Biologia do Desenvolvimento do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à pesquisa do
conheci: meu Vô Chico
Agradecimentos
“Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo..." Fernando Pessoa
Obrigada aos meus pais, por sempre incentivarem os meus estudos e oferecerem todas as condições para que eu pudesse ter o melhor aproveitamento nas minhas escolhas. Vocês representam força, persistência e determinação. Sem dúvida, vocês são o maior exemplo que tenho na vida e representam toda a base da minha realização pessoal e profissional.
Aos meus irmãos Bia e Grilo, meu profundo e eterno agradecimento, pelo auxílio, amor e por todos os momentos vividos. Sempre com carinho e bom humor, vocês me deram conselhos valiosos que sempre me ajudaram a enfrentar os desafios. Obrigada por acreditarem em mim mais do que eu mesma. Amo muito vocês dois.
À minha orientadora e amiga Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, pelos inúmeros conselhos recebidos, por toda paciência, confiança e apoio. Agradeço por sua generosidade em compartilhar seu conhecimento. Aqui, deixo registrado todo meu respeito e admiração pela grande profissional que você representa para mim.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. José Xavier-Neto, pelas brilhantes sugestões, pela orientação, e pela oportunidade de trabalhar ao seu lado. Mais que um co-orientador, você é uma inspiração para mim.
Ao Prof. Dr. Luís Violin que desde o período de graduação sempre me encorajou na minha decisão em seguir a carreira acadêmica. Com certeza, você tem uma contribuição significativa neste trabalho. Muito obrigada pelas orientações, pelo comprometimento e pelas palavras amigas. Ao seu lado cresci muito, tanto no lado pessoal como profissional.
À Carla, minha grande companheira de bancada. Obrigada pelos conselhos, carinho, amizade, e principalmente pelas risadas.
Ao pessoal do Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do InCor (Ally, Ana, Bruno, Hoza, Marcos, Mary, Rô e Sylvia), muito obrigada pela amabilidade com que sempre me acolheram, pela disponibilidade, atenção e generosidade. Vocês fazem parte dos momentos mais lindos e divertidos do meu mestrado. Vocês são demais.
Aos meus amigos, Ayana, Gus, Kiki, Paty, e Buja , pela paciência e compreensão com que sempre me ouviram e pela sensatez com que sempre me ajudaram, quero que sintam que este trabalho tem, também, um pouco de todos vocês. Obrigada por fazerem parte da minha vida e pelo dom incomparável de tornar os dias mais divertidos.
Às minhas fadas madrinhas Carol e Junia, pelo apoio permanente e incondicional e pela amizade sempre demonstrada. Graças a vocês meus dias se tornaram mais mágicos... Bibidi-Bobidi-Bu
A todos os alunos do Departamento de Histologia e Embriologia pela ajuda e amizade sempre presentes.
Ao Prof. Dr. José Garcia Ribeiro Abreu Júnior e todos os seus alunos, por contribuir com minha pesquisa fornecendo os Xenopus e por toda hospitalidade com que me receberam.
À Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini e todos os seus alunos e funcionários do Laboratório de Diversidade Genética do IB/Unicamp pela ajuda indispensável à realização deste trabalho.
Ao Prof. Márcio Pie pela ajuda nas análises de seleção positiva.
Agradeço à Liliam Panagio, secretária de pós-graduação do programa de Biologia Celular e Estrutural, pela atenção sempre a mim dispensada, assim como sua eterna disponibilidade.
Aos funcionários Rita e Juvani, pela ajuda constante e incansável.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural por terem oferecido diversas oportunidades possibilitando meu crescimento profissional e pessoal.
Aos órgãos de fomento à pesquisa: FAPESP, CNPq e FAEPEX cujo apoio financeiro possibilitou a realização deste trabalho.
são consistentes com a hipótese de que o mecanismo de acelerando a evolução, reduzindo a seleção negativa.
Alternativo é um mecanismo importante para expandir a diversidade protéica em
Splicing
eucariotos. Este processo permite a produção de diferentes mRNAs a partir de uma mesma molécula de pré-RNA e é freqüentemente utilizado pelos genes envolvidos no desenvolvimento embrionário. O gene
sinalização Wnt, atuando em
Dapper1 (Dpr1) é um importante modulador da via de
diversos processos como especificação do tecido neural, morfogênese cefálica e desenvolvimento do coração e olho. Entre seus parceiros estão as moléculas Dishevelled, o fator de transcrição TCF-3 (ambas as moléculas envolvidas na sinalização Wnt) e Dbf-4 (regulador do ciclo celular). Considerando que Dpr1 possui uma estrutura modular e interage com diferentes parceiros moleculares através de diferentes domínios estruturais, esta molécula poderia utilizar a maquinaria de
combinar diferentes domínios e conseqüentemente ampliar suas
Splicing Alternativo para
funções biológicas. Neste , identificada inicialmente no estudo, descrevemos uma nova Variante do gene Dpr1
transcriptoma de camundongo utilizando ferramentas de Bioinformática. Esta nova Variante é maior em 111 pb em relação à codificada pela seqüência referência de RNAm para Dpr1 RefSeq, as quais são denominadas, respectivamente, como Variante A e Variante B. Estes transcritos variantes são gerados por dois sítios aceptores de Splicing distintos presentes no início do exon 4. O segmento exclusivo da Variante A codifica 37 aminoácidos localizados na região onde Dpr1 se associa ao fator transcricional TCF-3. Uma análise comparativa do lócus de
revelou
Dpr1
que
entre diversos vertebrados (peixe, anfíbio, galinha, camundongo e humano) ambos os sítios aceptores de
enquanto que em peixe apenas um sítio é
Splicing são conservados nos tetrápodas,
encontrado. Ensaios de RT-PCR confirmaram nossos resultados obtidos em Bioinformática. Além disso, demonstramos que ambas as Variantes são co-expressas ao longo do desenvolvimento de galinha, sugerindo que a concentração relativa dessas moléculas pode ser importante para a sua função. Finalmente, análises de pressão seletiva foram realizadas para a molécula de Dpr1. Apesar de não se confirmar a presença de seleção positiva ao longo da proteína Dpr1, o exon 4 parece estar sob pressão seletiva mais relaxada quando comparado aos outros exons. Nossos resultados
relative concentration of these Finally, even though no evidence of positive selection was detected for the entire Dpr1 protein, exon 4 seems to be under more relaxed selective pressure than the other exons. These results are consistent with the notion that alternative splicing can act as a mechanism for opening accelerated paths of evolution by reducing negative selection pressure.
ix
Alternative splicing is an important mechanism to expand protein diversity in eukaryotes. This process allows the production of different mRNAs from a single coding sequence and is frequently used by genes involved in development.
modulator of Wnt signalling, working in several
Dapper 1 (Dpr1) is an important
developmental processes, such as neural tissue specification, head morphogenesis, heart and eye development. While its interaction with Dishevelled is known to modulate Wnt signalling both
with other molecules is required to mediate its multiple
in vivo and in vitro, the interaction
biological functions. Considering that Dpr1 has a modular structure that mediates its interaction with different partners through different structural domains, this molecule could greatly benefit from alternative splicing in order to combine different domains and consequently amplify its biological functions. In the present study we describe a new
transcriptome using bioinformatic
Dpr1 isoform that was initially identified in the mouse
tools. This isoform is 111 pb longer than the one encoded by the RefSeq mRNA for
transcripts are generated
Dpr1, here named D and E isoforms, respectively. The variant splice sites in exon 4. The segment through two distinct acceptor
isoform is in frame and encodes 37 residues located in a variable region of exclusive of the D
Dpr1 exon 4, known to be necessary for the interaction with the transcriptional factor Tcf3.
comparative analysis of the revealed that in tetrapods
Dpr1 locus among fish, frog, chicken, mouse and human
two acceptor splice sites are conserved in the beginning of the exon 4, while in fish a single acceptor splice site is found. RT-PCR using species-specific primers confirmed the expression of the
isoform was detected. In addition, we throughout chicken development,
D and E isoforms in tetrapods while in fish only the D showed that the
suggesting that the molecules may be important for their functionality.
