In this study, the skin gelatin of cangulo was characterized by the chemical structure and activities antimicrobial, antioxidant and inhibition of the enzyme acetylcholinesterase. Gelatin extracted from fish skin in soxhlet with water, presented 61% proteins and molecular masses ranging from 37 to 150 KDa. The amide groups were identified on the IR spectrum and the 1H NMR spectrum showed the proton signals attributed to the resonance of methyl groups corresponding to the most abundant amino acids such as alanine, threonine, arginine, aspartic acid, lysine, proline and phenylalanine. Gelatine has demonstrated anticholinesterasic, antifungal and antioxidant and activities that value this material.
Introdução
Dentre os resíduos de pescado, a pele corresponde de 4,5 a 10 % do peso corporal. Essa variação deve-se a espécie de peixe e forma de sua retirada (método de filetagem) (SOUZA, 2008). Assim como outros subprodutos, cabeça, ossos e vísceras, as peles dos peixes são geralmente descartadas.
A pele do peixe é formada principalmente por uma massa elástica, composta de proteínas de alto peso molecular, e tem uma alta concentração de proteínas do tecido conjuntivo, o colágeno (JAYATHILAKAN et al., 2012).
A espécies B. capriscus, da família Balistidae, é conhecida como peixe-cangulo
nas regiões Norte e Nordeste do Brasil, ou ainda como peixe-porco, no Sul do país e sua carne é de excelente qualidade. Possui uma pele grossa, com aspecto de couraça, que é utilizada na medicina popular para o tratamento de asma brônquica, pelo efeito vaso-dilatador do chá da sua pele (ALVES; ALVES, 2011; BARBOZA et al., 2014; BASTOS et al., 2006a; BASTOS et al., 2006b; CAVALLI et al. 2003).
A gelatina extraída da pele de peixes é considerada um importante biopolímero, que tem uma aplicação muito ampla na indústria de alimentos, de novos materiais e farmacêutica, como biofilmes, produção de embalagens biodegradáveis, material de parede na produção de cápsulas e micropartículas, e ainda está se expandindo para novas aplicações, como alimentos funcionais (GÓMEZ-GUILLÉN et al., 2002; KARIM; BHAT, 2009; ZHOU, MULVANEY; REGENSTEIN, 2007).
Ao contrário das gelatinas de mamíferos, a quantidade de informações sobre as propriedades das gelatinas de peles de peixes necessita ser ampliada, visando aumentar a sua utilização (GUDMUNDSSON, 2002).
Nesse estudo, a gelatina da pele de B. capriscus foi extraída e caracterizada quimicamente, assim como foram analisadas as atividades antifúngica, antioxidante e de inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE).
Material e métodos
Coleta e preparo das amostras
As amostras do pescado foram adquiridas junto a pescadores locais, na Av. Beira Mar, Fortaleza-Ce, no mês de julho de 2018, totalizando três espécimes. Após escamação, as peles (40 g) foram separadas dos músculos por filetagem manual e mantidas em freezer (-18 °C) até o momento da extração da gelatina.
Preparação da gelatina
Previamente ao procedimento de extração da gelatina, foi feita uma lavagem das peles com água corrente em abundância.
As peles lavadas foram cortadas em pedaços menores e colocadas em sistema de extração de Soxhlet, por um período de 8 horas, sob refluxo, utilizando água destilada como solvente (SILVA et al., 2018).
O material obtido foi congelado e levado para liofilizar em equipamento modelo L101, da marca Liotop, onde permaneceu até a retirada total da água, aproximadamente 72 horas.
Em seguida, a solução saturada do material foi dialisada em água destilada utilizando-se uma membrana com limite de exclusão de 12 KDa por 7 dias, sendo a água trocada em períodos de 24h.
