Formulação dos coquetéis enzimáticos e análise de sinergismo

Vários coquetéis enzimáticos foram confeccionados a partir da mistura dos extratos produzidos por P. sanguineus e C. cubensis. Inicialmente estas misturas foram realizadas de forma simples, ou seja, diferentes volumes de cada extrato, previamente concentrados 10 vezes, nas proporções de 70:30, 50:50 e 30:70 (C.

cubensis:P. sanguineus), foram misturados e foram analisados quanto as atividades

de FPase, endoglicanase, exoglicanase, celobiase, β-glicosidase, β-xilosidase, - arabinofuranosidase e lacase. Posteriormente, foi realizada uma mistura não convencional, na qual o extrato líquido produzido por P. sanguineus na FS foi utilizado para extrair as enzimas produzidas pelo C. cubensis na FES e o coquetel resultante foi também concentrado 10 vezes. Esta mistura foi denominada de MT. Além disso, para fins comparativos, o extrato comercial Multifect® também foi analisado neste estudo. Os resultados das atividades enzimáticas obtidas nestes diferentes coquetéis estão apresentados na Tabela 1.

Como já citado neste estudo, o P. sanguineus produziu um extrato rico em endoglicanase. Já, o C. cubensis produziu um extrato enzimático rico em exoglicanase, celobiase e β-glicosidase. Todas estas enzimas são essenciais na hidrólise da estrutura lignocelulósica. Além das enzimas que atuam na celulose, o C.

cubensis também produziu quantidades consideráveis das enzimas hemicelulolíticas (xilanase, β-xilosidase e α-arabinofuranosidase), enquanto o P. sanguineus pruduziu guande quantidade da enzima lacase, a qual atua na hidrólise da lignina (Tabela 1). Muitos estudos reportam a importância destas enzimas acessórias na hidrólise de

95 biomassas lignocelulósicas, pois elas podem atuar sinergisticamente com as celulases, aumentando a eficiência da hidrólise (SELIG et al., 2008; VAN DYK & PLETSCHKE, 2012; HU et al., 2013). A utilização de hemicelulases, principalmente as xilanases, podem auxiliar hidrolisando a xilana que não foi solubilizada no pré- tratamento, possibilitando um maior acesso das celulases à celulose. De forma similar, a lacase ao hidrolisar a lignina residual também proporciona uma maior eficiência de hidrólise da celulose. HU et al. (2011) mostraram que quando endoxilanases foram adicionadas a extratos comerciais de celulases, a cooperação sinergística não somente aumentou substancialmente a eficiência da hidrólise do sabugo de milho pré-tratado, mas também reduziu drasticamente a quantidade de celulase requerida (aproximadamente 7 vezes) para alcançar níveis de hidrólise razoáveis (>70 %).

Tabela 1 – Atividades enzimáticas dos extratos de C. cubensis, P. sanguineus, das misturas 70:30, 50:50, 30:70 (C. cubensis:P. sanguineus), MT e do coquetel comercial Multifect®.

Amostras

C. cubensis P. sanguineus 70:30 50:50 30:70 MT Multifect® Concentração de proteínas (mg/mL) Atividades enzimáticas (U/mL) FPase 8,51 1,07 11,50 1,69 9,14 1,21 9,61 1,26 9,76 1,31 18,08 4,2 1982,46 141,94 Endoglicanase 112,28 132,05 107,52 111,44 118,61 221 2368,25 Exoglicanase 12,94 1,68 8,84 6,92 4,91 15,97 131,82 Celobiase 6,72 2,23 4,74 3,89 3,98 14,5 25,17 β-glicosidase 52,73 7,83 35,42 26,01 24,01 76,6 119,85 Xilanase 536,56 215,09 418,97 326,09 298,26 840,2 562,8 β-xilosidase 3,07 0,26 2,26 1,61 1,23 5,2 n.d.* -arabinofuranosidase 2,58 0,63 1,72 1,43 1,14 3,8 n.d.* Lacase 0,36 5,57 2,30 3,78 4,48 3,22 n.d.* * n.d.: não detectado.

A montagem de um coquetel enzimático ideal não é uma tarefa fácil, pois deve-se levar em consideração o complexo sinergismo entre as enzimas e a melhor adequação do coquetel a uma determinada biomassa e ao tipo de pré-tratamento ao qual ela foi submetida (RAKOTOARIVONINA et al., 2012). Logo, a escolha das

96 enzimas acessórias que devem ser suplementadas em um extrato enzimático dependerá da composição da biomassa após passar por determinado pré-tratamento. Diante destes conhecimentos, o fato do C. cubensis produzir grandes quantidades de xilanase, β-xilosidase e α-arabinofunasidase; e do P. sanguineus produzir grandes quantidades de lacase, é de grande relevância neste estudo, visto que o bagaço de cana pré-tratado com NaOH 1% (m/v) utilizado continha grandes quantidades de xilanas e resíduos de arabinanas e lignina (Tabela 2).