Domínio protéico do tipo Zíper de Leucina, do inglês Alk4/5 Receptores serina-quinases, do inglês
APC
receptor serine kinases
Gene humano supressor de tumor, do inglês β-cat Beta-catenina
adenomatosis polyposis coli
CBP Proteína de ligação ao CREB, do inglês cDNA
CREB binding protein
Molécula de DNA complementar, do inglês CK Molécula que fosforila Beta-catenina na
casein kinase
Cof Cofator
Complementary DNA
via de sinalização Wnt, do inglês
Co-Smad Proteína Smad humana homóloga a de C-terminal Carboxi-terminal
Dbf-4 Proteína necessária para o início da
Dumbbell former 4
DEP
Drosophila
replicação em eucariotos, do inglês
Domínio C-terminal da proteína Dishevelled DIX Domínio N-terminal da proteína Dishevelled DKK Inibidor da via Wnt, do inglês
DNA
Dickkopf
Ácido desoxirribonucléico, do inglês Dpc Dias pós-coito
Dpr
deoxyribonucleic acid
Proteína antagonista de Dishevelled, do inglês
Dsh Dishevelled
Dapper
EST Seqüência expressa marcada, do inglês Frizzled Receptor de membrana que participa
Expressed Sequence Tag
em várias vias de sinalização, inclusive a via Wnt
FRODO Ortólogo de Dpr no genoma de Xenopus , do inglês Functional Regulator Of
Disheveled in Ontogenesis
GBP Proteína de ligação a GSK3, do inglês GSK3
GSK3 Binding Protein
Glicogênio Sintase Quinase três, do inglês Hpf Horas pós-fertilização
Glycogen Synthase Kinase 3
LEF1 Fator de transcrição, do inglês LRP5/6 Co-receptor das
Lymphoid Enhancer-binding Factor 1
glicoproteínas secretadas na via de sinalização Wnt, do
Low density lipoprotein Receptor-related Protein 5/6
inglês
Int
xi N-terminal Amino-terminal
pb Pares de base
PCP Via Wnt de polaridade celular- planar, do inglês P lanar Cell Polarity PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês
PDZ Domínio central da proteína Dishevelled Poli-A Poliadenilação
Polymerase Chain Reaction
Pré-RNA Molécula de RNAm precursora, do inglês,
RC Regiões Conservadas
Precursor mRNA
RefSeq Seqüência referência do inglês Reference Sequence RNA Ácido ribonucléico, do inglês
RNAm
Ribonucleic acid
Ácido ribonucléico mensageiro
R-smads Molécula participante da via TGF-β, do inglês receptor regulated Smads RT-PCR Transcriptase reversa, do inglês
sFRP Molécula inibidora do receptor
protein
Smad Proteína envolvida na
Reverse Transcriptase PCR
Frizzled , do inglês S ecreted Frizzled-Related
sinalização celular, do inglês
decapentaplegic
Mothers against
snRNAs Ribonucleoproteínas nucleares, do inglês Small nuclear RNA SRD
TCF TGF-β
Wnt
Domínio rico em Serinas, do inglês S erine-Rich Domain Fatores de transcrição celular, do inglês
Família gênica composta por fatores
Transcription cell factor
de crescimento, do inglês
Growth Factor beta
Transforming
Importante via de sinalização, da combinação em inglês dos nomes dos genes
vários modelos... 59
xiii
Tabela 1. Número de acesso das seqüências analisadas... 27 Tabela 2.
Tabela 3.
Primers utilizados nas reações de RT-PCR ... 30
Seqüências dos primers utilizados para a amplificação do segmento de 111 pb exclusivo da Variante A de galinha ... 31 Tabela 4. Estádios e principais características morfológicas dos embriões de galinha... 34 Tabela 5. Resultados de LRTs para seleção positiva... 58 Tabela 6. Sítio onde a taxa dN/dS foi maior que as baseadas no Naive Empirical Bayes
(Yang et al. 2005)...58 Tabela 7. Resultado das análises de Verossimilhança Máxima do gene Dpr1 utilizando
ClustalW http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index
dCODE http://www.dcode.org
Ensembl http://www.ensembl.org
Genome Browser, UCSC http://genome.ucsc.edu
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Orf finder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf TreeBeST http://treesoft.sourceforge.net/treebest Zpicture http://zpicture.dcode.org
Sabe-se que organismos eucariotos são capazes de produzir diferentes O gene
Universidade da
Dapper1 ( Dpr1) foi descoberto em 2002 pelo grupo do Dr. Cheyette da
Califórnia (UCFS) em ensaios de dois híbridos em levedura, que buscavam identificar novos parceiros moleculares da proteína Dishevelled (Dsh), molécula-chave na via de sinalização Wnt (Cheyette
proteína Frodo, altamente
et al. , 2002). Em paralelo, Gloy et al. (2002) descreviam a
sua habilidade para relacionada à Dpr1, também isolada por
interagir fisicamente com Dsh. Após a identificação inicial no anfíbio Xenopus , ficou claro que genes da família
vertebrados, não
Dapper ( Dpr ) estavam presentes no genoma de todos os outros
obstante não tenham sido identificados genes ortólogos no genoma de organismos invertebrados. No genoma do anfíbio Xenopus laevis , tetraplóide, existem os genes
no
Dpr1 e Frodo, gerados provavelmente por um processo recente de duplicação gênica
genoma desses organismos. Na galinha, foram identificados dois ortólogos Dpr , Dpr1 e
Dpr2 Dpr1
o de
. No camundongo e no homem existem três membros compondo esta família gênica , Dpr2 e Dpr3 (Fisher et al., 2006).
Aos genes que compõem a família inibição da indução mesodérmica, o
Dpr foram atribuídos diversos papéis, dentre eles
de atuação na morfogênese cefálica e do olho, na coordenação de movimentos morfogenéticos e na cardiogênese (Cheyette et al., 2002; Gloy
funções é
et al. , 2002; Waxman et al., 2004; Zhang et al., 2006). Esta multiplicidade de
possível, pois as proteínas Dpr possuem habilidade de interagir com diferentes parceiros moleculares. A capacidade de interagir com diversas moléculas sugere um caráter adaptador e modulador às proteínas da família Dpr. Assim, dependendo do contexto celular no qual elas estejam inseridas, estas proteínas podem desempenhar diferentes papéis ao longo da embriogênese dos vertebrados. Essas interações são mediadas por domínios estruturais distintos, que têm sido conservados entre os parálogos desta família (Waxman et al., 2004;
RNA Zhang et al., 2004).
utilizadas para validar os dados de Bioinformática através de ensaios de RT-PCR, foram encontradas em todos os vertebrados analisados, com exceção do peixe que
3
estratégias genéticas, como uso de promotores alternativos, produção de transcritos
antisense e, particularmente, pelo uso do mecanismo conhecido como Splicing Alternativo.
Este mecanismo permite que um conjunto limitado de genes dê origem a diferentes proteínas ampliando assim a diversidade protéica. Freqüentemente genes relacionados ao desenvolvimento embrionário sofrem
única molécula-molde possam ser
Splicing Alternativo, permitindo que a partir de uma
geradas proteínas estrutural e funcionalmente distintas, capazes de atuar em diferentes contextos durante o desenvolvimento dos vertebrados.
Tendo em vista que as proteínas da família Dpr aparentemente apresentam uma estrutura modular composta por blocos estruturais/funcionais distintos, os quais medeiam sua interação com diferentes proteínas e ainda, que as proteínas Dpr estão envolvidas na embriogênese de vertebrados, imaginou-se que diferentes estratégias genéticas possam ser utilizadas por esta família gênica para gerar transcritos variantes com funções distintas. Assim, este estudo teve como objetivos: 1) estudar a evolução do gene
vertebrados, visando caracterizar a estrutura desta proteína no que concerne à
Dpr1 em
de presença blocos estruturais que foram conservados filogeneticamente, 2) identificar e caracterizar possíveis transcritos alternativos gerados a partir do lócus Dpr1 .