Análise da quantificação das proteínas
A concentração de proteína solúvel foi determinada utilizando-se o reagente de Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), com padrão de albumina de soro bovino (BSA) e os extratos mantidos a -20 °C. Um padrão de proteína (BSA) foi preparado em doze diluições, entre 2000 e 0,48 ug.mL-1. A determinação da concentração de
proteína foi realizada em triplicata. Utilizou-se o leitor Elisa BIOTEK, modelo ELX 800, software “Gen5 V2.04.11”, baseando-se na metodologia descrita por Bradford (1976). A ligação do corante à proteína provoca uma mudança no máximo de absorção do corante de 465 para 595 nm, assim sendo a absorbância foi aferida a 490 nm.
Eletroforese em condição desnaturante em gel de poliacrilamida – SDS PAGE
A separação de proteínas pelo método SDS-PAGE consiste na migração de proteínas em uma matriz em gel de poliacrilamida, induzida por diferença de potencial elétrico.
Foram preparadas diferentes amostras do material, com diferença apenas nas concentrações e adicionadas a igual volume de solução tampão (glicerol 10%, β- mercaptoetanol 5%, SDS 2,3%, Tris-HCl pH 6,8 0,0625 M). Após fervura de três minutos e rápida centrifugação, foram aplicadas no gel. Os géis de 12% de SDS- poliacrilamida (LAEMMLI, 1970), confeccionados com 1 mm de espessura, foram submetidos a uma diferença de potencial de 120V, com uma corrente constante em um sistema de mini-gel, Mini-Protean 3, da Bio-RAd.
Após a corrida, os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue.
Análise por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H)
O espectro de RMN 1H foi obtido utilizando-se Espectrômetros da Bruker, modelo Avance DPX –300 e modelo Avance DRX-500, que operam na frequência de 300,15 e 499,6 MHz para hidrogênio, respectivamente. A dissolução da amostra analisada foi realizada utilizando água deuterada (D2O) como solvente.
Análise por Espectroscopia de Infravermelho (IV)
Os espectros de IV foram obtidos utilizando-se espectrômetro modelo Nicolet iS5 da Thermo Scientific. As amostras foram preparadas na forma de pastilhas de KBr na proporção de 1:20 (m/m) (amostra:KBr) e os espectros registrados no intervalo de 4000 a 400 cm-1, empregando-se 32 scans e resolução de 4cm-1.
Avaliação da atividade antifúngica
Para os ensaios da atividade antifúngica foi utilizado o método de microdiluição em caldo, conforme as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI , 2008). No ensaio para verificação da concentração inibitória mínima (CIM) foram
utilizadas quatro cepas de leveduras do gênero Candida spp. inoculadas em ágar batata dextrose.
A suspensão fúngica para leveduras foi obtida por diluição 1:100 seguida de uma diluição 1:20 da suspensão padrão com meio líquido RPMI 1640, com L- glutamina, sem bicarbonato de sódio, tamponado a pH 7,0 com MOPS (ácido 2-[N- morfolino]-propanosulfônico; MPOS 0,165M), de modo a resultar nas concentrações de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 UFC.mL-1.
Para o teste de microdiluição em caldo foi inoculado 100 μL de meio RPMI estéril em cada poço da placa de microdiluição, seguidos de 100 μL da amostra adicionados à primeira coluna de micropoços, a partir da qual foram realizadas diluições seriadas até a coluna 11. Também foram adicionados 100 μL da suspensão fúngica em todos os poços. Como controle foi utilizado a anfotericina B. Os poços controles de crescimento fúngico apresentaram 100 μL de meio estéril, isento de droga, acrescidos com 100 μL das suspensões de inóculos. A concentração fungicida mínima (CFM) foi determinada por subcultura de 100 μL da solução de poços sem turbidez no meio Ágar dextrose de batata, a 28°C. (FONTENELLE et al. 2008).
As placas foram incubadas a 35 ºC durante 48 horas, após os quais foi realizada a leitura visual das placas, observando-se a redução macroscópica do crescimento fúngico. A CIM foi definida pela menor fração teste capaz de inibir o crescimento fúngico visualmente detectado (FONTENELLE et al., 2008).
