5.2 Busca de transcritos variantes gerados a partir do gene Dpr
5.2.3 Validação dos achados de Bioinformática: análise da expressão das Variantes A e B
5.2.3.1 RT-PCR
dados UCSC (http://genome.ucsc.edu). Foram encontradas 10 ESTs, das quais três foram obtidas a partir de ovos fertilizados (CR761983, AL862022 e AL861615), três de embriões em gástrula (CX424631, DC192007 e AL650941), uma de cérebro adulto (BC080457), uma de embriões na fase de botão caudal (CR410370), uma de tecido misto (BC080457) e uma de intestino de embrião (EL653703). O número de ESTs encontradas no banco de dados confirma a
53
confirmados. Para tanto, optou-se por ensaios de RT-PCR, uma vez que é um procedimento simples e de resposta a rápida. Dessa forma, ensaios de RT-PCR foram conduzidos utilizando amostras de embriões de galinha, camundongo, Xenopus e peixe-zebra.
Foram desenhados pares de diferentes espécies (humano,
primers flanqueando a região do exon 3 e exon 4 para as
camundongo, galinha, Xenopus e peixe-zebra) para serem empregados em ensaios de RT-PCR a fim de comprovar experimentalmente a existência das duas Variantes identificadas
experimento flanqueiam
in silico . Os pares de
aceptores de
primers Splicing
desenhados para este do exon 4 e permitem a ambos os sítios
identificação das duas Variantes simultaneamente na RNA total, extraídas de embriões de diferentes
mesma reação de PCR. Amostras de organismos vertebrados, foram utilizadas para a realização desse experimento.
Devido a dificuldades na padronização das reações de PCR de momento apenas os ensaios para camundongo, galinha e peixe-zebra experimentos confirmam a expressão de ambas as Variantes durante a
Xenopus,
foram
até o feitos. Os embriogênese de camundongo e galinha e apenas a expressão da Variante maior (Variante A) em peixe-zebra (Figura 18). Estes resultados corroboraram aqueles obtidos
Variantes são conservadas filogeneticamente nos
in silico , ou seja, que as duas
exceção do peixe, que vertebrados com
possui apenas uma delas (Variante A).
Como não foi possível amplificar as Variantes geradas pelo gene buscou-se por seqüências relacionadas à Variante A no banco
Dpr1
de
hipótese de que ambas as Variantes são expressas em Xenopus e que devem estar envolvidas em diversos contextos celulares, tanto em embriões quanto na fase adulta.
Figura 18. Expressão das Variantes A e B de Dpr1 em embriões de camundongo (Mm), galinha (Gg) e peixe-zebra (Zf) evidenciada por RT-PCR. O ensaio confirmou a expressão de ambas as Variantes durante a embriogênese de camundongo e galinha, enquanto o peixe-zebra apresenta apenas a Variante maior. As cabeças de flechas indicam os sítios aceptores de
Em uma
Splicing em cada Variante. As setas indicam o local dos
da análise da expressão das Variantes
primers .
in vivo
segunda etapa A e B
caracterizada a expressão temporal destas Variantes ao longo da ontogênese dada a facilidade de obtenção de embriões deste organismo. Amostras de
, foi de galinha, RNA de diversos estádios do desenvolvimento (HH4 até HH29) foram utilizadas nos ensaios de RT-PCR. Os resultados demonstram que as duas Variantes estão presentes desde as fases iniciais da embriogênese até a organogênese, revelando que ambas são co-expressas ao longo do
55
possa ser importante para o desenvolvimento embrionário de aves e, provavelmente, de outros organismos vertebrados.
Figura 19. Expressão das Variantes A e B durante a embriogênese da galinha. Em ensaios de RT-PCR, diferentes estádios do desenvolvimento de galinha foram analisados (HH4 até HH29). As duas Variantes são expressas ao longo de todos os estádios do desenvolvimento analisados. O controle negativo da reação está representado por (-).