Este estudo constatou que o gene Dpr1 apresenta uma estrutura composta por quatro exons e três introns, que tem sido conservada ao longo da evolução e que a proteína codificada por ele possui organização em mosaico, caracterizada por segmentos conservados entremeados por segmento variáveis ao logo da molécula. Através de dados de Bioinformática constatou-se a existência de pelo menos quatro transcritos distintos do gene
Dpr1 no transcriptoma de camundongo: dois gerados por Splicing Alternativo do exon 3
(Variantes A e B), um transcrito contendo primeiro exon alternativo (Variante C) e um transcrito
Variantes
antisense
A e B,
empregados e verificou-se que no estádio HH21 do desenvolvimento de galinha as Variantes A e B possuem alguns sítios de expressão diferentes (aorta dorsal, somitos e 1° e 2° arcos branquiais), indicando assim que cada Variante está envolvida em processos de desenvolvimento distintos.
possui apenas a Variante A. Além disso, constatou-se que tanto a Variante A como a B são co-expressas ao longo do desenvolvimento embrionário de galinha, desde as fases iniciais da embriogênese até a organogênese. Por fim, ensaios de hibridação in situ foram
2.1 Importância das vias de sinalizações para a Embriogênese
A maioria dos processos do desenvolvimento depende da ação de algumas poucas famílias de fatores parácrinos que, em conjunto, coordenam a formação de praticamente todos os tecidos e órgãos dos embriões de metazoários. Além de coordenar a formação de complexos seres multicelulares, os mesmos fatores parácrinos quando ativados em momentos não apropriados são capazes de desencadear doenças importantes no homem, em particular o câncer (Polakis, 2000). Por este motivo, entender o funcionamento destas moléculas, em particular no que se refere a ativação de vias de sinalização molecular específicas e identificar possíveis agentes moduladores de sua atividade, tem uma grande importância para a pesquisa básica e aplicada.
Dentre os fatores parácrinos envolvidos em processos do desenvolvimento, bem como em doenças humanas, estão as glicoproteínas de secreção da família Wnt. Estas moléculas exercem diferentes funções durante a embriogênese, como estabelecimento de destinos celulares, controle dos níveis de proliferação celular, coordenação da migração de grupos de células para os sítios de diferenciação, determinando a polaridade das células e controlando a apoptose (Wodarz & Nusse, 1998). Nocaute gênico em camundongos levou à inativação da maioria dos genes Wnt. Os fenótipos dos embriões mutantes revelaram que estes genes atuam na morfogênese de inúmeros tecidos e órgãos. Por exemplo, a inativação do gene
devido à bem
Wnt-4 causa ausência de rins (Stark et al., 1994), masculinização nas fêmeas
ausência do canal de Müller e do desenvolvimento continuado do canal de Wolff, como defeitos na morfogênese da glândula mamária durante a gestação (Vainio et al. , 1999). O nocaute de
membros,
Wnt-7A também tem efeito pleiotrópico, que inclui a ventralização dos
infertilidade feminina devido à falha na regressão do canal de Müller e atraso na maturação morfológica das rosetas glomerulares do cerebelo (Hall et al., 2000; Parr & McMahon , 1998).
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Após serem liberadas por células secretoras, as moléculas Wnt dirigem-se às células- alvo ligando-se aos receptores de membrana Frizzled e aos co-receptores LRP5/6 (Miller et
al.,1999). Esta interação leva à fosforilação da proteína citoplasmática Dishevelled (Dsh)
que, uma vez fosforilada, age neutralizando o complexo de degradação da proteína E -catenina. Desta forma, a
onde interage com
E -catenina acumula-se no citoplasma e entra no núcleo das células, fatores de transcrição para estimular a expressão de genes-alvo específicos (Gordon & Nusse, 2006) (Figura 1).
Figura 1. Via de sinalização Wnt/ E -catenina ou via Wnt canônica. Em (A) temos a representação de uma célula na ausência de sinais Wnt, nas quais os genes-alvo da proteína multifuncional E -catenina são reprimidos. Nelas, Dishevelled (Dsh) encontra-se desfosforilado e é incapaz de interagir com o complexo de degradação da
cat), composto por APC, GSK3, axina, dentre outras proteínas. Assim, fosforilada e marcada para degradação via proteossomo. Em (B), sinais
E -catenina ( E - E -catenina é Wnt levam à fosforilação de DSH, que sofre modificações estruturais que permitem a sua ligação com o complexo de degradação da
catenina, que se acumula
E -catenina. Esta associação impede a degradação da citoplasma das células e ingressa no núcleo,
E -
no onde
juntamente a fatores transcricionais da família TCF de genes-alvo específicos. Outros componentes
(T-cell factor s) vai ativar a expressão Wnt são representados da sinalização
no esquema acima. Proteínas do complexo de degradação Û APC, GBP,
ademomatous polyposis coli Ü CBP, CREB binding protein Ü CK, casein kinase Ü GSK3 binding protein Ü GSK, glycogen synthase kinase . Inibidores Wnt: DKK, Dickkopf Ü sFRP, secreted Frizzled-related protein . Receptores de membrana: Frizzled Ü LRP, LDL-receptor related protein . P representa fosforilação. Figura baseada em Moon et al . (2004).
2.2 A descoberta das proteínas Dapper por meio de sua interação com Dsh
Foi buscando isolar novas proteínas capazes de interagir com Dsh, que dois grupos isolaram, quase que simultaneamente, as proteínas Frodo e Dapper1 (Dpr1) de
usando respectivamente os domínios de ligação PDZ e DEP de Dsh como “isca”
Xenopus,
no ensaio de dois híbridos em levedura (Cheyette et al.,
,
2002; Gloy et al., 2002). O gene identidade de
Frodo é
altamente relacionado com o gene Dpr1 apresentando 90% de seqüência entre si (Gloy et al., 2002). Acredita-se que Frodo tenha surgido através de uma duplicação gênica recente que aconteceu no genoma desses organismos (Brott & Sokol, 2005). Embora tanto Frodo quanto Dpr1 sejam capazes de interagir fisicamente com Dsh, os detalhes moleculares da interação entre estas moléculas ainda não são conhecidos. Além disto, enquanto Frodo parece ser um modulador positivo da sinalização Wnt/ E -catenina (Gloy et al., 2002), Dpr1 foi inicialmente descrito como um modulador negativo das vias Wnt/ E -catenina e PCP (Cheyette
induz a
et al., 2002). Neste contexto, Dpr1 liga-se fisicamente a Dsh, no citoplasma, e
desta molécula através do mecanismo lisossômico e proteossômico degradação
(Figura 2) (Yau mecanismos de
et al.,
ação
2005; Zhang et al ., 2006). Um maior entendimento sobre os destas proteínas poderá auxiliar na compreensão dos processos que regulam a sinalização Wnt.
9
Figura 2. Proteína Dpr atuando como regulador negativo da via de sinalização Wnt. Na presença de Dpr a via de sinalização Wnt é bloqueada. Dpr interage fisicamente com a molécula Dsh e a encaminha para degradação. Dessa forma, o complexo protéico formado pelas moléculas APC, GSK3, axina, captura a molécula β-catenina (β-cat) e a leva para via de degradação impedindo assim a expressão dos genes alvos da via Wnt.
A descoberta da proteína Dapper2 (Dpr2) ocorreu inicialmente pela busca por seqüências relacionadas às proteínas Frodo e Dpr1 de Xenopus em bancos de dados. Mas apenas em 2004 surgiram os primeiros trabalhos relatando a clonagem, a caracterização do padrão de expressão e a realização de ensaios funcionais para determinar a função desta proteína no peixe-zebra (Gillhouse et al., 2004 Ü Waxman et al., 2004 Ü Zhang et al., 2004).
