Para a determinação do padrão de expressão das Variantes A e B do gene Dpr1, utilizamos a técnica de hibridação in situ para embriões inteiros de galinha. Para o experimento, utilizamos embriões de galinhas no estádio HH 21.
4.7.1 Síntese de ribossonda
Para a realização dos ensaios de hibridação in situ foram sintetizadas duas sondas de RNAm
dos
antisense diferentes. Uma delas foi construída para a detecção exclusivamente
transcritos de RNA da Variante maior (utilizando como molde o fragmento de 111 pb presente apenas nesta Variante) e a outra capaz de detectar ambas as Variantes (utilizando um segmento do exon quatro) (Figura 8). Dessa forma, por meio de comparação entre os domínios de expressão evidenciados por estas duas sondas, foi possível determinar se as Variantes A e B são co-expressas nos mesmos tecidos embrionários ou se têm padrões de expressão espacial e temporal distintos.
Figura 8. Diagrama ilustrando os locais de construção das sondas utilizadas nos ensaios de hibridação in situ. Esquema do RNAm produzido pela Variante B e A representados em A e B respectivamente. Os quatro exons presentes nos transcritos do gene
representados por E1, E2, E3 e E4. O fragmento adicional de 111 pb presente Variante A é representado por uma caixa hachurada. Os locais de
Dpr estão apenas na construção da sonda estão representados por traço roxo e círculo rosa.
As sondas foram preparadas a partir de seu respectivo DNA molde, utilizando as enzimas T3 ou T7 RNA polimerase para gerar um RNA
(Figuras 9 e 10).
antisense por transcrição in vitro
Figura 9. Sonda sintetizada para detectar exclusivamente a expressão da Variante A. Em A, diagrama do plasmídeo no qual foi clonado o fragmento de 111 pb. Em B, seqüenciamento
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Figura 10. Sonda sintetizada para detectar a expressão das Variantes A e B. Em A, diagrama do plasmídeo no qual foi clonado o fragmento do exon 4. Em B, seqüenciamento da sonda. O fragmento do exon 4 está destacado em vermelho.
Os plasmídeos contendo os DNAs de interesse foram submetidos à PCR utilizando os primers M13 direto e M13 reverso a fim de amplificar a seqüência-molde para a síntese da ribossonda. Os produtos de PCR foram submetidos a extração com fenol:clorofórmio (1:1) e clorofórmio 100%, com o intuito de eliminar eventual atividade de RNAses. Os produtos de PCR foram precipitados e ressuspendidos em água tratada com Dietilpirocarbonato (H2 O DEPC). Depois de efetuada a ressuspensão, o DNA purificado foi utilizado para a transcrição e marcação da ribossonda. Para tanto, adicionamos, a 1P g de DNA purificado, 2 P L de de de tampão de transcrição 10X (10X
uma mistura contendo
transcription buffer-Ambion), 2 P L de 0,1M de DTT, 2P L
ribonucleotídeos e UTP conjugado a Digoxigenina (DIG), 0,5P L inibidor de RNAse, 1 P L da T3 RNA polimerase e água livre de ribonucleases para completar o volume final de 20 P L e incubamos a 37°C por duas horas. Após a incubaç ão, adicionou-se ao tubo 2P L de DNAse I (2U) (Fermentas) para remover o produto de PCR utilizado como
molde. Esta mistura foi incubada durante 15 min. a 37 o C e depois colocada em gelo. O RNA transcrito foi purificado em coluna (Sigma S5059) e ressuspendido em 30
ribonucleases e armazenados a -20°C.
P L de água livre de
Para verificar a qualidade da ribossonda sintetizada retiramos uma alíquota de 1P L da solução final ressuspendida a fim de verificar, através de eletroforese em gel de agarose 1%, a qualidade da ribossonda sintetizada, através da intensidade e definição da banda obtida para cada ribossonda.