5.2.3.2 Hibridação in situ
Ensaios de hibridação Nestes ensaios, o padrão de utilizando uma sonda
in situ foram realizados ao longo da ontogênese de galinha.
expressão espacial e temporal da Variante A foi estabelecido específica para o fragmento de 111 pb exclusivo desta Variante. Em paralelo, também foram conduzidas hibridações
segmento do exon 4 comum às Variantes A e
in situ
B.
utilizando uma sonda contendo um Dessa forma, por meio de comparação entre os domínios de expressão evidenciados por estas duas sondas, foi possível determinar se as Variantes A e B eram co-expressas nos mesmos tecidos embrionários ou se possuíam um padrão espacial e temporal de expressão mutuamente exclusivos.
Conforme pode ser observado na Figura 20, o padrão de expressão das Variantes A e B é distinto. Por exemplo, nos somitos e arcos branquiais observa-se expressão unicamente da Variante B. Por outro lado, nos olhos e nos membros, transcritos das duas Variantes são co-expressos.
Futuramente, ensaios de hibridação estádios do desenvolvimento a fim de
in situ serão realizados para embriões em outros
refinar o padrão de expressão das duas Variantes ao longo da ontogênese de galinha.
Figura 20. Diferença no padrão de expressão das Variantes A e B em embriões HH21. Em A) estão representados os padrões de expressão das Variantes A e B, e em B) apenas o padrão de expressão da Variante A. As Variantes apresentam co-expressão em vários sítios, no entanto, em somitos e nos arcos branquiais (1° e 2°) há apenas a expressão da Variante B (menor).
Devido ao padrão de expressão das Variantes A e B pode-se sugerir que essas duas Variantes apresentam funções distintas. Essa diferença de função pode ser explicada pelo fato de que a Variante A tem 37 aminoácidos a mais que a proteína gerada pela Variante B. A inserção deste fragmento acontece justamente na região onde a molécula
com seu parceiro TCF-3 (Hikasa & Sokol, 2004). Dessa forma, podemos
Dpr1 interage
acreditar que a inserção dos 37 aminoácidos possa modificar a capacidade de interação da Variante A com a molécula TCF-3. Neste contexto, a maquinaria de
gerar diferentes combinações das regiões
Splicing Alternativo estaria atuando para
conservadas das proteínas Dpr para que estas moléculas interajam com diferentes parceiros moleculares em contextos específicos.
57 5.3 Análise de seleção positiva no gene Dpr1
Diversos estudos têm mostrado que regiões que sofrem um padrão de substituição nucleotídica diferente das regiões
Splicing Alternativo possuem
constitutivas do gene. Estes Alternativo possuem uma taxa de & Mundy, 2004; Iida & Akashi 2000; estudos sugerem que regiões que sofrem
evolução maior que as regiões que não o
Splicing
sofrem (Filip
Xing & Lee, 2005). Para verificar se o segmento de 111 pb que sofre Variantes A e B está sob seleção positiva, analisou-se 25
Splicing Alternativo nas
seqüências de proteína do gene de diversos tetrápodas. Os resultados de LRTs para seleção positiva estão descritos na
Dpr1
Tabela 5. Com exceção do teste M0-M3, nenhum outro teste confirmou a hipótese de que o gene
mais
Dpr1 estava sob seleção positiva. Contudo, este resultado não foi observado nos testes
estringentes como as comparações feitas em M1a–M2a e M7–M8. Este tipo de discrepância, entre o resultado obtido significativamente na comparação M0–M3 em relação aos outros testes, já foi observado em outros estudos (ver Anisimova
resultado ocorre porque a comparação dos modelos M0–M3 é um teste variabilidade de pressão seletiva entre os sítios do que a seleção
et al., que
2001). Este avalia mais a positiva, e deve-se ter cuidado quando apenas a comparação M0-M3 sugere seleção positiva (Anisimova et al., 2001; Yang
hipótese de método
et al., que
2000). Portanto, as evidências estatísticas disponíveis não suportam a ocorra seleção positiva ao longo da evolução dos
NEB identificou sete resíduos, todos eles na região do exon (Tabela 6). Embora não significativa, a existência de tantos
Dpr1.