2.3 A descoberta de mais um membro da família Dpr no genoma dos vertebrados
Em 2006, Fisher e colaboradores da Universidade da Califórnia identificaram o terceiro membro da família
bibliotecas de cDNA e
Dpr, denominado Dapper3 (Dpr3 aos
). Para tanto, o grupo buscou em EST seqüências relacionadas outros dois membros descritos codifica uma proteína 20% menor em relação aos outros dois membros anteriormente. Dpr3
e apresenta maior identidade de seqüência com Dpr1 (27%) do que com Dpr2 (24%) (Fisher
et al., 2006).
A expressão de Dpr3 foi descrita para embriões de camundongos, nos quais na região ventral de somitos maduros, nos brotos dos transcritos foram encontrados
membros, no mesênquima craniofacial, nos arcos branquiais, nos arcos aórticos e no sistema nervoso central.
2.4 Proteínas Dpr estão envolvidas na modulação de pelo menos duas vias de sinalização
Interação com a via de sinalização Wnt
A interação das proteínas Dpr com a sinalização Wnt foi constatada através de ensaios de dois híbridos em levedura utilizando a proteína Dsh como isca (Cheyette et al., 2002; Gloy et al., 2002). Nestes ensaios, verificou-se que a proteína Dpr possui um domínio
medeia a sua interação com Dsh através de seu domínio PDZ (Figura 3)
PDZ-binding que
(Cheyette de
et al., 2002; Gloy et al., 2002). Essa interação foi demonstrada através de ensaios
co-precipitação de Dsh com diferentes construções delecionais de Dpr, as quais continham diferentes domínios desta proteína (Cheyette et al., 2002; Gloy et al., 2002). Posteriormente, Hikasa & Sokol (2004) descobriram que Dpr1 é capaz de interagir com a via Wnt não apenas por intermédio da proteína Dsh, mas também por meio do fator Tcf-3, outro componente da via de sinalização Wnt. Recentemente descobriu-se que a proteína Dpr1, além de estar presente no citoplasma, também pode ser observada no núcleo de algumas células, interagindo com os complexos β-actina – LEF1, controlando o progresso do ciclo celular (Gao et al., 2008).
11
Figura 3. Diagrama ilustrando a interação da proteína Dpr com Dsh. A proteína Dpr é capaz de interagir com a proteína Dsh através da ligação de seu domínio PDZ binding (PDZ-B) com o domínio PDZ de Dsh. Outros domínios são representados no diagrama: Zíper de Leucina (LZ); DIX; Basic e DEP.
Interação com via de sinalização TGF-β
A via de sinalização ativada pela molécula Nodal, pertencente à família dos fatores de crescimento e diferenciação TGF-beta, pode ser modulada por um dos membros da família Dpr, conhecido como Dpr2. A molécula Nodal está presente apenas nos cordados, e tanto sua estrutura como a via de transdução de sinal são conservadas evolutivamente, sugerindo que suas funções estejam relacionadas às características deste grupo, em particular a assimetria bilateral (Schier, 2003).
Nodal atua na indução do mesoderma e do endoderma durante a gastrulação, na determinação do eixo ântero-posterior e no estabelecimento de assimetria bilateral (Tian & Meng, 2006).
A transdução de sinal via molécula Nodal ocorre através da ligação de um homodímero com receptores quinase serina/treonina do tipo I e II, de maneira semelhante ao que acontece com as demais moléculas da superfamília TGF- E (Tian & Meng, 2006). Após esta ligação, ocorre a ativação do receptor do tipo II que por sua vez ativa o receptor do tipo
I, fosforilando-o em seu domínio quinase intracelular. O receptor do tipo I ativado fosforila a molécula citoplasmática R-Smads (R-s) que então forma um complexo com outra molécula citoplasmática conhecida como Co-Smad (Co-s). Este complexo molecular, R-Smads/Co- Smad, é translocado para o núcleo e juntamente ao cofator CoF, ativa a transcrição de genes específicos com o auxílio de fatores de transcrição basais (Tian & Meng, 2006).
Dpr2 é capaz de modular a via de sinalização ativada por Nodal devido a sua capacidade de interagir com os receptores Alk4 e Alk5, marcando-os para serem degradados via lisossomo (Zhang
ensaios de
et al., 2004). Esta habilidade das moléculas Dpr2 foi demonstrada por
superexpressão em embriões de peixe-zebra, nos quais se observou um comprometimento da especificação mesodérmica (Zhang et al., 2004).
2.5 Comparação das proteínas Dpr1 e Dpr2 dos diferentes vertebrados
A comparação das proteínas Dpr1 de diferentes organismos evidencia uma elevada conservação de seqüência ao longo da evolução (47% de identidade de seqüência entre homem e anfíbio), particularmente quando são comparadas a região N-terminal e carboxi- terminal destas moléculas (Gillhouse
um domínio de interação
et al., 2004). A região N-terminal conservada apresenta
do tipo zíper de leucina, semelhante ao domínio proteína-proteína
das distrofinas, que é responsável pela interação destas proteínas com complexos protéicos transmembranares (Gillhouse
conservada medeia a ligação motivo de ligação ao
et al., 2004; Gloy et al., 2002). Por sua vez, a região C-terminal
de Dpr1 com Dsh e apresenta, na sua extremidade final, um domínio PDZ (PDZ-B), importante para a interação física entre estas duas proteínas (Gillhouse
As proteínas Dpr2
et al., 2004; Gloy et al., 2002).
mostram um menor nível de conservação de seqüência (25% de identidade de seqüência entre homem e anfíbio), embora elas apresentem, da mesma forma como Dpr1, domínios particularmente conservados nas regiões N-terminal e carboxi-terminal
13 realizado por Waxman
longo de toda a
et al. (2004) revelou a presença de cinco domínios conservados ao
extensão destas moléculas, dentre os quais apenas os domínios zíper de leucina e o motivo de ligação ao domínio PDZ descritos previamente são conhecidos (Figura 4).
Figura 4. Diagrama ilustrando a característica modular das proteínas Dapper (Dpr), juntamente com seus parceiros moleculares. A família das proteínas Dpr possui 778 aminoácidos, os quais apresentam cinco regiões conservadas filogeneticamente (RC1-RC5) que provavelmente são importantes na interação de Dpr com seus diferentes parceiros moleculares. Em RC2 está presente um domínio amino-terminal do tipo zíper de leucina e um domínio rico em serinas dispostos de forma adjacente. A RC5 contém um domínio PDZ-
entre
binding. os
O Fator de Transcrição 3 (TCF-3) interage com a proteína Dpr1 na porção aminoácidos 186 e 337, onde está incluído um segmento da RC2 e a RC3. O Receptor da Sinalização Nodal (ALK5) interage com a proteína Dpr2 na porção entre os aminoácidos 1 e 337, que engloba RC1, RC2 e RC3. Dishevelled (Dsh), membro da via de sinalização Wnt, se liga à proteína Dpr através do domínio PDZ-binding. A molécula reguladora do ciclo celular Dbf-4 interage com Dpr na porção medial da molécula.
Através da análise das interações bioquímicas entre Dsh e construções delecionais de Frodo contendo diferentes domínios desta proteína, foi possível confirmar que a sua região C-terminal é a responsável pela ligação Dsh-Frodo. Assim, a deleção do segmento carboxi-terminal, ou mesmo apenas dos resíduos correspondentes ao motivo PDZ-B, resulta em uma molécula incapaz de ligar-se fisicamente com Dsh (Gloy et al.,
a
2002). De maneira semelhante, Cheyette
correspondentes ao
et al. (2002) mostraram que a deleção ou mutação dos resíduos PDZ-B de Dpr1 elimina a sua capacidade interativa com Dsh. motivo
Além disso, foi demonstrado que uma construção de expressão contendo exclusivamente o domínio conservado C-terminal atua como um mutante dominante-negativo de Frodo, inibindo a atividade indutora de eixo secundário de Dsh em embriões de Xenopus (Gloy et
al., 2002). Intrigados pelo fato de que, não apenas a deleção do domínio C-terminal, mas
também da região amino-terminal de Frodo, antagoniza os efeitos de Dsh, Hikasa & Sokol (2004) descobriram que esta porção da proteína é capaz de interagir com Tcf-3, outro componente da via de sinalização Wnt.