Avaliação da atividade antioxidante via redução do radical DPPH
A atividade antioxidante foi avaliada usando método descrito por Carvalho et al. (2009), com modificações. Diluições seriadas das amostras e controle, em metanol, foram preparadas, para obter as seguintes concentrações: 3,125, 6,25, 12,5, 25,0, 50,0 e 100 𝜇g / mL. Então, 2mL de DPPH (0,004%) foi adicionado. O etanol foi usado como controle negativo. Após um período de 30 minutos no escuro, a absorbância foi medida a 517 nm usando um espectrofotômetro UV-VIS. A porcentagem de inibição foi calculada de acordo com a equação: IP% = [(absorbância do DPPH - absorbância do material) / absorbância do DPPH] × 100. Os valores de IC50 foram determinados pela regressão linear dos dados plotados.
Avaliação da atividade inibidora da acetilcolinesterase
A atividade inibitória da AChE foi quantitativamente medida com base no método descrito por Ellman et al. (1961) modificado por Trevisan et al. (2003), utilizando um leitor de microplacas Elisa BIOTEK (modelo ELX 800 com o software Gen5 V2.04.11). Em placa de 96 poços, foram utilizadas as seguintes soluções por poço: 25 µL de iodeto de acetiltiocolina (15 mM), 125 µL de 5,5’–ditiobis-[2- nitrobenzóico] na solução Tris/HCL (50mM, pH=8), com 0,1 M de NaCl e 0,02 M de MgCl2 .6H2O. (3 mM, DTNB ou reagente de Ellman), 50 µL da solução Tris/HCL (50 mM, pH=8), com 0,1% de albumina sérica bovina (BSA), 25 µL da amostra dissolvida em acetato de etila e diluída 10 vezes na solução Tris/HCl (50 mM, pH=8) para obter uma concentração final de 0,2 mg.mL-1 (RHEE et al. 2001, TREVISAN et al. 2003).
A absorbância foi aferida a 405 nm durante 30 segundos, e em seguida foram adicionados 25 µL da enzima acetilcolinesterase e a absorbância foi aferida por minuto até o total de 25 minutos de incubação da enzima. O padrão utilizado como controle positivo foi a fisostigmina. Como padrão negativo foram utilizadas todas as soluções, excetuando-se a amostra. As diluições das amostras e dos padrões positivos utilizadas nas avaliações quantitativas em microplaca, que partiram de solução mãe com concentração de 20 mg/mL foram: 200 µg.mL-1, 100 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 25 µg.mL-1, 12,5 µg.mL-1, 6,25 µg.mL-1, 3,12 µg.mL-1, 1,56 µg.mL-1, e 0,78 µg.mL-1.
As análises foram realizadas em triplicata, e após normalização dos dados, foi realizado teste de curva de regressão não linear pelo programa estatístico GraphPad Prism v5.01.
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
Resultados e discussão
O rendimento da extração da gelatina foi de 8,63%, considerando-se o peso da pele úmida do cangulo (B. capriscus), e o porcentual de proteínas de 61%.
Um porcentual de 5,67% foi obtido por Jellouli et al. (2011) ao extrair a gelatina da pele de B. capriscus, citada como comercialmente importante na Tunísia para consumo. Rendimentos de 5 e 8% são relatados na extração da gelatina da tilápia e da pescada, mas em média o rendimento da gelatina do peixe é menor do que a de
mamíferos, que pode chegar a 19% (GÓMEZ-GUILLÉN et al., 2002; JAMILAH e HARVINDER, 2002).
O rendimento pode variar com o método de extração empregado e com a idade e a espécie do peixe utilizado (MUYONGA; COLE; DUODU, 2004; JONGIAREONRAK et al., 2006).
Determinação eletroforética
No perfil eletroforético da gelatina da pele do peixe (Figura 19) é possível observar várias bandas na distribuição de massa molar de 37 a 150 kDa, cuja banda em 150 kDa é a mais intensa, indicando a proteína presente em maior concentração.
Figura 19: Perfil eletroforético (SDS-PAGE) da gelatina extraída da pele de B.
capriscus. 250KDa 150KDa 100KDa 75KDa 50KDa 37KDa 25KDa 20KDa 1 µ 2g µ 4g µ 8g µ 16 g µ 20g
Padrão de proteínas de baixa massa molar (1); Diferentes concentrações do material (demais colunas). Fonte: Próprio autor.