4.7.2 Ensaios de hibridação in situ (Whole mount)
Os embriões foram reidratados através de banhos seriados decrescentes de metanol em PBT (75%, 50% e 25%) por 5 min. em cada solução e duas lavagens em PBT por 5 min. à temperatura ambiente. Em seguida, foram incubados em solução de peróxido de hidrogênio (H2 O2 ) a 6% em PBT por uma hora à temperatura ambiente (esta etapa é utilizada para que ocorra a inativação das fosfatases endógenas que poderiam gerar reação de fundo, dificultando nossas análises). Após serem lavados em PBT, os embriões foram tratados com Detergente mix (Igepal 1%, SDS 1%, Deoxicolato de sódio 0,5%, Tris-HCl 50mM ph 8.0, EDTA 1mM pH8,0 e NaCl 150mM). Este tratamento consiste em três banhos com a solução de Detergente Mix por 20 min. cada, à temperatura ambiente. Essas lavagens são fundamentais, pois permitem o acesso ao RNAm pela ribossonda no interior de cada célula no momento da hibridação, sem que o embrião tenha sua integridade comprometida. A ação do detergente mix é interrompida lavando-se os embriões duas vezes em PBT durante 5 min. à temperatura ambiente. Após esse período os embriões são refixados em solução de PFA 4% contendo glutaraldeído a 0,25% em PBS por 20 min. e lavados em seguida três vezes por 5 min. em PBT à temperatura ambiente. Os embriões fixados foram incubados em tampão de Pré-Hibridação (formamida 50%, SSC 5X pH 4,5, 50 P g/mL de RNA de levedura,
de NBT em NTMT, protegidos da luz, a fim de até a reação atingir a intensidade desejada. Para
39 SDS 1% e 50
de Hibridação menos 12
P g/mL de heparina) durante 2 horas a 71o C. A hibridação foi feita em Tampão (tampão de Pré-Hibridação contendo 1 P g/mL da ribossonda), durante pelo
lavados a 71°C em Solução X horas a 71o C. Em seguida, os embriões foram
(formamida 50%, SSC 2X pH 4,5 e SDS 1%) pré-aquecida quatro vezes durante 30 minutos. Após o tratamento com Solução X, os embriões foram lavados por 10 min. a 71°C em Solução X 50% pré-aquecida e MAB
lavados rapidamente por três vezes
Lev,Tw 50%. Após esse período os embriões foram em solução tampão MAB
NaCl 150mM, Levamisole 2mM e
Lev,Tw (ácido maléico 100mM, Tween 20-0,1%, em pH 7,5) à temperatura ambiente. Em seguida, os embriões foram lavados duas vezes por 30 min. em solução tampão MAB Lev,Tw à temperatura ambiente
bloqueio Boehringer
. Após essa etapa, os embriões foram pré-bloqueados em reagente de Mannhein (BMB) a 2% em tampão MAB
temperatura ambiente. Posteriormente, os embriões
Lev,Tw durante uma hora à continuaram a ser pré-bloqueados em uma solução de alta concentração protéica (BMB 2%, soro de ovelha inativado 10% em tampão MAB
anticorpo
Lev, Tw ). A etapa de pré-bloqueio é importante para bloquear sítios aos quais o eventualmente se ligar inespecificamente. Após o pré-bloqueio os poderia
embriões foram incubados em solução contendo regente de bloqueio a 2% em tampão MAB Lev,Tw , 1% de soro de ovelha inativado e anticorpos anti-DIG conjugados à fosfatase alcalina na titulação de 1:2000 durante pelo menos 12 horas a 4°C. Em seguida, os embriões foram lavados em tampão MAB Lev,Tw à temperatura ambiente (oito banhos de uma hora), e pelo menos por mais 12 horas a 4
Antes de começar a
o C.
revelação do sinal, os embriões foram lavados quatro vezes por 10 min. em solução tampão NTMT (NaCl 100mM, Tris 100mM pH 9,5, MgCl
20 0,1%, Levamisole 2mM) à temperatura ambiente. Após essas
2 50mM, Tween- lavagens, os embriões foram tratados com Tampão NTMT juntamente ao substrato para fosfatase alcalina, BCIP/NBT (117 detectar a P g/mL de BCIP, 225 fosfatase P g/mL ação da alcalina
interromper a reação, os embriões foram lavados em PBT1X, fixados em PFA 4% a 4 o C por pelo menos 12 horas. Após a fixação os embriões foram lavados em PBS1X e armazenados em glicerol 80% em PBT (banhos seriados crescentes de glicerol em PBT 25%, 50% e 80% por 5 min. em cada solução à temperatura ambiente).
4.8 Análise dos embriões inteiros (Whole mount)