FERMENTAÇÃO MICROBIANA

A produção do ácido láctico a partir da fermentação microbiana representa mais de 50% da produção mundial (Guilherme et al., 2009), e continua despertando interesse devido às suas inúmeras vantagens quando comparada com a síntese química: produção de isômeros puros e uso de recursos renováveis como substrato na fermentação.

O processo fermentativo é caracterizado por processos biológicos de degradação do substrato (glicose) por uma população de microrganismos (biomassa) em metabólitos, como o etanol, ácido cítrico e ácido láctico (Silveira, 2009).

As matérias-primas usadas como substratos na fermentação microbiana para produção de ácido láctico são diversas: amido, tais como trigo, milho, mandioca, batata, arroz, centeio, cevada (Li et al., 2012; Nakano et al., 2012; Wang et al., 2010); lignocelulose (Abdel-Rahman et al., 2011), soro de leite (Li et al., 2006), beterraba (Calabia e Tokiwa, 2007) ou melaço de cana-de- açúcar (Lunelli et al., 2010a). A Tabela 2.3 mostra a produção de ácido láctico utilizando diferentes substratos e tipo de fermentação. Um produto mais puro é obtido quando um substrato puro é fermentado, tal como a sacarose pura obtida a partir da cana-de-açúcar e de açúcar de beterraba, resultando em um menor custo de purificação. Porém, o elevado custo do açúcar inviabiliza a sua utilização. Por outro lado, a utilização de produtos residuais das indústrias de alimentos e sucroalcooleira constitui vantagem do ponto de vista ambiental e econômico.

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Tabela 2.3: Produção de ácido láctico utilizando diferentes fontes de substrato (Abdel-Rahman et al., 2013).

Substrato Microrganismo Modo de fermentação Ácido láctico Referência

C (g/L) Y (g/g) P (g/L/h)

Fibra de alfafa Lb. Delbreuckii Batelada 35,4 0,35 0,75 Sreenath et al. (2001)

Fibra de alfafa Lb. plantarum Batelada 46,4 0,46 0,64 Sreenath et al. (2001)

Bagaço de maçã Lb. rhamnosus ATCC 9595 (CECT288) Batelada 32,5 0,88 5,41 Gullon et al. (2008)

Resíduos de banana Lb. Casei Batelada - 0,10 0,13 Chan-Blanco et al. (2003)

Bagaço de mandioca Lb. delbrueckii NCIM 2025 Batelada 81,9 0,94 1,36 John et al. (2006)

Celulose B. coagulans 36D1 Batelada alimentada 80,0 0,80 0,30 Ou et al. (2011)

Bagaço de cana Lc. lactis IO-1 Batelada 10,9 0,36 0,17 Laopaiboon et al. (2010)

Glicerol E. coli K12 strain Batelada 32,0 0,85 0,44 Mazumdar et al. (2010)

Glicerol E. coli (engineered) Batelada alimentada 50,0 0,90 0,60 Mazumdar et al. (2013)

Microalga Lb. paracasei LA104 Batelada 37,1 0,46 1,03 Nguyen et al. (2012)

Resíduo de comida Lb. manihotivorans LMG18011 Batelada 48,7 0,1 0,76 Ohkouchi e Inoue (2006)

Palha de trigo Lb. brevis CHCC 2097 and Lb. pentosus

CHCC 2355

Batelada 7,1 0,95 - Garde et al. (2002)

Soro de queijo Lb. casei NRRL B-441 Batelada 96,0 0,93 2,2 Büyükkileci e Harsa

(2004)

Sacarose Escherichia coli (engineered) Batelada 85,0 0,85 1,0 Wang et al. (2012)

Glicose B. subtilis MUR1(mutant) Batelada 143,2 0,9 2,75 Gao et al. (2012)

Glicose B. subtilis MUR1(mutant) Batelada alimentada 183,2 0,99 3,52 Gao et al. (2012)

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Os microrganismos utilizados na fermentação podem ser divididos em dois grupos: bactérias e fungos (Wee et al., 2006). A escolha de um microrganismo depende primeiramente do carboidrato a ser fermentado, pois as linhagens de microrganismos diferem quanto ao metabolismo relativo a diferentes fontes de carbono (Lunelli, 2010).