No estudo de Jellouli et al. (2011), a gelatina extraída da pele de B. capriscus, com um teor de proteínas de 90%, demostrou no SDS-PAGE as bandas referentes as cadeias α1 e α2, características do colágeno tipo I, que aparecem em 116 e 118 kDa (BUENO et al., 2011). A banda um pouco superior a 100 KDa, que aparece no perfil do material analisado pode ser indicativa dessas cadeias.
A análise das peles de quatro espécies de peixes, comercialmente importantes na Coréia, também indicaram a presença do colágeno tipo I em suas constituições, tanto após a extração alcalina, como na amostra de colágeno solúvel em ácido e no material extraído do farelo de peixe (CHO et al., 2014). A gelatina extraída da pele da tilápia (Oreochromis niloticus), em trabalho de Bueno et al., 2011, apresentou no SDS- PAGE as bandas em 212, 170, 116, 76 e 53 kDa. A banda em 116 kDa foi a mais intensa.
A forma de extração pode interferir no tamanho dos peptídeos da gelatina. Segundo Gimenéz, Gómez-Guillén e Monteiro (2005), o emprego de sais, na etapa de lavagem das peles submetidas à extração de gelatina, provoca a abertura da estrutura do colágeno, aumentando a extração de polímeros de maior massa molar, aos quais são atribuídos melhores características viscoelásticas, apresentadas principalmente por gelatinas de mamíferos (GUDMUSSON, 2002).
Caracterização química
O espectro de IV apresenta características típicas para gelatina da pele de peixe (Figura 20), também observadas por Ahmad e Benjakul 2011, Al-Saidi et al., 2012, Arumugan et al., 2018. A banda Amida A deve-se às vibrações características do estiramento dos grupos N-H e a banda Amida B das ligações C-H dos grupos metila (CH3), metilênicos (CH2) e metínicos (CH). As bandas Amida I e II são as duas bandas vibracionais mais proeminentes das cadeias protéicas. A banda Amida II é decorrente das deformações das ligações N-H, e a região espectral mais sensível aos componentes estruturais secundários da proteína é a banda Amida I (1700-1600 cm- 1), que é devida quase inteiramente às vibrações de estiramento C=O das ligações peptídicas (aproximadamente 80%) . A banda Amida III, na região entre 1400-1100 cm-1, corresponde aos estiramentos da ligação C-N, e as bandas Amidas IV, V, e VI correspondem às deformações fora do plano da ligação N-H (PAVIA et al, 2010).
Figura 20: Espectro de absorção na região do Infravermelho da gelatina extraída da pele de B. capriscus.
Fonte: Próprio autor.
O espectro de RMN1H da gelatina obtida da pele do cangulo (Figura 21) foi semelhante a gelatina A comprada da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, United States), publicado no trabalho de Ding et al. (2018).
A maioria dos sinais de prótons puderam ser atribuídos à ressonância dos grupamentos metila dos aminoácidos da gelatina. A ressonância da metila dos aminoácidos leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (Ile) foi observada a 0,95 ppm. Os picos dos prótons a 1,24 e 1,35 ppm foram atribuídos à ressonância do grupo metila da treonina (Thr) e da alanina (Ala). O pico a 1,68 ppm foi atribuído à ressonância da metila da arginina (Arg). Os picos a 2,73, 3,01, 3,29 e 3,65 ppm foram derivados dos aminoácidos ácido aspártico (Asp), lisina (Lys), arginina (Arg) e prolina (Pro). E em 7,34 ppm, absorção dos hidrogênios do anel aromático da fenilalanina (Phe).
A composição de aminoácidos da gelatina da pele de B. capriscus, descrita por Jellouli et al. (2011), expressa como aminoácidos mais abundantes a glicina, prolina e alanina.
Figura 21: Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio da gelatina extraída da pele de B. capriscus em D2O (300 MHz)
Fonte: Próprio autor.