Por meio da análise de outros mutantes delecionais de Dpr1 e Dpr2 será possível, no futuro, estabelecer a função específica de cada um dos diferentes domínios conservados entre estas moléculas. Além disso, através de ensaios bioquímicos, novos “parceiros” funcionais das proteínas Dpr poderão ser identificados, facilitando a compreensão dos mecanismos de atuação destas.
2.6 Padrão de expressão de Dpr1 e Dpr2 durante o desenvolvimento embrionário e vida pós-natal
Ao longo do desenvolvimento embrionário, cada membro da família padrão de expressão distinto em relação ao local e estádio de
Dpr apresenta um
desenvolvimento embrionário ., 2006). Durante o início do desenvolvimento há uma expressão muito fraca dos restringindo-se apenas a regiões de tecido materno e extra-embrionário. Esse expressão inicial pode ser observado em todos os organismos vertebrados (Fisher genes padrão et al Dpr , de
analisados até o momento (Fisher et al., 2006).
Alguns animais tiveram o padrão de expressão dos genes Dpr caracterizado ao longo de todo seu desenvolvimento embrionário. Esses padrões serão descritos a seguir.
intermediário e o botão caudal
15
Danio rerio
Durante a fase de gástrula inicial, transcritos o blastoderma e, posteriormente, são detectados no
Dpr1 são encontrados ao longo de todo
mesoderma e no endoderma, incluindo o organizador (Gillhouse
Na fase de
et al., 2004; Waxman et al.,2004
Dpr1
Ü Zhang et al., 2004).
gástrula média a expressão de é observada no mesoderma axial derivado do organizador e na placa neural posterior. Ao final da gastrulação, a expressão de
Dpr1
em
é vista na placa neural anterior (Gillhouse et al., 2004). Durante a somitogênese,
duas faixas de expressão
Dpr1 é expresso nos somitos, aparecendo posteriormente
na região que supostamente origina o mesoderma intensa
cefálico.
Mais tarde pode-se observar expressão de finalmente em vários tecidos como
Dpr1 na retina, na placa segmentar e retina, bem como no botão caudal cérebro, hipotálamo e
(Gillhouse et al., 2004Ü Waxman et al., 2004). Em contraste,
expressão bem
Dpr2 não possui uma expressão intensa nem apresenta um padrão de
definido quanto de gástrula inicial na região
Dpr1. No entanto, transcritos Dpr2 na
são observados na fase marginal do blastoderma dorsal, área do anel germinativo, onde estão localizadas células precursoras do mesoderma (Gillhouse et al., 2004
no
Ü Zhang et
al. , 2004).
Posteriormente, Dpr2 é expresso abundantemente na notocorda e mesênquima cefálico, como também no mesoderma paraxial (Gillhouse et al. , 2004). Durante a somitogênese (fase de três somitos), transcritos de
cérebro posterior e a medula espinhal anterior,
Dpr2 concentram-se no limite entre o
adjacente ao rombômero 5 (Waxman et al. , 2004). Na fase de 12 somitos, a expressão de
mais maduros, e fraca nos somitos
Dpr2 é acentuada nos somitos anteriores,
recém-formados (Waxman incluem o mesoderma
et al. , 2004). Outros sítios
adicionais de expressão de Dpr2 (Gillhouse et al., 2004).
lateral do embrião e parece estar envolvida na formação do tecido muscular ., 2006).
Xenopus laevis
Durante a fase de blástula tardia/gástrula inicial a expressão de na região do pólo animal, localizada na região marginal dorsal do
Frodo é concentrada
embrião (Cheyette 2002). Posteriormente, em fase de nêurula, é possível
et al. ,
2002; Gloy et al., observar os
placa neural anterior. Nas fases mais adiantadas da embriogênese, a é observada nos placóides ectodérmicos, incluindo as regiões que irão transcritos
expressão
Frodo na
de Frodo
formar os olhos e as vesículas ópticas, bem como nos arcos branquiais (Gloy et al., 2002).
Dpr1
dorsal do
pode ser encontrado em anfíbios na fase de gástrula inicial, na região do lábio blastóporo, no local que coincide com o início dos movimentos morfogenéticos e marca o Organizador de Spemann (Cheyette et al., 2002).
Na fase de neurulação, sendo detectado mais tarde
Dpr1 é expresso no ectoderma presuntivo posterior e anterior,
em grande concentração nas dobras neurais e no botão caudal
é expresso na região cefálica, incluindo o cérebro, a retina e os (Cheyette
No
et al., 2002).
girino, Dpr1
elementos cartilaginosos derivados dos arcos branquiais (Cheyette
Mus musculus
Durante o desenvolvimento de camundongo, transcritos
et al., 2002).
do gene Dpr1 podem ser detectados nas regiões que originarão o tecido mesodérmico. Durante a somitogênese, é encontrado ao longo de todos os somitos, e na fase de nêurula está presente no
Dpr1
septo Dpr1 transversal, no mesênquima cranial e no mesoderma caudal (Hunter et al ., 2006). também é observado na retina e nos arcos mandibulares (Fisher et al., 2006).
Análise envolvendo porção dorsal e
Dpr2 indicou que a expressão desse gene está concentrada na
17
Vida Pós-natal
RNAm de Dpr1 podem ser detectados nos tecidos que formam o sistema nervoso central, enquanto que
urinário e timo (Fisher Recentemente resultados
Dpr2 está restrito à formação de glândulas salivares, aparelho excretor et al., 2006).
foram produzidos camundongos nocautes para o gene mostraram que os camundongos homozigotos negativo para desenvolviam normalmente, nasciam e possuíam um desenvolvimento
Dpr2. Dpr2
Os se pós-natal normal. Contudo, esses camundongos apresentavam uma re-epitelização e uma cicatrização de feridas de pele aceleradas. Foi demonstrado que nos animais nocautes para
migração acelerada de queratinócitos devido a um aumento na sinalização
Dpr2 TGF- havia uma β (Meng 2008). Splicing do RNAm et al., 2.7
Na grande maioria dos organismos eucariotos o segmento de DNA que corresponde a um gene é composto por regiões codificadoras (exons) separadas por regiões não codificadoras (introns) (Graveley, 2001). Durante o processo de transcrição há formação de uma molécula denominada transcrito primário (pré-RNA) que para ser traduzida deverá passar por uma série de alterações, dentre elas a retirada exata dos introns. A remoção dos introns que compõem o transcrito primário é denominada “
ordenada do pré-RNA). Este processo ocorre dentro do núcleo RNA madura (RNA mensageiro), que será encaminhada ao
Splicing e dá
” (corte e emenda origem à molécula de citoplasma, onde poderá ser ., 2007).
traduzida (Li et al
Os introns são removidos das moléculas de pré-RNAs através de um mecanismo pelo qual pequenas seqüências consenso, localizadas nas junções entre exons e introns, são reconhecidas por um complexo molecular formado por proteínas e ribonucleoproteínas conhecido como spliceossomo (Black, 2003; Li et al ., 2007). Através de inúmeros
alinhamentos de genes de organismos eucariotos pode-se concluir que na maioria das vezes os introns começam com as bases GT e terminam com as bases AG. Apesar de identificadas essas seqüências (GT-AG), pouco se sabe como acontece o exato reconhecimento das junções intron/exon (Figura 5A) (Black, 2003).
O spliceossomo é composto por quatro ribonucleoproteínas nucleares (snRNAs), U1, U2, U4/U6 e U5, e por volta de 50 a 100 proteínas. Este complexo molecular é responsável por reconhecer as junções entre introns e exons, clivar e auxiliar na união dos exons que irão compor o RNA mensageiro (Figura 5B). Primeiramente, a snRNA U1 e a U2 reconhecem as seqüências consenso dos sítios aceptores de
formando a estrutura do pré-spliceossomo. associadas, de uma maneira ainda não
Splicing
Em
5’ (GU) e 3’ (AG) respectivamente, seguida as snRNA U4/U6 e U5 são conhecida, e formam o spliceossomo. Neste momento os sítios aceptores de
esterificação ocorrem, resultando na
Splicing estão alinhados e duas reações de
trans-remoção do intron e na junção dos exons (Black, 2003; ., 2007; Patel & Steitz, 2003).
