GATA1 GATA1-MUT

GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT GATA1 GATA1-MUT

Figura 15. Estruturas preditas da proteína GATA1 selvagem (A) e mutante (B) em complexo com o DNA. Em preto estão destacadas as cadeias laterais dos resíduos de treonina e metionina em A e B, respectivamente, na posição 263 da proteína, mostrando que a região não participa do sítio de ligação de GATA1 ao DNA.

Figura 16. Estrutura tridimensional da região de interação zinco-dedo de zinco da proteína GATA1 na região do resíduo T263. As linhas pontilhadas em amarelo indicam as interações do tipo ponte de hidrogênio entre os resíduos de aminoácidos. As pontes de hidrogênio foram preditas dentro do limite de 3 Å de distância entre o átomo doador e o aceptor. Estrutura e interações preditas pelo software PyMOL v1.7.6. Cys, cisteína; Thr, treonina; Zn, zinco.

Figura 17. Interações intramoleculares envolvendo o resíduo 263 na estrutura da proteína GATA1 selvagem (A) e GATA1 mutante (B). As interações com a Thr265 foram perdidas na forma mutante. As pontes de hidrogênio foram preditas dentro do limite de 3 Å de distância entre o átomo doador e o aceptor. Estrutura e interações preditas pelo software PyMOL v1.7.6. Cys, cisteína; Thr, treonina; Zn, zinco.

Figura 18. Comparação entre sequências proteicas de GATA1 de ambos os motivos dedo de zinco, C- e N-terminal. As sequências são identificadas pelo número de acesso do banco de dados PDB e pelo nome da espécie a qual pertencem. Em amarelo estão destacadas as quatro cisteínas responsáveis pela ligação ao zinco e em verde e vermelho os resíduos de treonina e alanina observados na posição 263 dos motivos C- e N-terminal, respectivamente.

DISCUSSÃO

O estudo de neoplasias mieloides por tecnologias de sequenciamento massivo do DNA têm favorecido enorme progresso na compreensão dos mecanismos genéticos que promovem o surgimento e o desenvolvimento dessas doenças [10]. A investigação de variantes em conjuntos de genes específicos sequenciados por WES foi conduzida com o propósito de identificar possíveis alterações genéticas raras e potencialmente patogênicas implicadas na fisiopatologia das neoplasias mieloides dos casos estudados.

O preparo das bibliotecas e o sequenciamento do exoma completo em plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc.) forneceram uma cobertura média de 98X, cujos valores individuais nas amostras demonstraram ser bastante variáveis, entre 37X e 178X (Figura 12 e Tabela 5). A maioria das amostras sequenciadas, à exceção de duas delas, não atingiu o valor médio contratado para o sequenciamento, que seria de aproximadamente 135X (um plex de 12 amostras em duas lanes, modo high output, paired-end 2x100pb, exoma estrito, 37Mb), o que não impediu o estabelecimento de critérios satisfatórios para a filtragens de variantes. A baixa cobertura média em algumas amostras pode ter comprometido a sensibilidade das análises em identificar variantes presentes em baixa percentagem no material genético.

Essas divergências podem ter sido ocasionadas por diversos fatores. Um provável fator comprometedor consistiu na quantidade insuficiente de DNA de partida disponível para o preparo das bibliotecas, que ocorreu nas amostras “C2.II-1 CD3”, “C3.II-1 CD34” e “C3.II-3 CD34” (Tabela 4). Tal limitação é reflexo da baixa população de células CD3+ e CD34+ disponível para a extração do DNA genômico, particularmente das células-tronco hematopoiéticas CD34+ de MO, visto que estas constituem menos que 1% das células mononucleares normais [101]. Falhas na execução das técnicas de captura do exoma e do preparo do pool de bibliotecas para o sequenciamento também seriam possíveis motivos para a baixa cobertura atingida em algumas amostras sequenciadas.