As bactérias do ácido láctico (LAB) possuem formato de cocos, com exceção da

lactobacilli e a carnobacteria que são bastonetes, são incapazes de sintetizar o ATP por

respiração, tem como principal produto final o ácido láctico proveniente da fermentação de açúcares e são gram-positivas (possuem parede celular com uma única e espessa camada de peptidoglicanos). A maioria das bactérias lácticas são anaeróbias facultativas, utilizam o ácido pirúvico que é o produto final da via Embdem-Meyerhof-Parnas para conversão em lactato, são catalase negativa (não possuem a enzima catalase, responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio), são imóveis e não formadoras de esporos. A temperatura ótima de crescimento varia de acordo com o gênero e está entre 20 a 45 °C (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000).

As LAB podem ser classificadas em dois grupos de acordo com a via pela qual fermentam açúcares: homofermentativas e heterofermentivas (obrigatória e facultativa). A Figura 2.5 mostra os dois caminhos de fermentação e a fermentação mista, que pode ser realizada pela bactéria heterofermentativa facultativa.

As bactérias homofermentativas convertem glicose quase que exclusivamente em ácido

láctico, já as bactérias heterofermentativas catabolizam glicose em etanol, CO2 e ácido láctico. As

bactérias homofermentativas normalmente metabolizam glicose via Embden-Meyerhof-Parnas (processo de glicólise). Como a glicólise resulta somente em ácido láctico como produto final do metabolismo da glicose, duas moléculas de ácido láctico são produzidas para cada molécula de glicose com rendimento de mais de 0,90 g/g. São exemplos de bactérias homofermentativas:

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylophilus, L. bulgaricus, Lactobacillus helveticus e L. salivarius (Castillo Martinez et al., 2013).

As bactérias heterofermentativas obrigatórias fermentam açúcar apenas pelo caminho 6- phosphogluconate/phosphoketolase e as heterofermentativas facultativas têm a capacidade de utilizar ambos os caminhos de fermentação. São heterofermentativas obrigatórias a Lactobacillus

brevis, L. fermentum, L. parabuchneri e a L. reuteri. Já a L. alimentarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Lactobacillus

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pentosus, Lactobacillus xylosus são exemplos de bactérias heterofermentativas facultativas

(Castillo Martinez et al., 2013).

Figura 2.5: Principais caminhos de fermentação da glicose pela bactéria do ácido láctico. (A)

Bactéria homofermentativa, (B) Bactéria heterofermentativa e (C) fermentação mista, P=fosfato, BP=bifosfato, LDH= lactato desidrogenase, PFL= piruvato formato liase, e PDH= piruvato desidrogenase (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000 Adaptado).

As bactérias lácticas possuem exigências nutricionais complexas, devido à sua habilidade limitada para sintetizar vitaminas do complexo B e aminoácidos, requerendo, desta maneira, um meio rico nutricionalmente para seu crescimento (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000).

Muitas LAB produzem somente um isômero de ácido láctico, podendo algumas vezes, dependendo das condições operacionais, ocorrer a produção de pequenas quantidades do outro

CAPÍTULO 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

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isômero. Organismos que produzem os isômeros D(-) ou L(+) do ácido láctico têm duas enzimas lactato desidrogenase (LDH) que diferem em sua estereoespecificidade. Algumas espécies de

Lactobacillus produzem o isômero L(+), que sobre acúmulo leva a uma mistura racêmica,

convertendo em ácido láctico D(-) até que o equilíbrio seja alcançado. Lactobacillus helveticus e

Lactobacillus plantarum produzem uma mistura racêmica (Lunelli, 2010).