Graveley, 2001; Li et al
Em muitos casos o processo de mesmo transcrito primário. Este
Splicing pode criar diferentes proteínas a partir de um
fenômeno é chamado de uma mesma molécula de pré-RNA sofra diversas
Splicing Alternativo e permite que
possibilidades de combinações formando diferentes proteínas funcionais (Black, 2003; Bruno et al., 2004; Nagao et al., 2005; Tress et
al ., 2008; Xing & Lee, 2006). Dessa forma, um único gene pode gerar diferentes proteínas
graças a inúmeras maneiras de remover os introns e os exons de um determinado pré-RNA. Há seis principais formas de ocorrer Splicing
saltar
Alternativo: promotores alternativos, Splicing
e sítio 3’ alternativo, Splicing 5’ alternativo, exons ( skipping ), retenção de intron de combinações podem ser feitas poliadenilação alternativo (Figura 6). Assim, diferentes
resultando em um aumento considerável no número de proteínas produzidas por um mesmo gene (Black, 2003; Li et al., 2007; Nagao et al., 2005).
complexidade
complexidade do organismo como um todo, ampliando a gama de informações que podem ser geradas por um dado genoma, produzindo variantes de proteínas estrutural e funcionalmente distintas a partir de um único gene (Graveley, 2001).
Este processo de diversificação da função gênica e controle da expressão parece ser particularmente importante durante o desenvolvimento embrionário, pois multiplica as
19 O
o
Splicing Alternativo pode ser a chave para explicar a discrepância encontrada entre
número de genes e de proteínas de uma determinada espécie. No caso de humanos, foram encontrados cerca de 35.000 genes em seu genoma; no entanto seu proteoma é formado por cerca de 300.000 a um milhão de proteínas. O número aumentado de proteínas em relação ao número de genes pode ser explicado através do mecanismo de
Alternativo, pois aproximadamente 60% dos genes humanos passam por este
Splicing
processo e assim, geram uma enorme diversidade protéica (Black, 2003; Li
2005).
O aumento da diversidade protéica
et al., 2007; Nagao et al.,
também pode explicar os resultados encontrados pelos diferentes projetos genomas. Acreditava-se que quanto maior a complexidade de um organismo, maior seria sua quantidade de genes. No entanto, ao final de diferentes projetos genomas, os resultados mostraram que esta hipótese não era verdadeira. Quando levamos em consideração o nível de complexidade dos organismos, a quantidade de genes encontrada para os humanos (cerca de 35.000 genes) é muito próxima à encontrada para a mosca
19.000 que a
D. melanogaster (cerca de 13.000 genes) e para o nematelminto C. elegans (cerca de
genes) (Black, 2003; Graveley, 2001). Após o seqüenciamento genômico, ficou claro complexidade dos organismos não pode ser explicada pela quantidade de genes apresentada, mas sim pela diversidade protéica. Recentemente, identificaram que mais de 60% dos genes humanos sofrem
40% dos genes sofrem esse
Splicing Alternativo, enquanto que em drosófila menos de
processo (Tress quantidade de proteínas expande a
et al., 2008). Acredita-se que o aumento da
informações genéticas que dirigem a construção dos embriões altamente complexos dos organismos vertebrados (Nagao et al., 2005; Tress et al., 2008).
Figura 5. Diagrama ilustrando a maquinaria de Splicing. A) Molécula de pré-RNA. GU e AG indicam as seqüências consenso que o spliceossomo irá reconhecer nas extremidades 5’ e 3’ do pré-RNA. B) Formação do complexo spliceossômico. U1, U2, U4/U6 e U5 correspondem a snRNA e suas proteínas associadas que reconhecem as seqüências consenso, retiram o intron e unem os exons.
21
Figura 6. Principais tipos de Splicing Alternativo. Uma mesma molécula de pré-RNA pode gerar diferentes moléculas de RNA mensageiro. Promotor alternativo: O início da transcrição pode começar em diferentes promotores (ilustrados em dois tons de rosas).
alternativo promovem aumento ou diminuição de um determinado
Splicing 3’ ou 5’ de poli-A exon. Sítios
alternativo: diferentes sítios de poli-adenilação provocam aumento ou diminuição no tamanho do transcrito. Retenção de intron: um intron pode ser removido ou retido do RNA mensageiro. Exclusão de exon: um exon pode ser retido ou excluído do RNA maduro. Promotores são indicados com flechas; sítios de poliadenilação (poli-A) com AAAAA; seqüências constitutivas em caixas azuis; segmentos que podem ou não ser incluídos em caixas lilás; intron por barra lilás.
23 3.1 Objetivo geral
Os objetivos gerais deste estudo foram estudar a evolução do gene vertebrados, e investigar se estratégias de diversificação da função gênica, como
Dpr1 em
o durante o desenvolvimento de
Splicing
Alternativo, eram utilizados pelo gene amniotos.
3.2 Objetivos específicos
Dpr1 organismos
1) Comparar a estrutura do gene 2) Alinhar as seqüências de
Dpr1de diferentes organismos vertebrados. de proteínas produzidas a partir do lócus domínios conservados filogeneticamente, cDNAs e
de diferentes organismos, visando identificar
Dpr1 bem
como regiões da molécula 3) Comparar o
Dpr1 que estão evoluindo mais rapidamente.
lócus gênico ESTs disponíveis nos bancos de identificar possíveis transcritos
Dpr1 de camundongo com as seqüências de cDNAs e
dados Unigene e do browser genômico USCS, para variantes produzidos por
estratégias genéticas de diversificação funcional. 4) Verificar a conservação filogenética das
Splicing Alternativo ou por outras
Variantes identificadas, por meio da de diferentes vertebrados.
isoformas preditas nas análises de comparação das seqüências genômicas do lócus
5) Validar em laboratório a existência
Dpr1 das
25 4.1 Análises de Bioinformática
4.1.1 Comparação da estrutura do gene e da proteína Dpr1 de diferentes vertebrados
As seqüências genômicas de cDNAs e de proteínas de diferentes organismos
vertebrados foram obtidas no browser genômico Ensembl
(http://www.ensembl.org/index.html). Pequenas modificações nas anotações disponibilizadas neste site foram realizadas manualmente, sempre que necessário. Os alinhamentos, tanto de nucleotídeos quanto de proteínas, foram feitos com o programa ClustalW, usando os parâmetros padrão (DNA Gap Open PenaltyZ15.0/DNA Gap Extension PenaltyZ, 6.66/DNA MatrixZIdentity/Protein Gap Open PenaltyZ10.0/Protein Gap Extension PenaltyZ0.2/ Protein matrixZGonnet/Protein/DNA ENDGAPZK 1/Protein/DNA GAPDISTZ4).