Apesar dessas eventualidades, as análises em conjuntos de genes relevantes às neoplasias mieloides permitiram identificar alterações potencialmente patogênicas nos três casos clínicos abordados nesse trabalho. De acordo com MacArthur [102], uma variante patogênica é aquela que pode contribuir para um distúrbio no mecanismo que está implicado

na gênese da doença, mas nem sempre é completamente penetrante (isto é, por si só pode não ser suficiente para provocar a doença). Sobre esse aspecto, somente o uso de métodos de NGS não é suficiente para confirmar se uma nova variante acusada como patogênica é completamente penetrante. Torna-se necessário, portanto, a investigação do impacto de novas variantes na expressão gênica e na estrutura e função proteicas.

Nos casos 1 e 3, em que mais de um membro da família apresenta diagnóstico de doença neoplásica mieloide (ou alteração hematológica), o rastreamento de variantes permitiu a identificação de alterações raras e potencialmente patogênicas comuns aos membros da mesma família e que podem estar relacionadas com o desenvolvimento da doença. Segundo Liew [103], casos familiares de neoplasias mieloides são considerados raros, mas são imensamente valiosos para a investigação da patogênese molecular dessas doenças. A ocorrência dessas neoplasias em mais de um indivíduo da mesma família pode ser resultante de mutações germinativas no DNA ou de quimioterapia prévia, exposição ambiental/ ocupacional a radiação ou exposição a químicos, como o benzeno [103].

Variantes Identificadas no Caso 1

No caso 1, filtragens nos genes do painel 1 (56 genes recorrentemente mutados em neoplasias mieloides) identificaram algumas variantes na MO (CD34+) de ambas as pacientes do caso 1, mas não no SP (CD3+) de uma ou outra paciente (Tabela 7), a saber: SETBP1 Ala222Thr, TET2 Leu1721Trp, TET2 Ile1762Val e TP53 Pro72Arg (essas variantes não obedeceram aos critérios de seleção para validação futura). Uma possível justificativa para esse fenômeno seria o menor valor de cobertura observado nas amostras de SP (CD3+) comparado com a cobertura atingida nas amostras do tumor (CD34+) (Figura 12). Além disso, o protocolo de análises em bioinformática adotado pode não ter sido suficientemente sensível para detectar tais alterações também em SP.

Ainda sobre os resultados do painel 1 no caso 1, foram identificadas duas variantes potencialmente patogênicas e raras. A primeira delas, GATA1 T263M, ainda não contém registro em banco de dados e até o momento não foi relatada na literatura. A identificação dessa variante em células de linhagem germinativa (CD3+ de SP, Tabela 7) sugere que ela foi herdada nos indivíduos afetados do caso 1.

As predições moleculares de GATA1 demonstraram que a treonina (T263) afetada pela inserção da variante está localizada no domínio dedo de zinco C-terminal e, portanto, em região funcional e altamente conservada da proteína. Também se observou que a Met263 inserida na forma mutante não mantém a interação com a Thr265. De acordo com Ferreira [104], o dedo de zinco C-terminal é essencial para a função de GATA1, uma vez que é responsável pelo reconhecimento da sequência consenso do DNA (A/T)GATA(A/G) e sua consequente ligação ao DNA. Sabe-se que o gene GATA1 é um membro pioneiro da família dos fatores de transcrição (FTs) GATA que regula, em conjunto com outros FTs, a maturação do precursor bipotencial de eritrócitos e megacariócitos (MEP) [105]. Mutações nesse gene têm sido relatadas na anemia diseritropoietica familiar [106], na trombocitopenia ligada ao cromossomo X [107], em quase todos os casos de doença mieloproliferativa transitória (TMD) e de leucemia megacarioblástica aguda na síndrome de Down (AMKL-DS, do inglês acute megakaryoblastic leucemia of Down syndrome) [108] e em alguns casos de AMKL sem síndrome de Down [109].