quatro,
No entanto, o com valor de
Z >1 resíduos com
uma região de seleção relaxada. Resultados semelhantes a este
Z >1 pode obtidos
indicar foram
quando uma amostra maior foi usada para estimar os parâmetros de seleção positiva para cada exon separadamente (Tabela 7). Recentemente, foi sugerido que o processo de
Splicing
que o
Alternativo é usado como um “ testing ground da seleção
” para a evolução molecular, uma vez que
& Lee,
Splicing reduz a intensidade purificadora (Ermakova et al,. 2006; Xing 2005), mesmo levando a uma seleção positiva (Ramensky et al., 2008). Assim, os
valores estimados de a hipótese de que
Z , bem como a presença de resíduos com valores de Z >1, corroboram o exon 4 está sob uma seleção purificadora relaxada. Um melhor entendimento da função das diferentes Variantes do gene Dpr1 provavelmente contribuiria para elucidação do significado adaptativo ao longo da evolução desse exon.
Tabela 5. Resultados de LRTs para seleção positiva.
Modelo (número de Parâmetros estimados Verossimilhança parâmetros livres na distribuição Z ) p M0: uma taxa Z = 0.13580 570.62 <<0.01 M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a; seleção positiva (3)
M7: beta (2) p 0 =0.46, ( p 1 =0.36), ( p 2 =0.18), Z 0 =0.02, Z 1 =0.18, ( Z 2 =0.52) p 0 =0.80, ( p p 1 =0.20), ( Z 0 =0.09), 0 1 (Z 1 =1) p 0 =0.80, ( 1 =0.16), ( p 2 =0.04), 0.28 0.991068388 Z 0 =0.09, Z 1 =1, ( Z 2 =1) P =0.55, q =2.64 M8: beta& Z (4) p 0 =0.999, ( p 1 =0.001), p =0.56, q=2.68, Z =5.49
Tabela 6. Sítio onde a taxa dN/dS foi maior que as baseadas no Naive Empirical Bayes (Yang et al. 2005).
Resíduo Pr(Z >1) Média Posterior Z ± SE
434 A 0.796 1.33 ± 0.34 461 T 0.511 1.05 ± 0.48 519 N 0.541 1.11 ± 0.44 611 T 0.610 1.17 ± 0.42 648 V 0.501 1.06 ± 0.46 652 P 0.852 1.38 ± 0.28 656 G 0.612 1.17 ± 0.43
As posições indicadas são baseadas no alinhamento múltiplo da proteína completa de diversos vertebrados; para o estudo usamos a espécie humana como referência.
59
Tabela 7. Resultado das análises de Verossimilhança Máxima do gene modelos.
Conjunto Modelo (número de Parâmetros estimados
Dpr1 utilizando vários
Verossimilhança de dados parâmetros livres na
distribuição Z)
p
Gene M0: uma taxa completo Z = 0.13580 -15523.168829 <<0.01 M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a: seleção positiva (3) M7: beta (2) p 0 =0.46, (p 1 =0.36), (p 2 =0.18), Z 0 =0.02, Z 1 =0.18, (Z2 =0.52) -15237.862691 -15339.205229 1 -15339.205230 -15239.166881 0.99 -15239.034685 -2637.437298 <<0.01 -2582.362323 -2608.697340 1 -2608.697340 -2582.459379 0.23 -2581.012514 -898.370114 <<0.01 -900.464979 -903.201101 1 -904.063987 -901.402635 1 -901.403073 -860.141883 <<0.01 -845.609966 -848.815922 1 -848.815922 -846.925385 1 -846.925574 -18305.206819 <<0.01 -17835.275927 -17993.635006 1 -17993.635006 -17835.540127 1 -17835.546417 p 0 =0.80, (p p 1 1 =0.20), ( =0.16), ( Z0 =0.09), ( Z1=1) p 