4.1.2 Análises de seleção positiva A partir do
obtidas 25
browser genômico Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) foram
seqüências de proteína do gene (Tabela
Dpr1 , sendo em sua maioria de mamíferos
1). Essas seqüências foram alinhadas usando o programa Prank, uma vez que este é capaz de fornecer alinhamentos evolutivos bastante precisos (Löytynoja & Goldman, 2008). Testes para seleção positiva foram realizados baseados no método de Verossimilhança Máxima (ML) de acordo com Yang
3.1 (Yang, 2007). Nesta análise, diversos modelos para os dados e seus resultados são
et al. (2000) e implementados em PAML
de substituição de códon são ajustados avaliados usando o teste de razão de verossimilhança (LRTs). O primeiro passo do teste é verificar a existência de seleção positiva no conjunto de dados, ou seja, se há algum sítio com ω
o
> 1. Isto é feito contrastando o modelo nulo, que modelo mais geral onde essas condições são obtidas quando o método que permite a seleção modelo alternativo, no qual não ocorre seleção. O não permite sítios com
permitidas. As evidências positiva é
ω> 1, com estatísticas são significantemente melhor que o
dos vertebrados atualmente conhecida não foram corrigidas porque as análises de ML usadas neste estudo são robustas a erros moderados na topologia utilizada (Pie, 2006).
nível de significância é calculado como duas vezes a diferença sobre o valor da verossimilhança (2∆ln
de liberdade é
L ) de cada modelo, que é comparado à distribuição F2 , no qual o grau calculado como a diferença entre o número de parâmetros estimados com os números de modelos. Três LRTs foram realizados. A primeira comparação é entre M0 (uma taxa), modelo que ajusta uma única média
possui três classes discretas de sítios,
ω sobre todos os sítios, e M3 (discreto), o qual cada um com diferentes valores de
comparação é entre M1a (próxima ao modelo neutro), o qual permite duas
ω. A segunda
classes de sítio (0 <ω< 1 ouω
é
1 = 1), e M2a (seleção), o qual possui uma classe de sítio adicional ( ω> 1). O terceiro teste a comparação entre o modelo da pressão seletiva em distribuição beta que permite 10 classes de sítios, cada uma com ω< 1 (beta, M7), com outro método com 11 classes de sítio, que permite
mais estringente
ω> 1 (M8). A última comparação é o teste de seleção positiva (Anisimova et al., 2001). Finalmente, métodos baseados em Naive
Empirical Bayes (NEB) e Bayes Empirical Bayes (BEB) foram usados para identificar os
resíduos que pudessem estar sob seleção positiva (Yang foram removidos de todas as seqüências antes de se
et al., 2005). Os códons de parada
iniciar as análises. As filogenias feitas em PALM foram estimadas usando seqüências de aminoácidos no modelo WAG+ * +F, como implementada em RAxML-III (Stamatakis
topologias obtidas em relação à filogenia
27
Tabela 1. Número de acesso das seqüências analisadas.
Espécies Ensembl ID NCBI ID
Chimpanzé ( Pan troglodytes) ENSPTRP00000010852 XP_001165895 Gorila (Gorilla gorilla ) ENSGGOP00000015015
ENST00000335867 NP_057735 ENSPPYP00000006658 ENSMMUP00000001452 XP_001092593 ENSTSYP00000006239 ENSMICP00000004381 ENSPVAP00000004319 ENSMLUP00000007164 ENSTTRP00000008365 ENSBTAP00000025871 ENSCAFP00000022721 ENSEEUP00000008396 ENSMODP00000010125 ENSLAFP00000006293 ENSPCAP00000007938 ENSDNOP00000000163 ENSRNOP00000011466 ENSMUSP00000058943 NP_067507 ENSSTOP00000000199 ENSCPOP00000001820 ENSOCUP00000013008 ENSTBEP00000009754 ENSGALP00000019594 NP_001038157 ENSXETP00000026164 NP_001007950 Humano (Homo sapiens)
Orangutango (Pongo pygmaeus) Macaco ( Macaca mulatta) Tarsier (Tarsius syrichta) Lêmure (Microcebus murinus) Morcego (
Morcego (
Pteropus vampyrus Myotis lucifugus)
)
Golfinho (Tursiops truncatus) Boi (Bos taurus)
Cão (Canis familiaris)
Porco-espinho (Erinaceus europaeus) Gambá (Monodelphis domestica) Elefante (Loxodonta africana) Hyrax ( Procavia capensis) Tatu (Dasypus novemcinctus) Rato (Rattus norvegicus) Camundongo (Mus musculus)
Esquilo (Spermophilus tridecemlineatus) Porquinho da Índia (Cavia porcellus ) Coelho (Oryctolagus cuniculus ) Tree Shrew (Tupaia belangeri ) Galinha (Gallus gallus )
4.1.3 Identificação de possíveis variantes para os membros da família Dpr
Análises de Bioinformática foram realizadas com o intuito de encontrar transcritos variantes do gene variantes geradas camundongo, pois EST disponíveis Dpr1. para ele é
Para que essas análises pudessem identificar o maior número de essa família gênica, foi escolhido como organismo de estudo o o animal que possui o maior número de seqüências de cDNAs e nos bancos de dados para o gene
análises foram obtidas no Unigene Mm.46662
Dpr1. As seqüências empregadas nas
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/), bem genômico UCSC
como no browser (http://genome.ucsc.edu/). As seqüências disponíveis eram provenientes de diferentes tecidos e fases do desenvolvimento de camundongo (Anexo 1).
Utilizando a ferramenta zPicture (http://zpicture.dcode.org/) do seqüência (125 no total) foi
Comparative Genomic
alinhada com o lócus exemplo de como os
Center (http://www.dcode.org/), cada
genômico Dpr1 de camundongo. Na figura 7 pode-se observar um
resultados destes alinhamentos foram apresentados pela ferramenta zPicture.
Figura 7. Gráfico obtido pelo programa zPicture após o alinhamento do lócus Dpr1 do camundongo com a seqüência de interesse (EST ou cDNA). Os exons de
representados por quatro caixas azuis. Os segmentos intrônicos são
Dpr1 estão representados por flechas azuis. O eixo Y (%) representa o nível de identidade da seqüência de
seqüência de interesse. As barras verticais azuis representam identidade de
Dpr1 com a seqüência em regiões exônicas, enquanto a barra rosa, em regiões intrônicas.
29 4.2 Ensaios de RT-PCR
4.2.1 Extração de RNA total de embriões de galinha, camundongo e peixe-zebra
Amostras de RNA total foram obtidas a partir dos embriões de galinha (HH4 até E6), camundongo (10,5 dpc) e peixe-zebra (30 hpf). Para tanto, embriões inteiros desses animais foram transferidos para tubos de 1,5mL livres de RNAse e adicionados a eles TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) para homogeneização no vórtex até que todo o tecido fosse macerado. Em seguida, as amostras homogeneizadas foram incubadas por 5 min. à temperatura ambiente. Para cada 300µL do homogenado, adicionou-se 200µL de clorofórmio seguido de homogeneização em vórtex durante 30 segundos. Após 5 min. à temperatura ambiente o homogenado foi submetido à centrifugação por 15 min. a 12000 x g a 4°C. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo de 1,5mL e a ela foi acrescentada 500µL de ácool isopropílico, e após homogeneização suave, as amostras foram mantidas por 10 min. à temperatura ambiente. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12000 x g por 10 min. a 4°C e após completa remoção do sobrenadan te, adicionou-se 1mL de etanol 70% gelado para nova centrifugação por 10 min. a 7500 x g a 4°C. O sobrenadante foi descartado e ao pellet acrescentado 1mL de etanol absoluto gelado. Em seguida, as amostra foram centrifugadas a 7500 x g a 4°C por 10 min. Após, o sobrenadante foi removido e o pellet foi solubilizado em 40µL de H 2 O tratada com DEPC e estocadas a - 80°C.
4.2.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)
A partir do RNA obtido em 4.2.1, realizou-se a síntese do cDNA para posterior Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando o Kit SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para tanto, ao RNA total foi acrescentado H
volume final igual 10µL. Em seguida, esses
2 O tratada com DEPC a fim de se obter reagentes foram incubados a 65°C por 5 min. para que a denaturação do RNA fosse realizada e após, incubados em gelo. Posteriormente acrecentou-se Tampão 10X (Tris-HCl 200mM pH 8,4 e KCl 25 mM), Mg 2 Cl (3mM), dNTPs
(0,5mM de cada nucleotídeo), RNA Inhibitor e a enzima Transciptase Reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). A reação foi incubada por duas horas a 42°C e por fim incubada a 95°C por 5 min. para que ocorresse a inativação da enzima Transciptase Reversa. Os cDNAs obtidos nesta etapa foram utilizados em reações de PCR posteriormente.