Tendo em vista a natureza inédita da variante GATA1 T263M, a importância do gene GATA1 na eritro e megacariopoiese, bem como a relevância de várias mutações descritas nesse gene no desenvolvimento de anemias hereditárias [105-107], nosso grupo decidiu conduzir análises de simulação de dinâmica molecular em GATA1 (em andamento) para verificar se a inserção dessa variante pode desestabilizar a estrutura dessa proteína e, consequentemente, prejudicar a ligação dessa proteína à sequência consenso de reconhecimento do DNA. Também serão conduzidos testes com sequenciamento de Sanger e ou restrição enzimática para validação desta e de todas as variantes que obedeceram aos critérios de seleção para investigação futura neste e nos demais casos clínicos explorados neste trabalho, além de estudos funcionais para averiguar o potencial deletério resultante dessas variantes.

A segunda variante patogênica rara, a JAK3 Val718Leu, foi detectada apenas em células do tumor (CD34+ de MO) da paciente III-3 (irmã mais jovem), o que sugere que tal alteração tenha sido adquirida. A JAK3 é uma tirosina quinase que não exerce função de receptor e desempenha papel essencial na hematopoiese, particularmente no desenvolvimento de linfócitos; está predominante expressa em células hematopoiéticas e tem sido implicada na transdução de sinal intracelular mediada por receptores de citocina [110]. Mutações nesse gene têm sido relatadas na doença mieloproliferativa transitória, na leucemia megacarioblástica aguda, na AMLK da síndrome de Down e no linfoma cutâneo de células T [110-112].

A JAK3 Val718Leu não foi previamente descrita em tumores hematológicos e está localizada no domínio pseudoquinase (JH2) da proteína JAK3, mais precisamente no éxon 16, região funcional da proteína. Conforme demonstrado por Cornejo et al [110], o domínio JH2 da JAK3 interage com transdutores de sinais e ativadores de transcrição (via STAT) e regula negativamente a atividade quinase do domínio JH1. Portanto, mutações na região do DNA correspondente ao domínio JH2 podem estar implicadas em prejuízo da atividade quinase de JAK3 e consequente hematopoiese defeituosa. Walters e colaboradores [113] relataram as mutações A572V e V722I, também localizadas no domínio JH2 da JAK3, em pacientes com AMLK e AMLK-DS, e Kiyoi et al [112] descreveram três novas mutações nesse mesmo domínio, A573V, M576L e A593T, em pacientes com AMLK e doença mieloproliferativa transitória.

Tendo em vista que as pacientes do caso 1 sofreram exposição de longa data a agrotóxicos (DDT), decidiu-se pesquisar também o perfil de mutações nos genes que codificam enzimas metabolizadoras de xenobióticos (painel de bioinformática 2). De acordo com Palodetto et al [95], muitas dessas enzimas são polimórficas, de modo que alguns polimorfismos são capazes de alterar a atividade enzimática e, consequentemente, modificar a resposta ao tratamento e a resistência a drogas, bem como aumentar o risco de desenvolver neoplasias. Dos genes que compõem o painel de bioinformática 2, aqueles que codificam enzimas do citocromo P450 (CYP) merecem especial destaque, uma vez que cerca de 50% das drogas de uso comum são metabolizadas por esta família de enzimas [114]. Muitas enzimas do CYP polimórficas metabolizam numerosos compostos toxicologicamente significativos, tais como aditivos alimentares, poluentes, solventes e drogas recreativas [115].

Três variantes identificadas em genes CYP no caso 1 foram selecionadas para futura investigação: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop e CYP2B6 Thr67Met. Nenhuma dessas variantes foram descritas em neoplasias mieloides até o momento, no entanto, alguns SNPs no gene CYP2B6 (p. ex. CYP2B6 G516T e CYP2B6 G15631T) foram associados a uma maior susceptibilidade a alterações cromossômicas, tais como -7/del(7q), -5/del(5q), +8, +21 ou t(8;21), em leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda e síndromes mielodisplásicas [116]. Embora a variante CYP2B6 Thr67Met não tenha sido previamente associada a alterações cromossômicas, a citogenética de MO da paciente III-2, onde essa variante foi detectada, evidenciou monossomia do cromossomo 7 em 35% das metáfases analisadas (conforme citado na seção Casuística).