Embora a maioria dos processos de produção do ácido láctico ser realizada com as LAB, os fungos filamentosos, tais como Rhizopus, utilizam a glicose aerobicamente para produzir o ácido láctico. As espécies de Rhizopus tais como R. oryzae e R. arrhizus tem atividade enzimática amiolítica, que lhes permite converter amido diretamente para a forma L(+) do ácido láctico. A fermentação fúngica tem algumas vantagens, por exemplo, R. oryzae requer um meio simples para produzir L(+) ácido láctico, mas também exige a aeração vigorosa por ser um aeróbio obrigatório. Na fermentação fúngica, a produtividade é baixa, inferior a 3 g/L h, provavelmente devido à limitação na transferência de massa. O menor rendimento de produto na fermentação fúngica é atribuído também à formação de subprodutos, como ácido fumárico e etanol (Wee et

al., 2006).

Além da escolha da fonte de carbono e do microrganismo para a fermentação, são parâmetros que influenciam a eficiência da fermentação: o pH e a temperatura do meio, as fontes de nitrogênio e de vitaminas, o modo de fermentação e a formação de subprodutos.

O pH da fermentação diminui conforme ácido láctico é produzido. O controle é feito adicionando-se base no meio (carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio, hidróxido de sódio e outros), pois em meios ácidos a produção de ácido láctico é nula ou mínima. O controle do pH pode ser feito também por extração, adsorção ou eletrodiálise (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000). Várias pesquisas apontam o valor de 6,5 ou em torno deste como o pH ótimo de crescimento e produção de ácido láctico (Silveira, 2009), pH ótimo menor que 5,7 foi obtido somente para cepas de Lactobacillus que toleram pH menores que os lactococci (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000). O controle do pH em fermentações por bateladas aumentam a produção de ácido láctico, rendimento, e a produtividade de diferentes cepas de LAB, por exemplo, Lb.

Delbrueckii, E. mundtii QU 25, e E. faecium (Abdel-Rahman et al., 2011).

A temperatura é um parâmetro importante no crescimento das bactérias (Silveira, 2009) e está relacionada com os parâmetros cinéticos de crescimento da LAB, produção de ácido láctico e

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consumo de substrato. A maioria dos estudos de produtividade do ácido láctico foi estudada em temperaturas na faixa de 30-43 °C (Abdel-Rahman et al., 2011).

As fontes de nitrogênio e vitaminas são importantes principalmente devido à capacidade limitada das bactérias de sintetizar vitaminas do complexo B. As principais fontes são os extratos de levedura e sulfato de amônio. Em termos de processo industrial, o uso de extrato de levedura possui elevado custo, apesar de ser o melhor para o cultivo de bactérias lácticas. Assim, o uso de sulfato de amônio mostra-se como uma alternativa, principalmente devido ao seu custo ser mais baixo do que o extrato de levedura. A adição de outros nutrientes no meio também tem gerado efeito positivo na produção do ácido láctico, incluindo a adição de extrato de levedura e peptona (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000).

O ácido láctico é geralmente produzido no modo batelada, mas pode também ser utilizado o modo contínuo e a batelada alimentada. As fermentações em batelada apresentam conversões e rendimentos superiores às fermentações contínuas, mas a produtividade volumétrica é menor. Isso pode ser explicado devido à utilização de todo o substrato no processo batelada, enquanto que no processo contínuo uma concentração residual de substrato sempre está presente. A maior produtividade das fermentações contínuas deve-se à alta taxa de diluição e à capacidade do processo poder ser mantido por longo período de tempo. A escolha do modo de operação dependerá do custo do substrato e do investimento. Para processos onde substratos caros são utilizados, o rendimento deve ser maximizado por um processo batelada ou batelada alimentada. Para processos onde o custo do investimento seja alto, a produtividade volumétrica deve ser maximizada por um processo contínuo. Uma alta produtividade pode ser encontrada também num processo com reciclo de células. O sistema com reciclo de células, junto com processos contínuos e batelada repetida é eficiente para encontrar alta concentração celular e alta produtividade de ácido láctico (Lunelli, 2010).