4.2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para os ensaios de RT-PCR foram utilizados primers apropriados para cada amostra de cDNA obtida em 4.2.2 (Tabela 2). Todos os
hibridam em regiões que flanqueiam a junção
primers utilizados nas reações de PCR
entre o exon quatro e exon três, assim, em uma mesma reação de PCR é possível detectar ambas as Variantes. Cada reação de PCR foi feita em volume final igual a 25µL que incluíam 1µL de cDNA, 10pmol de primer direto e tampão reverso, 0,5mL de dNTP (0,2 mM de cada nucleotídeo), 1,5 mM de MgCl
de PCR 10X, 2,5% de DMSO e 1U de Taq DNA polimerase (LGC
2 , 4,5µl de
Biotecnologia, Brasil). As condições de todas as reações de PCR foram: Denaturação a 95°C por 30s; Anelamento dos
primers a 60°C por 30s; Extensão a 72°C por 2 min. Foram fe itos 35 ciclos e a extensão final
a 72°C por 10 min.
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de RT-PCR. Seqüências dos primers
Organismos Camundongo Galinha Peixe-zebra Direto: 5’ – GGTTTTATGAGCTGAGTGATGG – 3’ Reverso: 5' - GGTTTATTGGTCCTTACAGGG – 3’ Direto: 5’ – GGTTTTATGAGCTGAGTGATGG – 3’ Reverso: 5' - CTTGGTTTGTTAGTCCTTACAGAG - 3' Direto: 5’ – TGTGTTGAGCTGTCCAGAGG – 3’ Reverso: 5' - CTGGATAAAAACGGGGCTTT – 3’
31
4.3 Clonagem do segmento exclusivo da Variante A de galinha para confecção da sonda de RNA antisense a fim de ser empregada em ensaios de hibridação in situ
A região correspondente ao fragmento exclusivo da isoforma maior de Dpr1, produzida por Splicing 3´ alternativo do exon quatro, foi amplificada por PCR
partir de cDNA de galinha e clonada no plasmídeo
(Polymerase Chain
(Invitrogen,
Reaction ) a pCR4-TOPO
Carlsbad, USA). As etapas utilizadas para amplificação foram: denaturação inicial a 95°C por 30 s, anelamento inicial a 65°C por 30 s e extensão inicial a 72°C por 2 minutos. Para essa amplificação inicial foram realizados 5 ciclos que foram seguidos pela segunda amplificação: denaturação a 95°C por 30 s, anelamento a 60°C por 30 s e extensão a 72°C por 1 minuto. Para essa amplificação foram realizados 35 ciclos. Os oligonucleotídeos para amplificação desse segmento foram desenhados no início da região 5’ do segmento a ser amplificado e o
primer
sítios
reverso na região 3’. À seqüência dos de reconhecimento para as enzimas
primers direto e reverso foram adicionados
de restrição Cla I e EcoR I, respectivamente, visando facilitar as clonagens subseqüentes dos fragmentos amplificados (Tabela 3).
Tabela 3. Seqüências dos primers utilizados para a amplificação do segmento de 111 pb exclusivo da Variante A de galinha.
Organismo Seqüências dos primers
Galinha Direto: 5’ – cgg atcgat GCAGATCTCATAGGCTGGATG – 3’
Reverso: 5' - cgg gaattc AACGACATCGAGGGAATTTG - 3'
ClaI
4.3.1 Ligação do inserto ao vetor pCR4-TOPO e transformação de Escherichia coli A reação de ligação do segmento amplificado ao vetor pCR4-TOPO foi realizada de acordo com protocolo do fabricante (Invitrogen).
Após a ligação, foi realizada a transformação de Escherichia coli competentes através de choque térmico (primeiramente banho de gelo por 30 min., depois choque a 42ºC por 45 s e em seguida, banho de gelo por 3 min.). Foram adicionadas às bactérias transformadas 450µL de mei o Luria-Bertani (LB), seguindo-se incubação a 37ºC por uma hora sob agitação. Em seguida, 100µL de cultura foram plaqueados em meio seletivo contendo ampicilina. As placas foram acondicionadas em estufa bacteriológica por 14-16 horas a 37°C para o crescimento de colônias isoladas.
Colônias individuais foram inoculadas em 3µL de meio LB contendo antibiótico (ampicilina), seguida por incubação por 16 horas sob agitação à temperatura de 37°C para que as bactérias crescessem a fim de realizar a extração do DNA plasmidial das mesmas.
4.3.2 Screening dos clones positivos por meio de minipreparações de DNA plasmidial e digestão enzimática
Uma alíquota de 1,5mL da cultura em LB foi centrifugada por 1 min. a 13.000 rpm e o meio sobrenadante descartado.
Ao pellet foram adicionados 100µL de solução I (50mM glicose; 25mM Tris-HCl 1MpH8,0; 10mM EDTA 0,5MpH8,0 e 100mL de água Milli- Q), e 10µ L de RNAse A, seguindo-se homogeneização no vórtex. Foram acrescentados 200µL de solução II – solução de liseguindo-se (NaOH 0,2N e SDS 1%), a qual foi misturada por inversão do tubo por quatro vezes, com o cuidado de não fragmentar com agitação excessiva o DNA cromossômico bacteriano que poderia contaminar a preparação plasmidiana. Ao tubo anterior, acrescentou-se 150µL de solução III ou solução sedimentadora (60mL de acetato de potássio 5M; 11,5mL de ácido
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centrifugada por 5 min. à temperatura ambiente a 12.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um tubo limpo, com cuidado para não pipetar o material branco em suspensão, pois este contém DNA cromossômico e proteínas que podem contaminar a preparação de DNA plasmidial. O sobrenadante foi reservado e a ele foi acrescentado 1000
gelado para precipitação do DNA. A amostra foi centrifugada e o
P L de etanol absoluto sobrenadante descartado, de DNA. Foram realizadas lavagens com etanol 70% para retirar o restando um pellet
excesso de sais. O precipitado foi seco à temperatura ambiente e o pellet ressuspendido em 50 P L de água Milli-Q.
Cada uma das minipreparações de DNA foi submetida à digestão com a enzima para verificar se continham o inserto desejado.
Eco RI
4.4Coleta dos embriões de galinha para ensaios de hibridação in situ
Embriões de galinha em diferentes estádios do desenvolvimento embrionário foram obtidos de ovos fertilizados após incubação dos mesmos a 38,5
até o estádio desejado. Após a
o
C em atmosfera umidificada incubação, os embriões foram rapidamente dissecados para remoção das membranas extra-embrionárias em solução salina fosfatada (PBS). Para tanto, o conteúdo do ovo foi colocado em uma placa de Petri, mantendo o embrião voltado para a superfície. O albúmen que recobre o embrião foi retirado com lenço de papel e sobre o embrião, agora exposto, foi posicionada uma moldura de papel filtro que adere às membranas embrionárias e dessa forma possibilita que o embrião seja removido do ovo ao recortarmos as membranas ao redor.
4.5 Estadiamento dos embriões de galinha
O estadiamento dos embriões de galinha foi feito segundo os critérios descritos por Hamburger & Hamilton (1951) (Tabela 4).
Tabela 4. Estádios e principais características morfológicas dos embriões de galinha.
Estádios Tempo de
incubação Morfologia e Números de Somitos HH4 17 horas Linha primitiva definitiva
HH5 18-19 horas Formação do processo de cabeça
HH6 19-21 horas Dobra de cabeça
HH7 21-22 horas Um par de somitos
HH8 22-24 horas Quatro pares de somitos
HH9 29 horas Sete pares de somitos
HH10 33 horas Dez pares de somitos
HH12 48 horas 16 pares de somitos
HH13 50 horas 19 pares de somitos
HH14 52 horas Vinte e dois pares de somitos
HH15 53 horas 22 a 24 pares de somitos
HH16 55 horas HH17 60 horas HH18 65 horas HH19 68 horas HH20 70 horas HH21 3 dias e 1/2
Entre asas e patas 17 a 20 pares de somitos 29 a 32 pares de somitos
30 a 36 pares de somitos
37 a 40 pares de somitos
40 a 43 pares de somitos