Nenhum estudo anterior demonstrou polimorfismos e ou mutações no gene CYP2A6 associados a casos de neoplasias hematológicas, constatação esta que é extensiva à variante de terminação prematura CYP2A6 Ser467Stop, também identificada em CD34+ de MO da paciente III-2. Esse gene codifica uma enzima homônima, também conhecida como nicotina C-oxidase, que é responsável pelo metabolismo de substâncias como a nicotina (estimulante), cumarina, diclobenil (herbicida) e ácido valpróico (anticonvulsivante) [117]. Indivíduos que possuem a forma polimórfica CYP2A6*4C estão associados a um risco reduzido de câncer de pulmão, devido à menor capacidade metabólica da enzima hepática CYP2A6, mas não pela possibilidade de uma relação entre a forma CYP2A6*4C e mutações em oncogenes ou antioncogenes [118].

Variantes Identificadas no Caso 2

Após filtragens nos genes dos painéis de bioinformática 1, 3 e 4 nesse caso, foram selecionadas três variantes para validação e investigação futuras: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala e FANCB Gly335Glu. Essas três variantes foram detectadas em três distintos genes que têm em comum função de reparo de danos ao DNA, de modo que mutações neles localizadas podem estar relacionadas a um risco aumentado para síndrome mielodisplásica e outros distúrbios mieloides. A constatação de que essas variantes estão presentes no tumor (CD34+) e em células de linhagem germinativa (CD3+) é sugestiva de que estas alterações sejam herdadas na paciente desse caso.

A variante missense ATM Pro1054Arg (rs1800057) já foi previamente associada a um risco aumentado de câncer de próstata [119] e carcinoma diferenciado de tireoide [120], mas ainda não havia sido relatada em neoplasias hematológicas. O gene ATM tem um papel central no reparo de danos ao DNA porque codifica uma quinase ativada por quebras de cadeia dupla do DNA que leva à ativação de múltiplas (e complexas) vias de sinalização [121]. Estudo desenvolvido por Shi e colaboradores [122] com 307 pacientes com LMA revelou que 4,3% dos pacientes continham a variante 4138C>T (His1380Tyr) no gene ATM e que a resposta pós- quimioterapia foi pior nos indivíduos com esta variante. No mesmo estudo [122], a análise da resposta à quimioterapia em 159 pacientes com LMA mostrou que os indivíduos LMA ATM 4138CT heterozigotos (8/159) tiveram por unanimidade uma sobrevida global menor

(média estimada de 7 meses) que os indivíduos LMA ATM 4138CC homozigotos (151/159) (sobrevida média de 11meses).

Por sua vez, a variante RAD51C Thr287Ala (rs28363317) tem sido extensamente relatada na literatura sobre a sua ocorrência em pacientes com câncer de mama e ou ovário [123-127], mas não foi descrita em neoplasias mieloides até o momento. Estudo conduzido por Vuorela et al [127] com 147 casos familiares de câncer de mama em indivíduos finlandeses concluiu que a RAD51C Thr287Ala é uma alteração benigna nesse tipo de câncer devido à sua baixa prevalência nos pacientes investigados. O gene RAD51C é um membro da família do gene RAD51 e considerado essencial para a via de recombinação homóloga de reparo de quebras de DNA dupla-fita, resultantes do processo de replicação do DNA ou induzida por agentes que danificam o DNA. Mutações nesse gene foram recentemente consideradas fatores predisponentes para a anemia de Fanconi e cânceres de mama e ovário [127].