0 =0.80, ( p 2 =0.04), Z 0 =0.09, Z 1 =1, (Z2=1) P =0.55, q =2.64 M8: beta& Exon 1 Z (4) p 0 =0.999, (p 1 =0.001), p =0.56, q=2.68, Z=5.49 M0: uma taxa M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a: seleção positiva (3) M7: beta (2) Z = 0.06270 p 0 =0.27, (p 1 =0.54), (p 2 =0.19), Z 0 =0.004, Z1=0.05, (Z 2 =0.29) p 0 =0.87, (p 1 =0.13), (Z0 =0.04), ( Z1=1) p 0 =0., (p 1=0.), (p 2=0.), Z0=0., Z 1 =1, (Z2=1) P =0.56, q =6.25 M8: beta& Exon 2 Z (4) p 0 =0.97, (p 1 =0.03), p =0.66 q=9.47, Z=1 M0: uma taxa M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a: seleção positiva (3) M7: beta (2) Z = 0.004 p 0 =0.33, (p 1 =0.37), (p 2 =0.30), Z 0 =0.004, Z1=0.004, (Z 2 =0.03) p 0 =0.999, (p 1 =0.001), (Z 0 =0.01), ( Z1=1) p 0 =1, (p 1=0), (p 2 =0), Z 0 =0.012, Z 1 =1, (Z2=1) P =0.62, q =42.44 M8: beta& Exon 3 Z (4) p 0 =0.999, (p 1 =0.001), p =0.62 q=42.44, Z=2.24 M0: uma taxa M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a: seleção positiva (3) M7: beta (2) Z = 0.06 p 0 =0.30, (p 1 =0.60), (p 2 =0.10), Z 0 =0, Z1 =0.04, (Z2=0.45) p 0 =0.92, (p p 1 1 =0.08), ( =0.02), ( Z0 =0.03), ( Z1=1) p 0 =0.92, ( p 2 =0.06), Z 0 =0.03, Z 1 =1, (Z2=1) P =0.30, q =3.64 M8: beta& Exon 4 Z (4) p 0 =0.999, (p 1 =0.001), p =0.30 q=3.64., Z=1 M0: uma taxa M3: discreto (5) M1a: aproximadamente neutra (1)
M2a: seleção positiva (3) M7: beta (2) Z = 0.16150 p 0 =0.27, (p 1 =0.43), (p 2 =0.29), Z 0 =0.01, Z 1 =0.11, (Z2 =0.50) p 0 =0.75, (p p 1 1 =0.25), ( =0.12), ( Z0 =0.09), ( Z1=1) p 0 =0.75, ( p 2 =0.13), Z 0 =0.09, Z 1 =1, (Z2=1) P =0.54, q =2.13 M8: beta& Z (4) p 0 =0.999, (p 1 =0.001), p =0.54 q=2.12, Z=10.64
Os valores de p correspondem a comparações entre os modelos em linhas consecutivas (exemplo M0 e M3, M1a e M2a, M7 e M8).
sobrepostos, embora em alguns estádios do desenvolvimento algumas estruturas (somitos e 1° e 2° arcos branquiais) expressem apenas uma das Variantes, o que indica que cada Variante está envolvida em processos de desenvolvimento diferentes.
61
1) O gene Dpr1 apresenta uma estrutura composta por quatro exons e três introns, que tem sido conservada ao longo da evolução.
2) Uma organização em mosaico, caracterizada por segmentos conservados entremeados por segmento variáveis, foi identificada para o gene
3) Dados de Bioinformática indicam a existência de
Dpr1 de vertebrados.
pelo menos quatro transcritos Alternativo do exon 3 (Variantes A e B), um distintos do gene
transcrito
Dpr1: dois gerados por Splicing
contendo primeiro exon alternativo e um transcrito possível papel regulatório.
4) As Variantes A e B, utilizadas para validar os
antisense
dados de
não codificador, com
Bioinformática, são expressas em embriões de todos os vertebrados analisados, com exceção do peixe.
5) As Variantes A e B são co-expressas ao longo do desenvolvimento embrionário de galinha, desde as fases iniciais da embriogênese até a organogênese.