Sinergia é definida como as interações que ocorrem entre dois ou mais componentes hidrolíticos, produzindo um efeito total maior do que a soma dos efeitos dos componentes individuais (VISSER et al., 2013). Assim, a sinergia entre os extratos enzimáticos de P. sanguineus e C. cubensis foi avaliada pela comparação das atividades mensuradas (FPase, endoglicanase, exoglicanase, celobiase, β- glicosidase, xilanase, β-xilosidase, α-arabinofuranosidase e lacase) com as atividades teóricas esperadas e o sinergismo foi expresso como uma porcentagem da atividade teórica (Figura 3). Amostras Efe ito sinergíst ico (% ) -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

Figura 3 – Efeito sinergístico das atividades enzimáticas presente nos coquetéis produzidos pela mistura dos extratos dos fungos C. cubensis e P. sanguineus em diferentes proporções (70:30, 50:50 e 30:70) e da MT. Atividades enzimáticas: (■) FPase; (■) endoglicanase; (■) exoglicanase; (■) celobiase; (■) β-glicosidase; (■) xilanase; (■) β-xilosidase, (■) α-arabinofuranosidase e (■) lacase.

97 O coquetél produzido pela simples mistura dos extratos enzimáticos de C.

cubensis e P. sanguineus na proporção de 70:30 apresentou um efeito sinergístico

negativo para praticamente todas as atividades analisadas, as únicas exceções foram para as atividades de β-xilosidase e lacase, a qual apresentou um efeito sinergístico positivo de 1,5 % e 19,2 %, respectivamente. O coquetel resultante da mistura na proporção 50:50 apresentou um grande efeito sinergístico positivo na atividade de lacase, aproximadamente 27 %, enquanto para as outras atividades analisadas todos os efeitos foram negativos. Já a mistura na proporção de 30:70 apresentou resultados sinergísticos positivos para as enzimas celobiase (11,5 %), β-glicosidase (12,7 %), β- xilosidase (1,1 %) e lacase (11,7 %). De forma contrária ao obtido neste trabalho, VISSER e colaboradores (2013) encontraram um grande efeito sinergístico positivo para as atividades de FPase (76 %), endoglicanase (50 %) e xilanase (24 %) quando misturou o extrato enzimático de C. cubensis com o extrato de Penicillium

pinophilum na proporção de 50:50.

Contudo, um resultado completamente diferente foi encontrado quando a mistura dos extratos enzimáticos obtidos de C. cubensis e P. sanguineus foram misturados de forma não convencional, ou seja, durante a etapa de extração enzimática da FES (MT). Neste coquetel, praticamente todas as enzimas apresentaram grande aumento nas atividades em relação às atividades teóricas esperadas, comprovando a ocorrência de sinergismo entre os extratos enzimáticos obtidos de C. cubensis e P. sanguineus. As únicas exceções observadas neste coquetel foram para as atividades de endoglicanase e lacase, as quais apresentaram uma diminuição da atividade de 9,5 % e 46,1 %, respectivamente. Para as enzimas FPase, exoglicanase, celobiase, β-glicosidase, xilanase, β-xilosidase e α- arabinofuranosidase foram observados grandes aumentos nas atividades, os quais foram de 52,2 %, 9,2 %, 62,0 %, 26,5 %, 12,2 %, 56,2 % e 18,4 %, respectivamente (Figura 3).

Vale ressaltar o grande efeito sinergístico ocorrido na atividade de FPase na MT. Contudo, é reconhecido que a celobiase apresenta um importante papel na atividade de FPase, pois impede o acúmulo de celobiose no meio reacional e a inibição das celulases. Portanto, o grande aumento na atividade de celobiase na amostra MT provavelmente propiciou um grande aumento na atividade de FPase. Além disso, estudos mostram que a adição de enzimas acessórias em extratos comerciais de celulases propiciaram uma maior atividade de FPase e

98 consequentemente uma maior hidrólise de biomassas pré-tratadas (HU et al., 2013; HU et al., 2011; CHEN et al, 2010). No presente estudo, também foram observados grandes aumentos nas atividades de β-glicosidase e β-xilosidase, além de significativos aumentos de α-arabinofuranosidase e xilanase (Figura 3).

Contudo, vale lembrar que durante a confecção do coquetel MT não houve adição do tampão acetato de sódio para a extração das enzimas produzidas em FES pelo C. cubensis, já que as mesmas foram extraídas utilizando-se o próprio extrato enzimático produzido pelo P. sanguineus em FS. Logo, de forma contrária ao ocorrido durante a confecção das misturas nas diferentes proporções, houve uma maior concentração do extrato enzimático produzido. Além disso, a fração porcentual utilizada para os cálculos das atividades teóricas esperadas em MT foi de 100 %.

Muitos estudos em efeitos sinergísticos de enzimas que atuam na hidrólise de biomassas lignocelulósicas são baseados na suplementação de enzimas individuais em extratos enzimáticos produzidos por um determinado microrganismo ou em extratos comerciais de celulases (ZHANG et al., 2013; HU et al., 2011; CHEN et al, 2010); ou ainda pela mistura de dois extratos enzimáticos em diferentes proporções (VISSER et al, 2013; MAEDA et al., 2011; GOTTSCHALK et al., 2010). Contudo, até o momento, não foi relatado na literatura nenhum estudo onde a mistura de dois extratos enzimáticos produzidos por dois microrganismos diferentes ocorreu em uma das etapas de produção das enzimas. As razões específicas do motivo de ter ocorrido estes grande efeito sinergístico na amostra MT ainda é desconhecido e deve ser ainda estudado mais profundamente.