A terceira variante selecionada para validação, Gly335Glu, está situada no gene FANCB, o único dos “genes de Fanconi” ligado ao cromossomo X e que, assim como os demais membros desse grupo, está relacionado com o desenvolvimento da anemia de Fanconi, uma doença genética rara caracterizada por falência da medula óssea, malformações congênitas variáveis e alta predisposição para desenvolvimento de cânceres, o que inclui leucemias [129]. Mutações em FANCB estão implicadas em risco muito alto de desenvolver leucemia mieloide aguda e síndrome mielodisplásica e risco extremamente elevado para tumores sólidos específicos [130]. A variante FANCB Gly335Glu não foi previamente reportada em neoplasias mieloides, mas foi selecionada para futura investigação devido à importância desse gene nos mecanismos de reparo do DNA, embora a frequência da variante em todas as populações combinadas tenha sido maior que 1% (GMAF = 3,66%).

Variantes Identificadas no Caso 3

Duas variantes identificadas nos genes dos painéis 1, 3 e 4 no caso 3 obedeceram aos critérios de seleção para futura investigação: a substituição missense ATM Ser333Phe e a inserção frameshift PAPD5 Val572insSer (ou PAPD5 Val525insSer).

A variante rara Ser333Phe no gene ATM foi a única variante comum encontrada na medula óssea (CD34+) e nas células de linhagem germinativa (CD3+) dos três pacientes desse caso, o que é indicativo de que esta alteração tenha sido herdada nesses indivíduos. Também

não há registros dessa variante em neoplasias hematológicas. A ativação da via de sinalização da quinase ATM promove a fosforilação de diversas proteínas que são responsáveis por funções como reparo de danos ao DNA, parada do ciclo celular, remodelamento da cromatina e indução da apoptose [121]. Portanto, mutações situadas em regiões funcionais da proteína ATM podem comprometer toda a cascata de sinalização orquestrada por ela.

A última variante que cumpriu os critérios de seleção para investigação posterior foi a PAPD5 Val572insSer, detectada no tecido tumoral (CD34+) do pai (I-2) e do filho mais jovem (II-3) da família 3, e também na linhagem germinativa (CD3+) do pai. Esses dados podem indicar que a referida variante foi herdada no pai, mas não é possível sugerir que o mesmo ocorreu no filho mais jovem. Mutações no gene PAPD5 ainda não foram relatadas em neoplasias mieloides.

O gene PAPD5 é um dos sete membros da família de polimerases de poli (A) não- canônicas (PAPs) em células humanas que possui atividade de poli (A) RNA polimerase e está envolvido na degradação de mRNAs de histonas dependente de uridilação [131]. A adição de uma cauda poli (A) à extremidade 3' do mRNA no núcleo de células eucarióticas confere estabilidade ao mRNA e permite o seu transporte para fora do núcleo e a sua tradução eficiente no citoplasma [131]. Burns e colaboradores [132] propõem que a polimerase PAPD5 atua como um supressor tumoral por prolongar a vida do mRNA que codifica o supressor tumoral TP53 por meio de poliadenilação e, consequentemente, promover a senescência celular. Tendo em vista a relevância do gene PAPD5 nos mecanismos de controle pós-transcricional, é importante prosseguir com a validação da variante PAPD5 Val572insSer nos pacientes do caso 3.

CONCLUSÕES

Baseado nos resultados obtidos, conclui-se que:

 Em todos os casos foi possível identificar, por meio de programas de predição, ao menos uma variante rara (GMAF < 1%) e ou deletéria, possível ou provavelmente patogênica em conjuntos de genes implicados no desenvolvimento de neoplasias mieloides:

o Caso 1: GATA1 Thr263Met em MO e SP de ambas as pacientes (III-2 e III-3) e JAK3 Val718Leu na MO da irmã mais jovem (III-3);

o Caso 2: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala e FANCB Gly335Glu (neste último, GMAF = 3,66%) na MO e SP da paciente II-1;

o Caso 3: ATM Ser333Phe na MO e SP dos três pacientes sequenciados e PAPD5 Val572insSer (ou Val525insSer) na MO do pai (I-2) e do filho mais jovem (II- 3) e no SP do pai;