Determinação da atividade antifúngica
Na Tabela 10 são apresentados os resultados da atividade antifúngica, considerados bons quando comparados com outros trabalhos (Wu, Ge e Liu, 2014; Yao et al., 2017) .
Wu, Ge e Liu, 2014, ao analisar a atividade antifúngica da gelatina da pele da espécie Hypophthalmichthys molitrix (carpa prateada), verificou que a mesma não apresentou nenhuma atividade, e mesmo após a incorporação do óleo essencial de canela, a concentração mínima de inibição dos microorganimos (CIM) foi de 10 mg/mL.
Entre os produtos naturais, os óleos essenciais são os grupos mais investigados (FONTENELLE et al., 2007), inclusive como aditivos a filmes protéicos (AHMAD et al., 2012; EMIROGLU et al., 2010; MARTUCCI et al., 2015). Porém,
autores descrevem a adição de outros compostos, com atividades antimicrobianas e antioxidantes às gelatinas de peixes, para encapsulamento de materiais ou produção de filmes bioativos (ARFAT et al. 2014; TONGNUANCHAN, BENJAKUL; PRODPRAN, 2012),
Tabela 10: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) da gelatina obtida da pele de B. capriscus contra fungos Candida spp.
Microorganismo CIM (mg/mL) CFM (mg/mL)
C. albicans-04 2,5 >2,5
C. albicans- JMOR N.I. N.I.
C. tropicalis – MSAV 0,62 1,25
C. tropicalis- AFS N.I. N.I.
CIM, Concentração Inibitória Mínima; CFM, Concentração Fungicida Mínima; N.I., Não Identificado. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.
Ao avaliar a atividade antibacteriana contra Escherichia coli de filmes comestíveis de gelatina de peixe comercial/quitosana suplementados com d- limoneno, Yao et al. (2017) verificaram que os filmes sem o limoneno não tem atividade bacteriana, e que mesmo após adição do d-limoneno, em diferentes concentrações, apenas a partir de uma concentração de 5 mg/mL há inibição da bactéria.
Atividade antioxidante
A gelatina obtida da pele do cangulo apresentou IC50 (µg/mL) de 60,68 ± 0,32 para a atividade antioxidante.
Outros estudos relatam a atividade antioxidante de filmes formados com gelatina da pele de peixe apenas após a adição de extratos ou compostos.
Wu et al., 2013, ao desenvolverem um filme a partir da gelatina de H. molitrix, incorporada com chá verde, à base de Camellia sinensis, verificaram atividade antioxidante, com eliminação de 31,4% do radical DPPH, apenas após a adição de 0,7% do extrato ao filme. O IC50 para o extrato puro foi de 150 µg/mL.
No estudo de Tongnuanchan, Benjakul e Prodpran (2012), o filme produzido a partir da gelatina da pele da tilápia (Oreochromis niloticus) e glicerol também não
apresentou atividade de eliminação de DPPH. Atividades antioxidantes foram apresentadas após a adição de diferentes óleos essenciais de frutas cítricas. No [/entanto, Choonpicharn et al. (2015), ao testar a atividade antioxidante da gelatina da pele da tilápia hidrolisada, encontrou no material um grande potencial como agente antioxidante.
Determinação da atividade anticolinesterásica
O resultado de inibição da AChE utilizando a gelatina apresentou IC50 (µg/mL) de 15,78 ± 0,005, enquanto a Fisostigmina, utilizada como controle, tem IC50 (µg/mL) de 1,15 ± 0,005.
Peptídeos isolados do colágeno hidrolisado de águas-vivas também apresentaram atividades anticolinesterásica e antioxidante (BARZIDEH et al. 2014).
Vinutha et al. (2007), utilizando extratos aquosos e metanólicos de diferentes partes de plantas, inclusive utilizadas popularmente para melhorar a cognição, obtiveram valores de IC50 (µg/mL) entre 16,74 e 73,69.