A produção de outros ácidos orgânicos durante a fermentação para a produção do ácido láctico dependerá da pureza e da qualidade do inóculo utilizado, das condições do processo, que devem evitar contaminação externa e da rota metabólica utilizada. Subprodutos como ácido acético, dióxido de carbono e etanol podem ser produzidos, mas para produção eficiente de ácido láctico, a formação dos subprodutos deve ser evitada ou mantida em um valor mínimo (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000).

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A produção de ácido láctico pela rota fermentativa ganhou um novo fabricante, a “Archer Daniels Midland”, no início de 1990. No final de 1997, a “Cargill” se uniu à “Dow Chemical”, originando a “Cargill-Dow”, produzindo um polímero de ácido poliláctico baseado na tecnologia fermentativa. No início de 2005, a “Cargill” rompeu o empreendimento com a “Dow” e estabeleceu a “NatureWorks LLC”. Os maiores produtores de ácido láctico pela rota fermentativa incluem a “NatureWorks LLC”, “Purac” (Holanda), “Galactic” (Bélgica), “Cargill” (EUA) e várias empresas chinesas, como a “CCA (Changzhou) Biochemical Co. Ltd.”, “Henan Jindan Lactic acid Co. Ltd.” e “Mushashino Chemical Co. Ltd”. Atualmente, a “NatureWorks LLC” é líder na tecnologia e mercado de polímeros de ácido láctico (Abdel-Rahman et al., 2013; John et

al., 2009).

A “NatureWorks LLC” construiu uma planta de ácido láctico em Blair, EUA, com uma capacidade de produção de 180.000 ton por ano que iniciou sua operação em 2002 (John et al., 2009; Wee et al., 2006).

2.3.2.1. AVALIAÇÃO ECONÔMICA DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO PELA ROTA FERMENTATIVA

A análise econômica do processo de produção do ácido láctico tem sido pouco reportada na literatura (Zhang et al., 2007). Estudos econômicos da produção do ácido láctico pela fermentação resultaram em uma variedade de custos para o produto final e muitos dos estudos consideraram também somente partes do processo (González et al., 2007). Por exemplo, o processo de upstream ou o processo downstream, e em alguns, o produto final consistiu principalmente de lactato ao invés de ácido láctico. Nestes estudos, o custo de produção do ácido láctico variou de 0,10 a 2,00 US$/kg dependendo do processo considerado e da qualidade do produto final. Dos poucos processos completos sugeridos, o ácido láctico em concentrações de 50% e 82% poderia ser produzido a um custo de 0,26 AU$/kg (dólar australiano) e 0,55 US$/kg, respectivamente. Para efeito de comparação, o custo da produção sintética do ácido láctico variou entre 1,30 e 1,40 US$/kg (Akerberg e Zacchi, 2000).

CAPÍTULO 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

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Akerberg e Zacchi (2000) realizaram um estudo de avaliação econômica do custo de produção do ácido láctico pela via fermentativa a partir de farinha de trigo integral. O custo de produção do ácido láctico de concentração 70% (m/m) foi avaliado considerando uma planta com capacidade de produção de 30.000 toneladas/ano e as seguintes etapas de processo: hidrólise do amido por enzimas para formar glicose em duas etapas, liquefação e sacarificação; conversão da glicose em ácido láctico na etapa da fermentação; remoção das farinhas e das bactérias por centrifugação e remoção das enzimas por ultrafiltração após a fermentação. A etapa de fermentação foi realizada em um pH controlado, produzindo principalmente lactato. A água foi separada utilizando a eletrodiálise e o lactato foi convertido em ácido láctico, e o hidróxido de sódio foi produzido como subproduto. O ácido láctico foi concentrado por evaporação a vácuo.