 Três variantes ainda não relatadas em neoplasias mieloides foram encontradas em genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas nas pacientes com mielofibrose primária, caso 1: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop e CYP2B6 Thr67Met;

 As predições moleculares de GATA1 demonstraram que a treonina (T263) afetada pela inserção da variante está localizada no domínio dedo de zinco C-terminal e, portanto, em região funcional e altamente conservada da proteína. Além disso, a Met263 inserida na forma mutante não mantém a interação com a Thr265.

Todas as variantes que cumpriram os critérios de seleção serão validadas por meio de sequenciamento de Sanger (e ou restrição enzimática) e avaliadas quanto ao seu potencial deletério através de estudos funcionais. Estudos de ligação familiar (linkage) nos demais indivíduos das famílias contempladas por este estudo também serão conduzidos.

REFERÊNCIAS

1. Murati A, Brecqueville M, Devillier R, Mozziconacci M, Gelsi-Boyer V, Birnbaum D. Myeloid malignancies: mutations, models and management. BMC Cancer 2012;12:304.

2. Shih AH, Abdel-Wahab O, Patel JP, Levine RL. The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer 2012; 12(9):599-612.

3. Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ, Porwit A, et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009;114(5):937- 51.

4. Fröhling S, Scholl C, Gilliland DG, Levine RL. Genetics of myeloid malignancies: pathogenetic and clinical implications. J Clin Oncol 2005;23(26):6285-95.

5. Kelly LM, Gilliland DG. Genetics of myeloid leukemias. Annu Rev Genomics Hum Genet 2002;3:179-98.

6. Riether C, Schürch CM, Ochsenbein AF. Regulation of hematopoietic and leukemic stem cells by the immune system. Cell Death Differ 2015;22(2):187-98.

7. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, et al. The sequence of the human genome. Science 2001;291(5507):1304-51.

8. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409(6822):860-921.

9. Braggio E, Egan JB, Fonseca R, Stewart AK. Lessons from next-generation sequencing analysis in hematological malignancies. Blood Cancer J 2013;3:e127.

10. Matynia AP, Szankasi P, Shen W, Kelley TW. Molecular genetic biomarkers in myeloid malignancies. Arch Pathol Lab Med 2015;139(5):594-601.

11. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW, editors. World Health Organization Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th ed. Lyon: IARC Press; 2008.

12. Jones AV, Cross NCP. Inherited predisposition to myeloproliferative neoplasms. Ther Adv Hematol 2013 Aug;4(4): 237-53.

13. Emanuel RM, Dueck AC, Geyer HL, Kiladjian JJ, Slot S, Zweegman S, et al. Myeloproliferative Neoplasm (MPN) Symptom Assessment Form Total Symptom Score: Prospective International Assessment of an Abbreviated Symptom Burden Scoring System Among Patients With MPNs. J Clin Oncol 2012;30(33):4098-103.

14. Bejar R, Levine R, Ebert BL. Unraveling the molecular pathophysiology of myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol 2011;29:504-15.

15. Rollison DE, Howlader N, Smith MT, Strom SS, Merritt WD, Ries LA, et al. Epidemiology of myelodysplastic syndromes and chronic myeloproliferative disorders in the United States, 2001-2004, using data from the NAACCR and SEER programs. Blood 2008 Jul;112(1):45-52.

16. Cazzola M, Malcovati L. Myelodysplastic syndromes--coping with ineffective hematopoiesis. N Engl J Med 2005 Feb;352(6):536-8.

17. Garcia‐Manero G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk‐ stratification and management. Am J Hematol 2015 Sep;90(9):831-41.