Como os inibidores da AChE são os fármacos mais utilizados no tratamento dos sintomas da doença de Alzheimer, o estudo de diversos tipos de extratos e produtos obtidos de plantas ou de produtos naturais têm sido investigados (PENIDO et al., 2017).
Conclusão
Os dados de atividades antifúngica, antioxidante e de inibição da acetilcolinesterase da gelatina da pele do cangulo (B. capriscus) acrescentam importância ao estudo desse material, que já é investigado como substituto da gelatina bovina e suína.
Assim, estudos mais aprofundados devem ser realizados aproveitando os potenciais biológicos detectados, na produção de biofilmes, ou ainda no encapsulamento de materiais, inclusive para a preparação de cápsulas de óleos de peixes, ricos em ômega-3, que são largamente estudados no tratamento e na prevenção da doença de Alzheimer (DA), podendo ser avaliada uma incorporação de maior bioatividade ao produto.
REFERÊNCIAS
AHMAD, M.; BENJAKUL, S. Characteristics of gelatin from the skin of unicorn
leatherjacket (Aluterus monoceros) as influenced by acid pretreatment and extraction time. Food Hydrocolloids, v. 25, p. 381-388, 2011.
AHMAD, M.; BENJAKUL, S.; PRODPRAN, T.; AGUSTINI, T. W. Physico-mechanical and antimicrobial properties of gelatin film from the skin of unicorn leatherjacket incorporated with essential oils. Food Hydrocolloids, v. 28, p. 189-199, 2012. AL-SAIDI, G. S.; AL-ALAWI, A.; RAHMAN, M. S.; GUIZANI, N., Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic study of extracted gelatin from shaari (Lithrinus microdon) skin: effects of extraction conditions. International Food Research Journal, v.19, n. 3, p. 1167-1173, 2012.
ALVES, R. R. N.; ALVES, H. N. The faunal drugstore: Animal-based remedies used in traditional medicines in Latin America. Journal of Ethnobiology and
Ethnomedicine, v. 7, n. 9, 2011.
ARFAT, Y. A.; BENJAKUL, S.; PRODPRAN, T.; SUMPAVAPOL, P.; SONGTIPYA, P. Properties and antimicrobial activity of fish protein isolate/fish skin gelatin film
containing basil leaf essential oil and zinc oxide nanoparticles. Food Hydrocolloids, v. 41, p. 265-273, 2014.
ARUMUGAM, G. K. S.; SHARMA, D.; BALAKRISHNAN, R.; ETTIYAPPAN, J. B. P. Extraction, optimization and characterization of collagen from sole fish skin.
Sustainable Chemistry and Pharmacy, v. 9, p. 19–26, 2018.
BARBOZA, R. S. L.; BARBOZA, M. S. L.; PEZZUTI, JUAREZ CARLOS BRITO. Aspectos culturais da zooterapia e dieta alimentar de pescadores artesanais do litoral paraense. Fragmentos de Cultura, Goiânia, v. 24, n. 2, p. 253-266, 2014. BARZIDEH, Z.; LATIFF, A. A.; GAN, C.; ABEDIN, Z.; ALIAS, A. K. ACE Inhibitory and Antioxidant Activities of CollagenHydrolysates from the Ribbon Jellyfish
(Chrysaora sp.). Food Technolology and Biotechnology, v. 52, n. 4, p. 495–504, 2014.
BASTOS, A. L.; BAISH, A. L. M.; CLEMENTIN, R. M.; SOARES, L. A. de S.;
FURLONG, E. B. Perfil de ácidos graxos da pele e músculo de Balistes capriscus e
Menticirrhus litoralis, pescados na região sul do Brasil. Revista Instituto Adolfo
Lutz, v. 65, n. 2, p. 94-99, 2006a.
BASTOS, A. L.; BAISCH, A. L. M.; SOARES, L. A. de S.; BURKERT, J. F. de M; FURLONG, E. B. Determinação de nitrato e nitrito em chás de peles de pescados empregados. para tratamento de asma brônquica na região sul do Rio Grande do Sul. Química Nova, v. 29, n. 5, p. 895-900, 2006b.
BRADFORD, M.M. Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.