Concluiu-se que os custos com matéria-prima, hidróxido de sódio na etapa de fermentação e a eletrodiálise na conversão de lactato em ácido láctico contribuíram consideravelmente no custo total de produção e a realização da etapa de fermentação em batelada era economicamente melhor do que a fermentação contínua. Os custos de produção podem ser reduzidos com a redução do pH e/ou através da reciclagem do hidróxido de sódio produzido por eletrodiálise para o fermentador, utilizando concentrações mais altas de farinha de trigo. A concentração ótima de glicose foi de 116 g glicose/L, que resultou em um custo de produção de 0,833 US$/kg produto. Uma simulação do custo total de produção, utilizando a simulação de Monte Carlo, para avaliar a incerteza, mostrou que para esta concentração ótima, variando os custos de investimento, operação e o preço da matéria-prima, a probabilidade do custo de produção ser inferior a 0,90 US$/kg foi de 61% e a probabilidade do custo de produção ser inferior a 1,0 US$/kg foi de 91% (Akerberg e Zacchi, 2000).

Liu et al. (2005) realizaram um estudo de avaliação econômica da produção do ácido láctico em batelada, batelada alimentada e contínuo com culturas de Rhizopus sp. Na batelada alimentada, com uma concentração inicial de glicose de 30 g/L, mais de 140 g/L de L(+)-ácido láctico foi produzido com um rendimento de produto de 83%. Na batelada, com uma concentração de 200 g/L de glicose inicial, 121 g/L de L(+)-ácido láctico foi obtido, gerando baixo rendimento de produto baseada na quantidade de glicose consumida. Na cultura contínua, 1,5 g/L h de produtividade volumétrica com rendimento de produto de 71% foi obtida em uma taxa de diluição de 0,024 h-1. Baseados nesses resultados foram avaliados custos das variáveis: fonte de carbono, vapor e custos com tratamento de resíduos. O custo total considerando as

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variáveis estudadas na batelada alimentada e contínuo foram de 88% e 140%, respectivamente, comparada com o custo da cultura batelada. A batelada alimentada por fornecer alta concentração de L(+)-ácido láctico e alto rendimento de produto, diminuindo os custos, foi considerada o melhor para as aplicações industriais de produção do ácido láctico.

González et al. (2007) realizaram a avaliação econômica de um processo integrado de produção de ácido láctico de grau alimentício a partir de soro ultrafiltrado. A planta foi projetada

para tratar 100 m3/dia de soro permeado. As etapas do processo consideradas foram: fermentação,

ultrafiltração, troca iônica, osmose reversa e a evaporação a vácuo. O processo proposto foi demonstrado ser economicamente viável. O custo anual resultou em 1,25 US$/kg para ácido láctico de pureza 50% (m/m). A maior contribuição para o custo total de investimento correspondeu à etapa de concentração, representando 40% do custo total, enquanto que a etapa de fermentação exigiu o maior custo operacional, representando 47% do custo total de operação.

Sikder et al. (2012) realizaram a avaliação econômica do processo de produção do ácido láctico produzido a partir da cana-de-açúcar. O processo de produção consistiu nas etapas de esterilização, fermentação, microfiltração, nanofiltração e concentração final por evaporação a vácuo. O fermentador com membrana integrada operou com concentração celular de 22 g/L, resultando em uma produtividade de 53 g/L/h com concentração de ácido láctico de 106 g/L e rendimento de 0,96. As unidades de membrana (microfiltração e nanofiltração) e bomba contribuíram com cerca de 2% do custo total fixo enquanto que a unidade de fermentação e o tanque de retenção contribuíram com 36% do custo total. Os componentes de maior custo foram a matéria-prima e extrato de levedura, contribuindo com 6% e 87%, respectivamente, no custo total. O custo total do ácido láctico de 95% de pureza foi de 3,15 US$/kg.