6) Através de ensaios de hibridação possuem diversos sítios de expressão
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67
Anexo 1
Seqüências de RNAm Local de Expressão AK077691.1 Embrião Inteiro
AY208970.1 - BC052999.1 - AK211711.1 - AK204986.1 - AK204602.1 - AK203624.1 - AK202290.1 - AK201819.1 - AK201353.1 - AK199966.1 - AK199378.1 - AK196965 - AK196944.1 - AK196313.1 - AK195262.1 - AK195073.1 - AK194983.1 - AK193552.1 - AK193421.1 - AK190904.1 - AK190768.1 - AK189582.1 - AK189345.1 - AK183699.1 - AK181949.1 - AF251078.1 - AF251078.1 Timo
Seqüências de EST Local de Expressão BY008683.1 Medula Espinhal
BY152134.1 Pele
BY152390.1 Pele
BY420719.1 Sistema Urinário BY441051.1 Sistema Urinário
BY475215.1 Pele BY475492.1 Pele BY477072.1 Pele BY477482.1 Pele BY477927.1 Pele BY518836.1 Timo BY518900.1 Timo
BY670564.1 Tecido Embriônico CA979541.1 Embrião inteiro CB055376.1 Sistema Endócrino BX527307.1 Embrião Inteiro
CK332856.1 Tecido não caracterizado CK330463.1 Tecido não caracterizado
CK626213.1 Olho CX734109.1 Olho CJ131606.1 Pele CJ265251.1 Pele W13677.1 Embrião inteiro W35019.1 Embrião inteiro AA049642.1 Embrião inteiro
AA122747.1 Baço
AA245418.1 Embrião inteiro
AA855352.1 Coração
AI115603.1 Tecido Embriônico
AI120800.1 Glândulas Mamárias AI414235.1 Embrião inteiro AI414714.1 Embrião inteiro
69
AI462281.1 Glândulas Mamárias AI536296.1 Embrião Inteiro
AI558011.1 Coração
AI586255.1 Baço
AV133243.1 Embrião inteiro AV138118.1 Embrião inteiro
AV139986.1 Embrião inteiro AV145461.1 Embrião inteiro AV165915.1 Coração e pescoço AW046534.1 Embrião inteiro AW047356.1 Embrião inteiro AW047814.1 Embrião inteiro AV304964.2 Embrião inteiro AV305877.1 Embrião inteiro AV364657.1 Genitália feminina
BB014556.1 Testículos BB048018.1 Cérebro BB101150.1 Embrião inteiro BB113374.1 Sistema Urinário BB113403.1 Sistema Urinário BB138243.1 Ossos BB423881.1 Medula Espinhal BE370460.1 Pulmão
BB459285.1 Raíz do gânglio dorsal
BB462386.1 Raíz do gânglio dorsal BB463309.1 Raíz do gânglio dorsal
BE627511.1 Timo
BE630654.1 Timo
BE632769.1 Baço
BE864617.1 Embrião inteiro BE864950.1 Embrião inteiro
AW743832.1 Ossos BB089624.1 Embrião inteiro BE952137.1 Olhos BF464249.1 Olhos BF468449.1 Olhos BG147385.1 Baço BI408232.1 Pulmão BB619302.1 Embrião inteiro BB766435.1 Pele BB762562.1 Pele BB762714.1 Pele BB763069.1 Pele BB770154.1 Pele BB772364.1 Pele BB871010.1 Embrião inteiro BM117184.2 Embrião inteiro BB857405.1 Pele BB799914.1 Medula Espinhal BG802450.1 Olhos BG802460.1 Olhos BQ042301.1 Embrião inteiro BQ044559.1 Embrião inteiro BQ177266.1 Embrião inteiro BQ179182.1 Embrião inteiro BQ555903.1 Embrião inteiro BQ555904.1 Embrião inteiro BB677135.1 Coração e Pescoço BQ964054.1 Membros
BU057721.1 Embrião inteiro BU610723.1 Embrião inteiro